CN112545915A - 一种具有优异保湿及修复功效的面膜 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种具有优异保湿及修复功效的面膜，其组分包括多肽、保湿剂，所述多肽是由氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的小分子活力蛋白肽与如SEQ ID NO:3所示的小分子穿膜肽混合而成的混合活性蛋白肽。本发明面膜配方中复配了TAT‑EL混合活性蛋白肽：代替组织/胶原/毛细血管接受自由基的进攻，从而起到保护毛细血管及胶原蛋白的作用；具有优异的促进细胞增殖分化、加速肌肤表皮细胞的自我更新和自我修复，对于受损痘肌/医美创伤修复具有良好的效果。本发明采用的乙酰化透明质酸作为保湿剂之一，增强了其溶解性、渗透性以及对透明质酸酶的抵抗性；乙酰化透明质酸是两亲性的，既能溶于水，也能溶于油，能够以细胞间质为载体，渗透到肌肤的基底层，发挥保湿功效。

Description

一种具有优异保湿及修复功效的面膜

技术领域

本发明涉及面膜及其制备方法，具体涉及一种具有优异修复功能的面膜及其制备方法。

背景技术

高档面膜中通常会添加多肽，面膜中的肽有细胞的更新、代谢、生长、修复等作用。表皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor)简称EGF，是人体内分泌的一种重要细胞生长因子，有很强的生理活性，但EGF在医药以及化妆品领域并未得到广泛的应用，其原因EGF难以实现批量化生产：现目前EGF的提取方式主要分为两种，一种是动物来源，如小鼠下颌、牛脑等，另外一种则是从干细胞的培养上清液中提取，两种方法所得到的EGF的含量都十分的微小，成本极高。另外，通常的EGF的分子量大概为6000道尔顿，分子量较大，对肌肤的穿透力较差，其功效难以充分发挥。

发明内容

本发明目的在于提供一种具有优异修复及保湿性能的面膜。

本发明目的按如下技术方案实现：

一种具有优异保湿及修复功效的面膜，其组分包括多肽、保湿剂，其特征在于：所述多肽为小分子活力蛋白肽、其由至少含有一个如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码而成。

优选地，一种面膜，其组分包括多肽、保湿剂，其特征在于：所述多肽为小分子活力蛋白肽、其由如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码而成。

上述小分子活力蛋白肽(简称EL)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步优选地，上述面膜中所含多肽，是由上述小分子活力蛋白肽与如SEQ IDNO:3所示的小分子穿膜肽(简称TAT小分子穿膜肽)混合而成的混合活性蛋白肽(简称TAT-EL)。所述TAT小分子穿膜肽购自肽源企业管理(广州)有限公司，为市售产品。该TAT小分子穿膜肽是一种分子量极小的多肽类物质，表面带正电荷，具有很好的亲肤性，可携带蛋白质大分子，活性肽，化学药物等，通过细胞间质，细胞膜，毛孔，毛囊等途径，实现活性肽的透皮吸收，解决了大分子肽难以被皮肤吸收的问题，它与本发明活力蛋白肽起到协同增效的作用、更利于皮肤的穿透与吸收。

进一步，上述小分子活力蛋白肽与所述小分子穿膜肽混合的质量比为1:4。

本发明通过体外基因蛋白重组技术，将活力蛋白肽的基因片段嫁接到遗传信息载体上，移植到基因工程菌大肠杆菌DH5a菌株中，通过密度发酵、蛋白质分离纯化、冷冻干燥，制得了本发明活力肽蛋白，并能保证其活性在冻干状态下3 年不降低。经细胞实验及人体临床测试实验，该蛋白肽对于痘肌修复及医美术后修复具有优良的效果。本发明活力肽安全性较高，经过微生物检测、重金属含量检测、细胞实验、安全性得到有效认证；工艺经验证可行，并可以进行批量化生产。

进一步优选地，一种面膜，其特征在于，由以下成分混合而成、以质量百分含量计：

A组份：水25％，甘油5％，丁二醇2％，黄原胶5％，尿囊素4％，羟乙基纤维素2％；

B组份：丁二醇1％，乙酰化透明质酸10％，水解透明质酸钠13％；

C组份：对羟基苯乙酮1％，丁二醇1％；

D组份：由质量比1:1:1:1混合的库拉索芦荟(ALOE BARBADENSIS)叶汁、丙二醇、苯氧乙醇、乙基己基甘油占8％，甜菜碱2％，由质量比1:1混合的聚谷氨酸钠、丁二醇占1％，由质量比2:1混合的1,2-己二醇、芍药(PAEONIA ALBIFLORA)根提取物占7％，1,2-己二醇1％，由质量比1:1:4:1混合的海藻糖、乙酰基六肽-8、本发明多肽、磷酸二氢钠占10％；

E组份：由质量比1:1:1混合的水、丁二醇、桃(PRUNUS PERSICA)花水占2％。

上述面膜的制备方法，按如下步骤：

1、A组份原料加入到搅拌锅，升温至80-85℃，搅拌25-35rpm，溶解均匀，保温15～20min；

2、降温到70度加入B组份原料(预先溶解透明)，搅拌25-30rpm，溶解均匀；

3、降温到60度加入C、D组份原料(预先溶解透明)，搅拌25-30rpm，溶解均匀；

4、降温到45度加入E组份原料，搅拌25-30rpm，溶解均匀；

5、继续冷却至37-40℃制得面膜液。

本发明具有如下有益效果：

现在市面上所用的同类保湿剂通常为透明质酸、透明质酸钠、水解透明质酸等，同类保湿剂存在一些客观缺陷：①是水溶性成分，而非油溶性成分，很难到达肌肤的底层发挥作用；②透明质酸很容易被皮肤里的透明质酸钠所降解。本发明采用的乙酰化透明质酸作为保湿剂之一，乙酰化透明质酸是将透明质酸结构中的羟基，通过化学合成手段转化成了酰基，从而增强了其溶解性、渗透性以及对透明质酸酶的抵抗性。乙酰化透明质酸是两亲性的，既能溶于水，也能溶于油，能够以细胞间质为载体，渗透到肌肤的基底层，发挥保湿功效；乙酰化透明质酸抗玻尿酸酶的能力为普通透明质酸的13倍，意味着完全乙酰化透明质酸在肌肤底层发挥作用的时间更持久，更长效。

本发明面膜配方中复配了TAT-EL混合活性蛋白肽(本发明小分子活力蛋白肽TAT与所述小分子穿膜肽EL的混合蛋白肽)：①代替组织/胶原/毛细血管接受自由基的进攻，从而起到保护毛细血管及胶原蛋白的作用；②具有优异的促进细胞增殖分化、加速肌肤表皮细胞的自我更新和自我修复，因此对于受损痘肌 /医美创伤修复具有良好的效果。

本发明面膜配方中复配了乙酰基六肽-8：乙酰基六肽-8是SNAP-25的N 末端模拟物，可以与SNARE复合物中的天然蛋白质竞争位置，无需破坏复合物的任何成分便可破坏其形成的稳定性。当SNARE复合物变得略微不稳定时，囊泡就不能有效释放神经递质。结果，肌肉得到松弛而不产生麻痹，细纹和皱纹形成减少。乙酰基六肽-8作用的蛋白质复合物与肉毒杆菌毒素A相同，调节肌肉收缩。因此，这种原料是一种安全的活性物，它已经被证实体内具有破坏 SNARE复合物的稳定，减少皱纹形成，将现有皱纹和表情纹的深度、体积和长度及皮肤粗糙度减至最低的功效。乙酰基六肽-8属于市售产品，厂家为路博润。

本发明面膜配方中还复配了多种天然植物成分：芍药根提取物：天然抑菌剂，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，痤疮丙酸杆菌具有良好的抑制效果，有效防止肌肤长痘；库拉索芦荟叶汁：提高纤维原细胞的活性和繁殖速度，从而促进伤口愈合。

附图说明

图1：为本发明活力蛋白肽的工艺制备流程图。

图2：为采用本发明活力肽与TAT小分子穿膜肽组成的混合活性蛋白肽(简称 TAT-EL)对人体临床痘肌修复功效图。其中，左图为修复前示意图、右图为修复后示意图。具体使用的是1000U活力单位的TAT-EL混合活性蛋白肽，溶解在 4ml的溶媒中形成的精华液使用。

图3：本发明TAT-EL混合活性蛋白肽促细胞增殖实验结果图。

图4：本发明TAT-EL混合活性蛋白肽对医美创伤修复实验结果图。

图5：本发明TAT-EL混合活性蛋白肽与TAT-EGF混合活性蛋白肽穿透皮肤实验对比结果图。

具体实施方式

实施例1：目的DNA的获得

(1)目的基因的基因序列为：

以5’—GCAAGCGCATTGCACATGTACGGCTATAGCAGATA—3’(SEQ ID NO:1)以目的基因转录的信使RNA为模板,反转录成互补的单链DNA,再在T4DNA连接酶的作用下合成双链DNA,即目的基因。

(2)PCR扩增

变性：高温使双链DNA离解成单链(94℃，30s)；

退火：低温下引物(pACT2 GAL4 AD pACT2-R)与模板DNA互补区结合形成杂交分子(55℃，30s)；

延伸：中温延伸，在DNA聚合酶、dNTP、Mg²⁺存在下，DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链5’向3’方向的延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链 (70-72℃，30-60s)；

以上三个步骤为一循环,每一循环的产物均可作为下一循环的模板,经过n次循环后,目的DNA以2ⁿ形式增加，n≥1、优选为n＝30-35。

实施例2：电泳检测及回收纯化

(1)电泳

①配制适量的电泳及制胶用的缓冲液(1X TAE Buffer)

②根据制胶量和凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉(1g),加入适当的锥形瓶中。

③加入一定量的电泳缓冲液(1X TAE Buffer 100ml)。

④熔化完全，冷却至60℃左右，加入EB5-7ul，充分混匀。

⑤将溶液倒入制胶模中，之前应在适当位置插上梳子。

⑥室温下凝固，不立即使用时，可用保鲜膜将凝胶包好后放4℃保存。

取适量的PCR产物与适量的溴酚蓝混合混匀后加入凝胶槽中，另取适量的DNAMaker加入右边槽中，开始电泳。紫外观察电泳条带，当溴酚蓝跑到适当位置时，在紫外光下观察目的基因的电泳条带(1kb处)时，停止电泳并回收DNA。

(2)纯化

纯化设备：色析管柱(Pharmacia C column,1.6x100 cm)

填充胶体：胶体Sephacryl S-300(Pharmacia)

缓冲液：bufferA-150

主要仪器设备：赛默飞XCell4 SureLock中型胶电泳槽、霍尔斯La230系列多联发酵罐、析宇冷冻干机XY-2(普通型)。

实施例3：重组表达载体构建

选用的重组表达载体质粒载体为pBR322，重组质粒的构建包括以下步骤：

(1)由于pBR322质粒的亲本之一是pMB1质粒，故首先以pMB1为基础，引入 Rldrd19质粒的Tn3易位子，得到13.3kb的pMB3质粒；

(2)pMB3的分子量显然使得它不适合作为载体，所以要通过在EcoRI活性条件下的消化让它大部分的无用片段失去，留下来的小片段的DNA的黏性末端连接起来后就形成了pMB8质粒(2.6kb)；

(3)此时，另外一种pSC101质粒在EcoRI活性条件下消化产生了含有tetr抗性的DNA片断，这个片断和pMB8整合在一起就形成了pMB9质粒(5.3kb)。此时pMB9为ampstetr表型；

(4)pMB9已经初步具备载体的功能，为了让它更加完善，要让它具备amprtetr 性能，即在pMB9上引入pSF2124的Tn3易位子，但Tn3可以来也可以走，为了留住它，切去了Tn3中表达转位酶的基因，形成了pBR313质粒。

此后兵分两路：一路把pBR313的PstI位点除去，使之成为ampstetr表型的pBR318质粒；

(5)另一路把pBR313的EcoRII的位点切除，使之成为amprtets表形的pBR320 质粒。

由此得到了两种功能互补的质粒，这样将他们杂交就得到pBR322载体质粒。

内切酶种类：FastDigest EcoRI和BamHI限制性内切酶

目的基因的DNA用TE溶解为大约0.5μg/μl。然后依次加入5μl 10×酶切缓冲液(50mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl pH7.8，10mmol/L MgCl2，1mmol/L DTT)， 5μl DNA，2μl限制性酶(1-5μl/μg DNA)，用灭菌双蒸水补足至50μl，在振荡器上温和振荡几秒钟，然后稍稍离心(3000r/mmin)数秒，以使管壁液体集中于管底，37℃恒温水浴中孵育1小时，65℃水浴作用10分钟。PCR双酶切结束之后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体，将连接产物转化大肠杆菌DH5a。

实施例4：活力蛋白肽的获得：

(1)基因工程菌的构建：按以上获得基因工程菌大肠杆菌DH5a。

(2)高密度发酵：菌种浓度为10⁸CFU/mL，发酵温度为40-42℃，发酵时间为12-15天。

(3)蛋白质分离纯化：对发酵产物进行蛋白质分离纯化，留存分子量在 5000～7000道尔顿的蛋白肽得到本发明活力蛋白肽EL(SEQ ID NO:2)。

(4)冷冻干燥：预冻温度为5-10℃，冷冻温度为-80℃，真空度为15pa。

(5)冷冻干燥后的样品在-20℃冰箱中保存。

实施例5：活力蛋白肽的活性测试

将如SEQ ID NO:2序列所示的活力蛋白肽(简称EL)与如SEQ ID NO:3所示的小分子穿膜肽(简称TAT小分子穿膜肽)混合得到TAT-EL活力蛋白肽。

TAT-EL活力蛋白肽与酪蛋白酶会发生酶解反应，酶解为氨基酸，用甲醛测定氨基酸氮，以测试TAT-EL活力蛋白肽的活性。

一、活力测试采用的原料：

①酪蛋白酶(0.01g/ml)：称取1.0g酪蛋白，加100ml蒸馏水搅拌30min，在4℃下离心分离后，将上层清夜置于冰箱中保存，使用前稀释一定倍数；

②0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5)；

③1％TAT-EL活力蛋白肽：取1.0gTAT-EL活力蛋白肽，加100ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.5)，搅拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存；

④5％三氯醋酸(TCA)溶液。

二、实验步骤：

1、将5％TCA溶液和1％TAT-EL活力蛋白肽溶液在37℃下保温。

2、取四支15ml具塞试管，分别标上记号A1、A0、B1和B0。在A1和A0试管中各吸入0.20ml酶液，在B1和B0试管中各吸入0.40ml酶液，分别用0.2mol/L 磷酸盐缓冲液定容至2.00ml。在A0和B0试管中各吸入6.00ml5％三氯醋酸溶液，上述四支试管都置于37℃水浴中保温。

3、在各试管中吸入2.00ml 1％TAT-EL活力蛋白肽，在37℃下保温10min(准确计时)后，再向A1和B1试管中吸入6.00ml5％三氯醋酸溶液。

4、将试管从水浴中取出，在室温下放置1h，用少量上清液润湿滤纸后过滤，保留滤出液。

5、在280nm波长下，分别以A0和B0滤液为空白，测定A1和B1滤液的吸光度。

三、计算与结果

在以上实验条件下，以每分钟增加0.001吸光度定义为一个活力单位。每克酶制剂中酶活力的计算：

ΔA×1000/(t×w)酶活力单位/克酶制剂

式中，ΔA——样品与空白吸光度差值(即A1和B1的吸光值)；t——酶作用时间(本实验为10min)；w——反应中酶的用量，g。

TAT-EL混合活性蛋白肽促细胞增殖实验结果如图3所示，从图3可以看出，相同条件下，同浓度的TAT-EGF(TAT-EGF：本方案中采用的TAT小分子穿膜肽与表皮细胞生长因子EGF以质量比4:1混合而成)和TAT-EL混合活性蛋白肽促细胞增殖的效果相差不大，可见TAT-EL活力蛋白肽确实有很好的促细胞增殖效果。该实验所用细胞为HaCaT(人表皮细胞)。

实施例6：TAT-EL混合活性蛋白肽对医美创伤修复实验结果

经过医美损伤后的肌肤，涂抹相同浓度的TAT-EGF和TAT-EL混合活性蛋白肽 48小时后，创面修复效果均较好。如图4所示。

实施例7：TAT-EL混合活性蛋白肽与TAT-EGF透皮吸收对比实验

如图5所示，绿色部分为绿色荧光标记的多肽，荧光的厚度可以指示多肽到达肌肤的深度，从图5显示中我们可以看出，TAT-EL活力蛋白肽能够被肌肤吸收的量明显多于TAT-EGF，到达肌肤的深度也明显深于TAT-EGF。证明TAT小分子穿膜肽与EL活力蛋白肽起到良好的协同增效的作用。

实施例8：一种具有优异修复及保湿性能的面膜由以下成分混合而成、以质量百分含量计：

A组份：水25％，甘油5％，丁二醇2％，黄原胶5％，尿囊素4％，羟乙基纤维素2％；

B组份：丁二醇1％，乙酰化透明质酸10％，水解透明质酸钠13％；

C组份：对羟基苯乙酮1％，丁二醇1％；

D组份：由质量比1:1:1:1混合的库拉索芦荟(ALOE BARBADENSIS)叶汁、丙二醇、苯氧乙醇、乙基己基甘油占8％，甜菜碱2％，由质量比1:1混合的聚谷氨酸钠、丁二醇占1％，由质量比2:1混合的1,2-己二醇、芍药(PAEONIA ALBIFLORA)根提取物占7％，1,2-己二醇1％，由质量比1:1:4:1混合的海藻糖、乙酰基六肽-8、TAT-EL混合活性蛋白肽、磷酸二氢钠占10％；

E组份：由质量比1:1:1混合的水、丁二醇、桃(PRUNUS PERSICA)花水占2％。上述面膜的制备方法，按如下步骤：

1、A组份原料加入到搅拌锅，升温至80-85℃，搅拌25-35rpm，溶解均匀，保温15～20min；

2、降温到70度加入B组份原料(预先溶解透明)，搅拌25-30rpm，溶解均匀；

3、降温到60度加入C、D组份原料(预先溶解透明)，搅拌25-30rpm，溶解均匀；

4、降温到45度加入E组份原料，搅拌25-30rpm，溶解均匀；

5、继续冷却至37-40℃制得面膜液。

序列表

<110> 四川省恩乐生物工程有限公司

<120> 一种具有优异保湿及修复功效的面膜

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcaagcgcat tgcacatgta cggctatagc agata 35

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Ser Ala Leu His Met Tyr Gly Tyr Ser Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Pro

1 5

Claims (6)

1.一种面膜，其组分包括多肽、保湿剂，其特征在于：所述多肽为小分子活力蛋白肽、其由至少含有一个如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码而成。

2.一种面膜，其组分包括多肽、保湿剂，其特征在于：所述多肽为小分子活力蛋白肽、其由如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码而成。

3.如权利要求2所述面膜，其特征在于：所述小分子活力蛋白肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。

4.一种面膜，其组分包括多肽、保湿剂，其特征在于：所述多肽是优选由氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的小分子活力蛋白肽与如SEQ ID NO:3所示的小分子穿膜肽混合而成的混合活性蛋白肽。

5.如权利要求4所述的面膜，其特征在于：所述小分子活力蛋白肽与所述小分子穿膜肽混合的质量比为1:4。

6.一种面膜，其特征在于，由以下成分混合而成、以质量百分含量计：

A组份：水25％，甘油5％，丁二醇2％，黄原胶5％，尿囊素4％，羟乙基纤维素2％；

B组份：丁二醇1％，乙酰化透明质酸10％，水解透明质酸钠13％；

C组份：对羟基苯乙酮1％，丁二醇1％；

D组份：由质量比1:1:1:1混合的库拉索芦荟叶汁、丙二醇、苯氧乙醇、乙基己基甘油占8％，甜菜碱2％，由质量比1:1混合的聚谷氨酸钠、丁二醇占1％，由质量比2:1混合的1,2-己二醇、芍药根提取物占7％，1,2-己二醇1％，由质量比1:1:4:1混合的海藻糖、乙酰基六肽-8、由氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的小分子活力蛋白肽与如SEQ ID NO:3所示的小分子穿膜肽混合而成的混合活性蛋白肽、磷酸二氢钠占10％；

E组份：由质量比1:1:1混合的水、丁二醇、桃花水占2％。

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