CN112553171A - 一种弧菌噬菌体制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种弧菌噬菌体制剂及其应用，该噬菌体制剂是由非典型弧菌（Vibrio atypicus）噬菌体Vibrio phage vB_VatS‑XSL01与辅料混合而成，其总噬菌体有效量≥106 PFU/mL；该噬菌体是从海水养殖水体中分离出的，对鲍体内多种致病弧菌具有烈性毒性，可以在非典型弧菌（Vibrio atypicus）侵染稚鲍过程中有效降低稚鲍死亡率并提高稚鲍摄食率；本发明提供的噬菌体制剂具有较广的杀菌性，作用时间快，效果持久稳定；噬菌体分离自养殖场环境，其自身由蛋白质和核酸组成，个别辅助试剂也均属于无毒无害化学物，不会对养殖生物和环境产生影响，无毒无害，安全环保。

Description

一种弧菌噬菌体制剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别是一种弧菌噬菌体制剂及其应用。
背景技术
水产养殖业是我国重要的农业活动之一，2019年全国水产养殖总经济产值可达2.6万亿。水产养殖活动能够为全国提供优质的食粮，总蛋白贡献约为30%；为工业发展提供大量原料，涉及医药、化工、饲料等；同时能够大量弥补海洋捕捞，有利于维持环境生态平衡。
在水环境中，除了贝、鱼、海藻等大型生物外，还生活着大量肉眼不可见的微生物（粒径在20 μm以下）。微生物与水产养殖息息相关，其中微生物病害是水产养殖的重要灾害之一。2010年因微生物引发的病害涉及95个品种（王东石和高锦宇, 2015）；1997年山东沿海栉孔扇贝大量死亡与细菌病原体相关（杨晓岩等, 1998）；1996-1997年，大连连续突发大面积的海湾扇贝死亡灾害，弧菌是其主要病原菌。
其中，弧菌病已经成为水产养殖业病害的最主要拦路虎，甚至达到“谈弧色变”的程度。弧菌在水产养殖中是长期存在的，将弧菌控制在一定的数量内是不需要处理的，但如果受到环境、水草、有害菌的影响就会加大弧菌的繁殖量，非典型弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌等会迅速繁殖，污染水体，侵害养殖生物。
如何防治弧菌病害，一直是水产研究的重点。在20世纪40年代以后，抗生素疗法日渐盛行。但后期由于抗生素的广泛使用、滥用和过度使用，耐药细菌菌株（包括多耐药菌株）大量出现与流行，抗生素治疗效果受到严峻的挑战。近年来出现了一些“超级病菌”，它们几乎对所有的抗生素都不敏感，导致人类和动物对此类细菌的感染几乎无药可用，因此非常迫切需要新的抗感染武器来替代抗生素。在此背景下，人类把目光投向了噬菌体治疗。噬菌体是细菌的天敌,也就是“吃细菌的病毒”，噬菌体疗法就是针对性的利用病毒株对细菌进行侵染并裂解。噬菌体有严格的宿主特异性，不会感染其他种属的生物（包括养殖生物），所以不会对除了其侵染对象以外的其他生物死亡，因此具有专一性和安全性。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明的目的之一是提供一种噬菌体制剂。目的之二是提供一种该噬菌体制剂的应用。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案为：一种噬菌体制剂，其特征在于，其活性成分包括以下菌种：保藏编号为CCTCC M 2020729的非典型弧菌（Vibrio atypicus）噬菌体。
进一步的，还包括辅料，其中总噬菌体有效量≥106 PFU/mL。
进一步的，所述辅料为SM缓冲液、无菌海水、海水富集培养基的一种或多种。
进一步的，所述SM缓冲液是指10 mM Tris–HCl，100 mM NaCl，10 mM MgSO4，pH7.8，加入纯净水补足至1000mL。
进一步的，所述海水富集培养基是指在1L天然海水中添加4 g蛋白胨、1 g酵母膏和1 g醋酸钠，然后经过121℃高压灭菌20 min后冷却，pH为7.8。
上述一种噬菌体制剂的应用，将该噬菌体制剂应用到防治稚鲍死亡中。
进一步的，所述稚鲍的死亡是由非典型弧菌（Vibrio atypicus）感染所导致的死亡。
上述一种噬菌体制剂的应用，将该噬菌体制剂应用到水环境中对非典型弧菌（Vibrio atypicus）进行杀灭。
进一步的，将该噬菌体制剂应用到水环境中对非典型弧菌（Vibrio atypicus）进行杀灭的终浓度为106 PFU/mL。
本发明的有益效果在于：
（1）采用该噬菌体制剂特异性杀灭能够导致稚鲍大量死亡的非典型弧菌（Vibrio atypicus），而且该噬菌体能够侵染其他6种弧菌，宿主范围相对较广，具有有效的应用价值。
（2）该噬菌体效果持久稳定，且其分离自养殖场环境，个别辅助试剂也均属于无毒无害化学物，不会对养殖生物和环境产生影响，无毒无害，安全环保。
（3）该噬菌体制剂对非典型弧菌（Vibrio atypicus）具有迅速且持久的杀灭效果，而且能够显著提高侵染后鲍的摄食量和存活率，因此可以作为药物应用于该弧菌引发的稚鲍死亡。
附图说明
图1 实施例噬菌体制剂vB_VatS-XSL01的噬斑示意图。
图2 非典型弧菌（Vibrio atypicus）噬菌体的投射电镜照片。
图3实施例噬菌体制剂vB_VatS-XSL01的杀菌效果实验结果示意图。
图4实施例噬菌体制剂vB_VatS-XSL01的稚鲍侵染实验存活率示意图。
图5 实施例噬菌体制剂vB_VatS-XSL01的稚鲍侵染实验摄食量示意图。
具体实施方法
下面结合附图及实施例对该弧菌噬菌体制剂及其应用做详细描述。
SM缓冲液的配置：
10 mM Tris–HCl，100 mM NaCl，10 mM MgSO4，pH 7.8，加入纯净水补足至1000mL。
无菌海水的配置：
将天然海水经过121℃高压灭菌20 min后冷却。
海水富集培养基的配置：
在1L天然海水中添加4 g蛋白胨、1 g酵母膏和1 g醋酸钠，然后经过121℃高压灭菌20 min后冷却，pH为7.8。
噬菌体分离与纯化：
以发病稚鲍为对象，采用TCBS培养基进行划线纯化，后采用菌株溶血平板挑选溶血性活性的疑似致病菌；采用16S测序鉴定分离株的分类学地位；在已分离疑似致病菌非典型弧菌（Vibrio atypicus）的基础上，采用双层平板法（下层为添加了含有1.5%（w/w）琼脂的海水富集培养基固体平板，上层为添加了1mL海水、1mL细菌培养液和5mL含0.5%（w/w）琼脂的海水富集培养基半固体平板）从天然海水分离噬菌体1株，并继续采用双层平板法对噬菌体进行了纯化，其双层平板照片如图1所示。
噬菌体扩增与保存：
纯化后的噬菌体，添加到处于对数期的宿主培养液中进行扩大培养（28℃，160rmp震荡培养），并采用多次离心（12000 rmp，5min）获得病毒上清；然后添加终浓度为10%的PEG8000和终浓度为1%的 NaCl，4℃沉淀12h后，离心（1000g，30min，4℃）获得沉淀；去除上清，加入适当体积的SM缓冲液以及适量体积的氯仿；取富含噬菌体的液体，保存在4℃和-80℃冰箱中。
噬菌体电镜查看：
非典型弧菌（Vibrio atypicus）噬菌体自命名为vB_VatS-XSL01，其电镜照片如图2所示，该噬菌体具有呈现多面体的头部和较长的尾部，属于长尾科噬菌体。
申请人将非典型弧菌（Vibrio atypicus）噬菌体保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为：CCTCC M 2020729，保藏日期为：2020.11.12，保藏地址为：中国武汉市武汉大学，邮编：430072，分类命名为非典型弧菌（Vibrio atypicus）噬菌体Vibrio phagevB_VatS-XSL01。
噬菌体制剂vB_VatS-XSL01的制备：
取实施例1中获得噬菌体，采用双层平板法检测其效价，应大于109PFU/mL，使用SM缓冲液进行稀释，制剂中噬菌体效价应≥106 PFU/mL。
噬菌体制剂vB_VatS-XSL01的制备：
取实施例1中获得噬菌体，采用双层平板法检测其效价，应大于109PFU/mL，使用SM缓冲液进行稀释，制剂中噬菌体效价应≥106 PFU/mL。
在实际操作过程中，还可以向噬菌体浓缩中加入无菌海水、海水富集培养基的一种或多种，只要保证总含量≥106 PFU/mL，均可以实现本发明目的。
噬菌体制剂vB_VatS-XSL01的宿主范围分析：
取从致病鲍体内分离的菌株15株，将其复苏和培养，取对数期细菌1mL，加入浓度为0.5%琼脂的45℃海水富集培养基，混匀后倒在海水富集培养基固体平板上，待其干燥后，取10 μL噬菌体制剂点样于菌苔上，并以天然海水点样作为对照，28℃培养12h后观察实验结果。结果如表1所示。由表1 可见，噬菌体制剂vB_VatS-XSL01对包括分离宿主在内的7种弧菌具有致病性，表明噬菌体制剂vB_VatS-XSL01可以作为广谱噬菌体制剂。
表1 噬菌体制剂XS-L01的杀菌谱
细菌编号 分类地位 分离地 侵染性 菌种来源
15 非典型弧菌 病鲍体内 + 实验室分离
Y1 非典型弧菌 病鲍体内 + 实验室分离
Y2 非典型弧菌 病鲍体内 + 实验室分离
Y4 非典型弧菌 病鲍体内 + 实验室分离
Y7 非典型弧菌 病鲍体内 + 实验室分离
♀6 副溶藻弧菌 病鲍体内 + 实验室分离
C5 副溶藻弧菌 病鲍体内 + 实验室分离
C2 副溶藻弧菌 病鲍体内 - 实验室分离
C3 副溶藻弧菌 病鲍体内 - 实验室分离
C6 副溶藻弧菌 病鲍体内 - 实验室分离
♀1 副溶血弧菌 病鲍体内 - 实验室分离
♀3 副溶血弧菌 病鲍体内 - 实验室分离
♀5 副溶血弧菌 病鲍体内 - 实验室分离
♂2 副溶血弧菌 病鲍体内 - 实验室分离
♂3 副溶血弧菌 病鲍体内 - 实验室分离
注：+代表能够形成明显噬斑，即有侵染性；-代表不能形成明显噬斑，即无侵染性。
噬菌体制剂vB_VatS-XSL01的实验室杀菌效果：
将终浓度为106 PFU/mL的噬菌体XS-L01添加到处于对数培养期的非典型弧菌（Vibrio atypicus）培养基上，在41 min左右出现明显裂解现象，在3h左右裂解比例达到95%以上，具体见附图3所示，图中XS-L01代表噬菌体制剂添加组， Control代表对照组。
将终浓度分别为0、105、106、107、108、109 PFU/mL的噬菌体添加到对数培养期的非典型弧菌（Vibrio atypicus）培养基上，其对应感染复数分别为0、0.1、1、10、100、1000，除了未添加组，均能够产生明显的裂解效果，106、107、108、109 PFU/mL实验组差异不显著，均可以达到95%以上的裂解量，但106PFU/mL实验组的裂解效果要显著高于105 PFU/mL实验组。
噬菌体制剂vB_VatS-XSL01的稚鲍侵染实验：
取平均规格为3cm左右的稚鲍，开展以噬菌体为主的生物疗法探究。本次试验共分为暂养阶段（7 d）、提前免疫阶段（10 d）、活菌添加阶段（14d，开始添加非典型弧菌Vibrio atypicus）、后续观察阶段（10 d，停止添加非典型弧菌Vibrio atypicus）共4个时期，操作温度为12-14℃，采用流水饲养（砂滤后海水），每天下午投喂适量新鲜海带，上午添加处理，添加时，统一停水2 h。处理组为噬菌体制剂添加组、抗生素添加组和对照组，每个处理组各3个平行。其中噬菌体添加组在免疫阶段即开始添加实施案例2制备的噬菌体制剂XS-L01，抗生素添加组在活菌添加阶段开始添加土霉素（前提实验证明，土霉素对非典型弧菌Vibrio atypicus致死），对照组则无添加。因为本实验采用流水养殖，在添加试剂后，所有实验组均停水1h，然后统一通流水。
在暂养期内，各处理组的死亡量未纳入统计；在免疫期内，无鲍死亡；在活菌添加期，对照组的死亡率最大（13.33%），噬菌体免疫组的死亡率最低（1.67%），抗生素添加组的死亡率居中（6.67%）；在后续观察期，对照组持续死亡，至42d，其死亡率达到43.33%，而噬菌体免疫组的死亡量最低（5.00%），抗生素添加组继续居中（10.00%），具体见附图4所示，图中，Phage代表噬菌体制剂添加组，Antibiotics代表抗生素添加组，Control代表对照组。
实验期间，每2-3天统计各处理组鲍的摄食量。在暂养期内，各处理组的摄食量差异不显著；在免疫期内，各处理组的变化趋势不显著；在活菌添加期，18 d（添加活菌后第2天）各处理组的摄食量均显著降低，20 d后有所恢复，其中噬菌体免疫组的摄食量相对最高，对照组相对最低，抗生素添加组差异不显著；在后续观察期，噬菌体免疫组的摄食量保持较高，对照组则持续降低，抗生素添加组在35d（暂养期第2天）与噬菌体免疫组相仿，后期显著低于噬菌体免疫组并显著高于对照组，具体见附图5所示，图中Phage代表噬菌体制剂添加组，Antibiotics代表抗生素添加组，Control代表对照组。
以上仅为本发明的集中实施例，本发明获得的噬菌体制剂vB_VatS-XSL01还适用于其他6种弧菌引发的鲍死亡治疗和预防，同时也可以作为免疫制剂长期在稚鲍养殖车间使用。

Claims (8)

1.一种噬菌体制剂，其特征在于，其活性成分包括以下菌种：保藏编号为CCTCC M2020729的非典型弧菌（Vibrio atypicus）噬菌体vB_VatS-XSL01。
2.根据权利要求1所述的一种噬菌体制剂，其特征在于，还包括辅料，其中总噬菌体有效量≥106 PFU/mL。
3.根据权利要求2所述的一种噬菌体制剂，其特征在于，所述辅料为SM缓冲液、无菌海水、海水富集培养基的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的一种噬菌体制剂，其特征在于，所述SM缓冲液是指10 mMTris–HCl，100 mM NaCl，10 mM MgSO4，pH 7.8，加入纯净水补足至1000mL。
5.根据权利要求3所述的一种噬菌体制剂，其特征在于，所述海水富集培养基是指在1L天然海水中添加4 g蛋白胨、1 g酵母膏和1 g醋酸钠，然后经过121℃高压灭菌20 min后冷却，pH为7.8。
6.一种权利要求1、2或3所述的噬菌体制剂的应用，其特征在于：将该噬菌体制剂应用到防治稚鲍死亡中。
7.根据权利要求4所述的噬菌体制剂的应用，其特征在于，所述稚鲍的死亡是由非典型弧菌（Vibrio atypicus）感染所导致的死亡。
8.一种权利要求1、2或3所述的噬菌体制剂的应用，其特征在于：将该噬菌体制剂应用到水环境中对非典型弧菌（Vibrio atypicus）进行杀灭。
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