CN112538511B - 一种海藻液的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种海藻液的提取方法，其特征在于，将海藻加入到水中，经酶解后，即得海藻液，所述酶是糖化酶、纤维素酶和蛋白酶；所述酶解依次是纤维素酶酶解、糖化酶酶解和蛋白酶酶解。本申请提取的海藻液水溶性好，固含量高，且海藻多糖含量高，质量稳定。

Description

一种海藻液的提取方法
技术领域
本发明涉及一种海藻液的提取方法。
背景技术
目前采用化学的方法对海藻进行提取，其对海藻的有效成份破坏极大，制备出的海藻液不能令人满意，酶具有专一性，因此采用酶提取可以减少对海藻有效成份的破坏，然而由于酶的专一性，这就使得使用单酶进行提取，存在提取产物单一，提取不完全的问题，且跟选择的酶有直接关系；采用复合酶提取，由于酶的活性受温度、pH的影响比较大，提取时也存在提取不完全的问题。使用酶联合提取，又受到酶的选择、温度、pH的影响，甚至酶的加入顺序也会影响提取产物。
目前也有使用酶联合对海藻进行提取的技术，如专利号CN 106834358 A即采用了先经纤维素酶酶解和β-葡萄糖苷酶在40-80℃，酶解后，固液分离，收集上清液；调液体pH值至5-6，在上清液中加入液化酶，50-70℃水浴加入酶解1-3天，然后用酸调节pH值至4-5，加入糖化酶，50-70℃水浴加热酶解1-2天的方法。由于酶的专一性，纤维素酶只分解β-1,4糖苷键，而海藻多糖中更多的是α-1，4-和α-1，6-糖苷键，在纤维素酶酶解过程中含有α-1，4-和α-1，6-糖苷键这部分多糖并未被酶解，依然存在于海藻残渣中，未进入到CN 106834358A中经纤维素酶酶解的上清液中，因此，虽然CN 106834358 A 进行纤维素酶酶解和糖化酶酶解，但是其糖化酶是加入到纤维素酶酶解后的上清液中的，因此存在大量的含有α-1，4-和α-1，6-糖苷键这部分多糖并未被酶解，存在提取不完全的问题。
本申请针对专利号CN 106834358 A存在提取不完全，致使海藻中大量营养物质浪费，进行改进，使提取更完全，同时，也使提取后的海藻液质量更稳定。
发明内容
本发明提供一种海藻液的提取方法，解决技术问题是1）提取海藻更完全，减少浪费，保留更多的活性物质；2）使提取的海藻液质量稳定。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
海藻液的提取方法，按照以下步骤进行：
1）酶解：将海藻、水和酶加入到容器中，在pH为4.2～6.5条件下，进行酶解，得酶解液；
2）海藻液：步骤1）所得酶解液即为海藻液，或
将酶解液进行过滤，所得滤液即为海藻液；
所述酶是糖化酶、纤维素酶和蛋白酶；
步骤1）中所述海藻、水和酶的质量比是19～39:60～80:0.001～0.5；
步骤1）所述酶解温度是26～62℃，酶解时间是12～96h。
所述酶解依次为纤维素酶酶解、糖化酶酶解和蛋白酶酶解；
所述纤维素酶酶解为将海藻、水和纤维素酶加入到容器中，在pH为5.5～6.5条件下，进行酶解，得纤维素酶解液；
所述糖化酶酶解为将糖化酶加入到纤维素酶解液中，在pH为4.0～4.5条件下，进行酶解，得糖化酶解液；
所述蛋白酶酶解为将蛋白酶加入到糖化酶解液中，在pH为6.0～7.0条件下，进行酶解，得糖化酶解液。
所述纤维素酶酶解的酶解温度为26～35℃，酶解时间为6～25h；还包括酶解后进行灭酶，灭酶温度是90～120℃，灭酶时间是2～5min；
所述糖化酶酶解的酶解温度为55～62℃，酶解时间为6～48h；还包括酶解后进行灭酶，灭酶温度是90～120℃，灭酶时间是2～5min；
所述蛋白酶酶解的酶解温度为26～35℃，酶解时间为6～48h；还包括酶解后进行灭酶，灭酶温度是90～120℃，灭酶时间是2～5min。
所述蛋白酶酶解还包括酶解前向糖化酶解液中通入氮气，至糖化酶解液中氧气含量低于0.2mg/L。
发明具有以下有益技术效果：
1.本申请避免使用化学提取的方法，既可以减少化学提取对海藻有效成份的破坏，又可以提高提取物中水溶性固含量的含量。
2.本申请通过纤维素酶溶解海藻的细胞壁，使细胞內溶物溶出，进一步采用糖化酶进行针对α-1，4-和α-1，6-配糖键进行水解，以提高提取液中海藻多糖的含量；为了进一步对海藻提取，本申请又使用了蛋白酶进行提取，然而申请人发现使用蛋白酶提取过程中存在随温度的升高以及提取时间的延长，提取液的颜色逐渐加深，且水溶性固含量降低的问题；然而选择在较低的温度进行蛋白酶酶解，提取液的颜色无明显变化，水溶性固含量未见明显降低，但是却存在了随着存贮时间的延长，提取液的颜色也存在变化，逐渐加深，且水溶性固含量降低；先进行蛋白酶酶解，则在糖化酶酶解过程中随温度的升高以及提取时间的延长，酶解液的颜色逐渐加深，且水溶性固含量降低。这就存在了使用纤维素酶、糖化酶和蛋白酶联合提取，存在了产品质量不稳定的问题。本申请通过限定蛋白酶的酶解温度以及酶解前通入氮气，可以有效防止纤维素酶、糖化酶和蛋白酶联合提取制备的提取液质量不稳定的问题。
具体实施方式
下面结合具体实例进一步说明本发明。
实施例1
海藻液的提取方法，按照以下步骤进行：
1）酶解：将海藻、水和酶加入到容器中，进行酶解，得酶解液；
2）海藻液：将步骤1）所得酶解液进行过滤，所得滤液即为海藻液；
所述酶解依次为纤维素酶酶解、糖化酶酶解和蛋白酶酶解；
所述酶是糖化酶、纤维素酶和木瓜蛋白酶，它们的质量比为1:1:1；
步骤1）中所述海藻、水和酶的质量比是30:69.7:0.3；
步骤2）过滤，滤网孔径为400目；
所述海藻是晾干的坛紫菜。
所述纤维素酶酶解为将海藻、水和纤维素酶加入到容器中，在pH为6.0，酶解温度为30℃条件下，进行酶解12h，在温度是100℃条件下，灭酶3min，得纤维素酶解液；
所述糖化酶酶解为将糖化酶加入到纤维素酶解液中，在pH为4.2，酶解温度为60℃条件下，进行酶解24h，在温度是100℃条件下，灭酶3min，得糖化酶解液；
将木瓜蛋白酶加入到糖化酶解液中，在pH为6.5，酶解温度为32℃条件下，进行酶解24h，在温度是100℃条件下，灭酶3min，得蛋白酶解液。
其中糖化酶的活力是50000U/g，纤维素酶的活力是100000U/g，木瓜蛋白酶活力是50000U/g。
实施例2
海藻液的提取方法，按照以下步骤进行：
1）酶解：将海藻、水和酶加入到容器中，进行酶解，得酶解液；
2）海藻液：将步骤1）所得酶解液进行过滤，所得滤液即为海藻液；
所述酶是糖化酶、纤维素酶和木瓜蛋白酶，它们的质量比为1:1:1；
步骤1）中所述海藻、水和酶的质量比是30:69.7:0.3；
步骤2）过滤，滤网孔径为400目；
所述海藻是晾干的坛紫菜。
所述酶解依次为纤维素酶酶解、糖化酶酶解和蛋白酶酶解；
所述纤维素酶酶解为将海藻、水和纤维素酶加入到容器中，在pH为6.0，酶解温度为30℃条件下，进行酶解12h，在温度是100℃条件下，灭酶3min，得纤维素酶解液；
所述糖化酶酶解为将糖化酶加入到纤维素酶解液中，在pH为4.2，酶解温度为60℃条件下，进行酶解24h，在温度是100℃条件下，灭酶3min，得糖化酶解液；
所述蛋白酶酶解为向糖化酶解液中通入氮气，至糖化酶解液中氧气含量低于0.2mg/L，将木瓜蛋白酶加入到除氧后的糖化酶解液中，在pH为6.5，酶解温度为32℃条件下，进行酶解24h，在温度是100℃条件下，灭酶3min，得蛋白酶解液。
其中糖化酶的活力是50000U/g，纤维素酶的活力是100000U/g，木瓜蛋白酶活力是50000U/g。
实施例3
海藻液的提取方法，按照以下步骤进行：
1）酶解：将海藻、水和酶加入到容器中，进行酶解，得酶解液；
2）海藻液：将步骤1）所得酶解液进行过滤，所得滤液即为海藻液；
所述酶是糖化酶、纤维素酶和木瓜蛋白酶，它们的质量比为1:3:1；
步骤1）中所述海藻、水和酶的质量比是34:65.993:0.007；
步骤2）过滤，滤网孔径为300目；
所述海藻是海带。
所述酶解依次为纤维素酶酶解、糖化酶酶解和蛋白酶酶解；
所述纤维素酶酶解为将海藻、水和纤维素酶加入到容器中，在pH为5.5，酶解温度为32℃条件下，进行酶解15h，在温度是90℃条件下，灭酶3min，得纤维素酶解液；
所述糖化酶酶解为将糖化酶加入到纤维素酶解液中，在pH为4.4，酶解温度为57℃条件下，进行酶解36h，在温度是100℃条件下，灭酶3min，得糖化酶解液；
所述蛋白酶酶解为向糖化酶解液中通入氮气，至糖化酶解液中氧气含量为0.1mg/L，将木瓜蛋白酶加入到除氧后的糖化酶解液中，在pH为7.0，酶解温度为28℃条件下，进行酶解12h，在温度是120℃条件下，灭酶1min，得蛋白酶解液。
其中糖化酶的活力是50000U/g，纤维素酶的活力是100000U/g，木瓜蛋白酶活力是50000U/g。
实施例4
海藻液的提取方法，按照以下步骤进行：
1）酶解：将海藻、水和酶加入到容器中，进行酶解，得酶解液；
2）海藻液：将步骤1）所得酶解液，即为海藻液；
所述酶是糖化酶、纤维素酶和木瓜蛋白酶，它们的质量比为2:1:2；
步骤1）中所述海藻、水和酶的质量比是27:72.97:0.03；
所述海藻是石花菜。
所述酶解依次为纤维素酶酶解、糖化酶酶解和蛋白酶酶解；
所述纤维素酶酶解为将海藻、水和纤维素酶加入到容器中，在pH为6.5，酶解温度为28℃条件下，进行酶解8h，在温度是100℃条件下，灭酶2min，得纤维素酶解液；
所述糖化酶酶解为将糖化酶加入到纤维素酶解液中，在pH为4.4，酶解温度为62℃条件下，进行酶解34h，在温度是100℃条件下，灭酶2min，得糖化酶解液；
所述蛋白酶酶解为向糖化酶解液中通入氮气，至糖化酶解液中氧气含量低于0.2mg/L，将巯基蛋白酶加入到除氧后的糖化酶解液中，在pH为6.8，酶解温度为32℃条件下，进行酶解36h，在温度是100℃条件下，灭酶3min，得蛋白酶解液。
其中糖化酶的活力是40000U/g，纤维素酶的活力是150000U/g，巯基蛋白酶活力是40000U/g。
实施例5
海藻液的提取方法，按照以下步骤进行：
1）酶解：将海藻、水和酶加入到容器中，进行酶解，得酶解液；
2）海藻液：将步骤1）所得酶解液进行过滤，所得滤液即为海藻液；
所述酶是糖化酶、纤维素酶和木瓜蛋白酶，它们的质量比为2:2:1；
步骤1）中所述海藻、水和酶的质量比是28:71.95:0.05；
所述海藻是马尾藻。
所述酶解依次为纤维素酶酶解、糖化酶酶解和枯草杆菌蛋白酶；
所述纤维素酶酶解为将海藻、水和纤维素酶加入到容器中，在pH为5.7，酶解温度为27℃条件下，进行酶解10h，在温度是110℃条件下，灭酶1min，得纤维素酶解液；
所述糖化酶酶解为将糖化酶加入到纤维素酶解液中，在pH为4.1，酶解温度为58℃条件下，进行酶解32h，在温度是100℃条件下，灭酶2min，得糖化酶解液；
所述蛋白酶酶解为向糖化酶解液中通入氮气，至糖化酶解液中氧气含量低于0.2mg/L，将枯草杆菌蛋白酶加入到除氧后的糖化酶解液中，在pH为6.6，酶解温度为30℃条件下，进行酶解28h，在温度是100℃条件下，灭酶3min，得蛋白酶解液。
其中糖化酶的活力是60000U/g，纤维素酶的活力是150000U/g，枯草杆菌蛋白酶活力是40000U/g。
下面结合实验数据进一步说明本发明的有益效果：
供试材料
1.1试验地点：由晟丰（烟台）农业科技有限公司委外检测。
1.2实验检测：水溶性固含量、海藻多糖含量、游离氨基酸含量和生长素（IAA）含量。
1.3供试材料：对比1（除将蛋白酶酶解替换成使用2%的硫酸在100℃处理1h外，其它制备方法均与实施例1一致）、对比2（除蛋白酶酶解温度为60℃外，其它制备方法均与实施例1一致）、对比3（除酶解顺序依次为蛋白酶酶解、纤维素酶酶解、糖化酶酶解外，其它制备方法均与实施例1一致）和实施例1制备的海藻液。
1.4实验实施：固含量按照涂料固体含量测定法 GB1725-79；海藻多糖检测采用硫酸-苯酚法；游离氨基酸含量检测按照GB/T 30987-2014 植物中游离氨基酸的测定 进行检测；生长素（IAA）含量按照小麦胚芽鞘切段生物试法测定。
本申请除各处理不同外，其它实施均一致。
2结果与分析
水溶性固含量、海藻多糖含量、游离氨基酸含量和生长素（IAA）含量见表1
表1
固含量（%） 海藻多糖（%） 生长素（mg/L） 游离氨基酸（%）
对比1 20.9 13.8 0 6.5
对比2 19.1 12.6 9.8 5.6
对比3 18.5 12.3 9.6 5.4
实施例1 21.4 14.1 10.7 6.7
注：本申请坛紫菜以干基计检测可溶性糖含量为47.6%，纤维素含量为1.6%，粗蛋白含量为28.6。
由表1中对比1（除将蛋白酶酶解替换成使用2%的硫酸在100℃处理1h外，其它制备方法均与实施例1一致）和实施例2的数据比较可以看出，加入硫酸在热的环境中处理破坏了海藻部分有效成分，即生长素的含量，致使提取不完全。由对比2（除蛋白酶酶解温度为60℃外，其它制备方法均与实施例1一致）和实施例1的数据比较可以看出，虽然木瓜蛋白酶最佳酶解温度是55～65℃，但是这个温度会使海藻多糖和游离氨基酸的含量同时减少，即在这个温度下有化学反应产生，也造成提取的不完全；由对比3（除酶解顺序依次为蛋白酶酶解、纤维素酶酶解、糖化酶酶解外，其它制备方法均与实施例1一致）和实施例1的数据比较可以看出，酶解顺序的改变也会影响最终提取的成分的变化，本申请实施例1提取效果更好。
实验二
1.1试验地点：由晟丰（烟台）农业科技有限公司委外检测。
1.2实验检测：始水溶性固含量、终水溶性固含量、始海藻多糖含量、终海藻多糖含量、始游离氨基酸含量、终游离氨基酸含量、始生长素含量和终生长素含量。
1.3供试材料：对比4（海藻液制备过程中除未经蛋白酶酶解外，其它制备方法均与实施例1一致）实施例1和实施例2制备的海藻液。
1.4实验实施：上述始含量对应的是刚生产出的海藻液中的含量；终含量为装入1L的聚乙烯瓶中室内放置6个月后的海藻多糖含量；实验室温度为25℃。
1.5检测方法：固含量按照涂料固体含量测定法 GB1725-79；海藻多糖检测采用硫酸-苯酚法；游离氨基酸含量检测按照GB/T 30987-2014 植物中游离氨基酸的测定 进行检测；生长素（IAA）含量按照小麦胚芽鞘切段生物试法测定。
本申请除各处理不同外，其它实施均一致。
2结果与分析
始水溶性固含量、终水溶性固含量、始海藻多糖含量、终海藻多糖含量、始游离氨基酸含量、终游离氨基酸含量、始生长素含量和终生长素含量见表2
表2
实施例1 实施例2 对比4
始水溶性固含量（%） 21.4 21.4 14.5
终水溶性固含量（%） 20.1 21.3 14.5
始海藻多糖含量（%） 14.1 14.1 14.1
终海藻多糖含量（%） 13.2 14.0 14.1
始游离氨基酸含量（%） 6.7 6.7 0.8
终游离氨基酸含量（%） 6.1 6.7 0.8
始生长素含量（mg/L） 10.7 10.7 3.1
终生长素含量（mg/L） 8.6 10.6 3.1
由对比4（海藻液制备过程中除未经蛋白酶酶解外，其它制备方法均与实施例1一致）和实施例1的数据比较可以看出，经纤维素酶和糖化酶酶解对比4制备的海藻液质量是稳定的，而加入蛋白酶酶解后的实施例1质量是不稳定的。
由表2实施例1和实施例2的数据比较可以看出，实施例1存在久置质量不稳定的问题，本申请通过通入氮气，可以有效提高产品质量的稳定性。

Claims (1)

1. 一种海藻液的提取方法，按照以下步骤进行： 1）酶解：将海藻、水和酶加入到容器中，进行酶解，得酶解液； 2）海藻液：将步骤1）所得酶解液进行过滤，所得滤液即为海藻液；
所述酶解依次为纤维素酶酶解、糖化酶酶解和蛋白酶酶解；
所述酶是糖化酶、纤维素酶和木瓜蛋白酶，它们的质量比为1:1:1； 步骤1）中所述海藻、水和酶的质量比是30:69.7:0.3； 步骤2）过滤，滤网孔径为400目； 所述海藻是晾干的坛紫菜；
所述纤维素酶酶解为将海藻、水和纤维素酶加入到容器中，在pH为6 .0，酶解温度为30℃条件下，进行酶解12h，在温度是100℃条件下，灭酶3min，得纤维素酶解液；
所述糖化酶酶解为将糖化酶加入到纤维素酶解液中，在pH为4 .2，酶解温度为60℃条件下，进行酶解24h，在温度是100℃条件下，灭酶3min，得糖化酶解液；将木瓜蛋白酶加入到糖化酶解液中，在pH为6 .5，酶解温度为32℃条件下，进行酶解24h，在温度是100℃条件下，灭酶3min，得蛋白酶解液；
其中糖化酶的活力是50000U/g，纤维素酶的活力是100000U/g，木瓜蛋白酶活力是50000U/g ；
所述蛋白酶酶解还包括酶解前向糖化酶解液中通入氮气，至糖化酶解液中氧气含量低于0.2mg/L。
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