CN112526144A - 一种血小板聚集率检测方法及检测装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血小板聚集率检测方法，该检测方法通过对血小板进行活化聚集后，与表面包被有纤维蛋白原的磁珠交联，利用磁力将交联后的活化血小板聚集至某一特定区域，再取其它区域的样本进行未活化的血小板浓度测定，通过血小板的初始浓度与未活化的血小板浓度计算血小板聚集率。采用本发明方法避免了检测过程中对血小板聚集的影响，以及血小板不同聚集情况对数量测算的影响，有效增加了检测的准确率。
Description
技术领域
本发明属于血液检测领域，具体涉及一种新的血小板功能检测方法。
背景技术
血小板功能分析仪通过血小板聚集功能检测，在临床上主要用于辅助血栓性疾病的诊断与治疗。依据WHO数据：在2015年，全球约1500万人死于缺血性心脏病和卒中。近15年来，血栓性疾病一直是人类健康的头号杀手。研究表明，血小板功能的高低与血栓性疾病的发生和发展密切相关：对于已出现血管损伤/狭窄的患者，血小板功能越高，其血栓发生的概率越高，反之，发生出血的概率越高。血小板功能检测作为一种行之有效的血栓性疾病发生/复发的预测手段，已在国内外多个大规模临床实验中获得证实。
目前，常见的血小板功聚集功能分析方法包括光学比浊法、verifynow法、连续计数法等等。然而，这些方法无一例外的均存在缺陷，临床应用效果不佳。例如，光学比浊法在检测前，需要通过离心制备富血小板血浆，而离心的过程就可能激活血小板，使其自发聚集，导致检测结果不准确。Verifynow法在光学比浊法基础上省去了离心步骤，采用了全血检测，然而全血中含有的大量红细胞对光学检测会产生极大的影响，导致检测误差很大。连续计数法则摒弃了光学检测，通过采用计数的方法确认血小板数量，从而进一步确定血小板聚集率，然而，由于在血小板聚集过程中，有时可能是多个血小板聚集形成一个较大的多聚体，有时可能是少数几个血小板聚集形成一个较小的多聚体。由于小多聚体和单个血小板之间体积差异不大，仪器很难通过体积大小区分它们，因此导致聚集率检测不准确。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种对血小板聚集率检测更加准确的方法。
为了达到上述目的，本发明提供了一种血小板聚集率检测方法，该检测方法通过对血小板进行活化聚集后，与表面包被有纤维蛋白原的磁珠交联，利用磁力将交联后的活化血小板聚集至某一特定区域，再取其它区域的样本进行未活化的血小板浓度测定，通过血小板的初始浓度与未活化的血小板浓度计算血小板聚集率。
具体的，所述血小板聚集率检测方法包括以下步骤：
(1)初始浓度测定：取全血样本，体积记为V1，加入检测管中，通过计数法测定样本中血小板的初始浓度PLT1；
(2)血小板活化聚集：向样本中加入血小板诱聚剂，体积记为V2，使血小板发生活化聚集；
(3)磁珠交联：再向样本中加入纤维蛋白原包被的磁珠，与活化聚集的血小板交联结合；
(4)聚集分离：将磁铁置于检测管底部或边缘位置处，通过磁力将磁珠吸引至检测管底部或边缘区域聚集；
(5)未活化血小板浓度测定：吸取检测管内远离磁珠聚集区域处的样本，通过计数法测定样本中血小板的浓度PLT2；
(6)计算血小板聚集率：根据初始浓度PLT1及未活化血小板浓度PLT2计算血小板聚集率。
其中，步骤(6)血小板聚集率AR的计算方法为：
为了减少血小板诱聚剂对血小板浓度的影响，步骤(6)血小板聚集率AR的计算方法可采用：
为了对发生活化聚集血小板分离的操作更加方便，步骤(4)中磁铁采用电磁铁，并置于检测管底部，当步骤(3)中纤维蛋白原包被的磁珠加入与活化的血小板进行交联结合反应5分钟后，再对电磁铁通电进行磁珠吸附。
在部分实施例中，纤维蛋白原包被的磁珠通过以下方法制备：取纤维蛋白原1mg，加入1％至直径为100nm磁微球溶液中，30℃水浴搅拌4小时；磁分离后，弃去上清，再将分离出的微球用MES缓冲液重悬。
本发明还提供了一种专用于上述检测方法的血小板检测装置，包括：
三轴加样臂，其上设有加样臂，可沿X轴、Y轴、Z轴三个方向自由移动；
吸嘴位，设有吸嘴；
吸嘴探头，进行加样臂上吸嘴检测；
样本位，设有盛有待检测样本的容器；
检测位，设有检测杯，检测杯或检测位底部设有电磁铁；
去吸嘴器，去除加样臂上吸嘴；
计数池，与检测单元连接；
检测单元，检验并计算计数池内样本中血小板浓度；
样品针，可沿检测位和计数池方向自由移动，并上下移动，进行检测杯内样品取样；
试剂位，设有盛放血小板诱导剂的容器；
磁珠位，设有盛放表面包被有纤维蛋白原的磁珠的容器。
其中，检测位采用旋转检测位，包括电动转盘，电动转盘上沿周向设有多个杯槽，各杯槽的槽底设有电磁铁；检测杯设于杯槽内。
吸嘴探头采用红外漫反射探头。
同时随着样品针沿检测位和计数池方向(即Y轴)的移动，样品针可分别位于检测位和计数池的正上方位置处。
检测装置还包括废物箱，位于去吸嘴器一侧。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明通过磁分离的方法分离已活化聚集的血小板和未发生活化聚集的血小板，并对总血小板与未发生活化聚集血小板分别采用计数法测定相应的浓度，从而进行血小板聚集率的测算，避免了检测过程中对血小板聚集的影响，以及血小板不同聚集情况对数量测算的影响，有效增加了检测的准确率。
本发明血小板聚集率检测方法操作简单，成本低，适合大规模推广应用。
附图说明
图1为本发明血小板聚集率检测装置的结构示意图；
图2为图1中XYZ三轴加样臂的结构示意图；
图3为图1中旋转检测位的结构示意图；
图4为图1中去吸嘴器的结构示意图；
图5为图1中样品针的结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
装置实施例
如图1所示，本发明一种血小板检测装置，包括：
三轴加样臂，结合图2所示，其上设有加样臂1，可沿X轴2、Y轴3、Z轴4三个方向自由移动地设于整体检测装置的上方；各轴移动方式可采用现有技术，如电动伸缩臂、电动滑块、齿轮齿条、气缸等，均可。
三轴加样臂的下方，分别设有计数池14、Tip吸嘴位5、Tip吸嘴探头7、去吸嘴器16、废物盒6、旋转检测位10、样本位9、试剂位8、磁珠位12；三轴加样臂的一侧设有样品针15和检测单元13。
吸嘴位5处，通过盒体内设置多个Tip吸嘴槽，进行吸嘴的排布放置，以方便吸嘴的获取；
同时加样臂1中空，后端(即加样臂1的顶端)通过软管20将柱塞泵19与加样臂1相连(由泵的抽吸运动使加样臂1内外出现压差，达到液体样本的吸吐)，前端(即加样臂1的底端)设有弹性圈21。当控制加样臂1移动至吸嘴位5的正上方时，通过Tip头与加样臂1底端的弹性圈21卡住，进行吸嘴的获取。
吸嘴探头7，采用红外漫反射探头，位于吸嘴位5的一侧，当加样臂1获取吸嘴后，移动至吸嘴探头7前方固定高度，由吸嘴探头7进行加样臂上吸嘴检测，判断是否已经准确获取吸嘴；
样本位9，设有盛有待检测样本的试管；
旋转检测位10，采用电动转盘，电动转盘上沿周向设有多个杯槽，各杯槽的槽底设有电磁铁11；检测杯设于杯槽内。
去吸嘴器16，端部水平设有切片，加样臂1移动至去吸嘴器16的一侧，且切片所处高度位于加样臂1与吸嘴的连接位置处时，加样臂1沿切片方向向去吸嘴器16移动，由切片去除加样臂上吸嘴，吸嘴掉落至下方(去吸嘴器16一侧)的废物盒6内；
计数池14，设有两个，分别盛放初始血液样本和血小板活化聚集处理后的样本，且均与检测单元连接；
检测单元13，检验并计算计数池内样本中血小板浓度；
样品针15，可沿检测位和计数池方向(图示y轴)自由移动，并可上下移动，进行检测杯内样品取样；
试剂位8，设有盛放血小板诱导剂的试剂管；
磁珠位12，设有盛放表面包被有纤维蛋白原的磁珠的容器。
实施例2
仪器检测具体步骤：
1)仪器通过XYZ三轴加样臂运动至取Tip吸嘴位5上方，z轴4向下运动，取得放置在Tip吸嘴位里面的一次性Tip头(或叫吸嘴)，加样臂运行至Tip吸嘴探头7处，检验是否取正确到Tip吸嘴。
2)加样臂运行到样本位9上方，吸取样本中的血液样本(本实施例采用全血样本)0.6ml。
3)加样臂运行到旋转检测位10的上方，将血液样本注入检测位上的一次性检测杯中。
4)加样臂再运行到去吸嘴器16处，取下Tip吸嘴放置废物盒6中。
5)样品针通过YZ轴运行到旋转检测位10上方，样品针z轴18向下运动，取得一次性检测杯中的血液样本0.3ml，然后通过YZ轴运行至计数池14上方，样品针z轴18向下运动，将样品针内吸取的血液样本注入计数池14内。
6)仪器通过检测单元13的检验与计算得出血小板初始浓度PLT1。
7)加样臂再通过XYZ三轴联动运行至Tip吸嘴位5，取得一次性Tip吸嘴，再运动至Tip吸嘴探头7前方，检验加样臂是否正确取得Tip吸嘴。
8)加样臂运行至试剂位8的上方，吸取试剂管内的试剂。
试剂采用血小板诱聚剂(常用的血小板诱聚剂包括二磷酸腺苷、花生四烯酸、胶原、肾上腺素、瑞斯托霉素、凝血酶受体激活肽，可以是其中任意一种)0.04ml(V2)。
9)加样臂运行至旋转检测位10的上方，将试剂注入带有血液样本的一次性检测杯(此时一次性检测杯中血液样本为0.3ml，记为V1)中。
10)加样臂再运行至去吸嘴器16处，取下Tip吸嘴放置废物盒6中。
11)加样臂同样通过XYZ三轴联动运行至Tip吸嘴位5，取得一次性Tip吸嘴，再运动至Tip吸嘴探头7前方，检验加样臂是否正确取得Tip吸嘴。
12)加样臂运行至磁珠位12的上方，吸取包被纤维蛋白原的磁珠MES缓冲液0.01ml。
纤维蛋白原包被磁珠的预制：取纤维蛋白原1mg，加入20ml的1％浓度(W/V)直径为100nm磁微球溶液中，30℃水浴搅拌4小时；磁分离后，弃去上清，再将分离出的微球用MES缓冲液2ml重悬。
13)加样臂运行至旋转检测位10的上方，将磁珠MES缓冲液置入带有血液样本和试剂的一次性检测杯中。包被纤维蛋白原的磁珠与活化的血小板进行磁珠交联结合(血小板发生活化后表面暴露出的纤维蛋白原受体与磁珠表面的纤维蛋白原结合)。
14)加样臂再运行至去Tip吸嘴器16处，取下Tip吸嘴放置废物盒6中。
15)5分钟后，位于旋转检测位10检测杯下方的电磁铁11通电后，产生磁力，将磁珠吸附至一次性检测管底部。
16)样品针同样通过YZ轴联动运行至旋转检测位10的上方，吸取检测管上层的样本(未活化的血小板)，再通过YZ轴联动运行至计数池14的上方，将样本注入到计数池内。
17)仪器通过检测单元13的检验与计算得出未活化的血小板浓度PLT2。
18)仪器根据下列公式计算出血小板聚集率(AR)
同时考虑到向样本中加入一定体积的血小板诱导剂会稀释血小板浓度，将体积带入计算后，也可根据以下公式计算血小板聚集率(AR)
对比实施例1
现有方法：直接将0.04ml诱聚剂直接加入0.3ml全血中反应，不分离活化聚集的血小板，直接进行计数。
检测5名健康志愿者的初始基线的血小板聚集率，然后每人服用75mg阿司匹林，24小时后复测血小板聚集率。结果如下：
由上述结果可知，使用本方法时，服药前和服药后测试所得的聚集率差异的平均值高于现有方法(38.0％VS 29.0％)，说明本方法测试时拥有更高的灵敏度，可以更灵敏的检测出血小板聚集前后的差异。
Claims (10)
1.一种血小板聚集率检测方法，其特征在于，所述血小板聚集率检测方法通过对血小板进行活化聚集后，与表面包被有纤维蛋白原的磁珠交联，利用磁力将交联后的活化血小板聚集至某一特定区域，再取其它区域的样本进行未活化的血小板浓度测定，通过血小板的初始浓度与未活化的血小板浓度计算血小板聚集率。
2.根据权利要求1所述血小板聚集率检测方法，其特征在于，所述血小板聚集率检测方法包括以下步骤：
(1)初始浓度测定：取全血样本，体积记为V1，加入检测管中，通过计数法测定样本中血小板的初始浓度PLT1；
(2)血小板活化聚集：向样本中加入血小板诱聚剂，体积记为V2，使血小板发生活化聚集；
(3)磁珠交联：再向样本中加入纤维蛋白原包被的磁珠，与活化聚集的血小板交联结合；
(4)聚集分离：将磁铁置于检测管底部或边缘位置处，通过磁力将磁珠吸引至检测管底部或边缘区域聚集；
(5)未活化血小板浓度测定：吸取检测管内远离磁珠聚集区域处的样本，通过计数法测定样本中血小板的浓度PLT2；
(6)计算血小板聚集率：根据初始浓度PLT1及未活化血小板浓度PLT2计算血小板聚集率。
3.根据权利要求2所述血小板聚集率检测方法，其特征在于，所述步骤(6)血小板聚集率AR的计算方法为：
4.根据权利要求2所述血小板聚集率检测方法，其特征在于，所述步骤(6)血小板聚集率AR的计算方法为：
5.根据权利要求2所述血小板聚集率检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中磁铁采用电磁铁，并置于检测管底部，当步骤(3)中纤维蛋白原包被的磁珠加入与活化的血小板进行交联结合反应5分钟后，再对电磁铁通电进行磁珠吸附。
6.根据权利要求2所述血小板聚集率检测方法，其特征在于，所述纤维蛋白原包被的磁珠通过以下方法制备：取纤维蛋白原1mg，加入1％至直径为100nm磁微球溶液中，30℃水浴搅拌4小时；磁分离后，弃去上清，再将分离出的微球用MES缓冲液重悬。
7.一种用于权利要求1至6任一所述血小板聚集率检测方法的检测装置，其特征在于，所述检测装置包括：
三轴加样臂，其上设有加样臂，可沿X轴、Y轴、Z轴三个方向自由移动；
吸嘴位，设有吸嘴；
吸嘴探头，进行加样臂上吸嘴检测；
样本位，设有盛有待检测样本的容器；
检测位，设有检测杯，检测杯或检测位底部设有电磁铁；
去吸嘴器，去除加样臂上的吸嘴；
计数池，与检测单元连接；
检测单元，检验并计算计数池内样本中血小板浓度；
样品针，可沿检测位和计数池方向自由移动，并可上下移动，进行检测杯内样品取样；
试剂位，设有盛放血小板诱导剂的容器；
磁珠位，设有盛放表面包被有纤维蛋白原的磁珠的容器。
8.根据权利要求7所述的检测装置，其特征在于，所述加样臂中空，前端设有弹性圈，后端通过软管与柱塞泵连通。
9.根据权利要求8所述的检测装置，其特征在于，所述检测位采用旋转检测位，包括电动转盘，电动转盘上沿周向设有多个杯槽，各杯槽的槽底设有电磁铁；检测杯设于杯槽内。
10.根据权利要求9所述的检测装置，其特征在于，所述吸嘴探头采用红外漫反射探头；所述检测装置还包括废物箱，位于去吸嘴器一侧。
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