FI59679C - Foerfarande och anordning foer maetning av koaguleringshastigheten hos en vaetska - Google Patents

Description

- M <11)KUU,LUTUSJULKA,SU 5 Q A 7 Q

l J 1 ' UTLÄGGNINGSSKRIFT ° 7 ° ' ·* C (45) Patentti cyinnctty 10 C9 1931 (51) Kv.lk?/Int.CI.3 G 01 N 33/86 SUO M I—FI N LAN D <») Patenttihakemus — Patwttuw6lmln( 753015 (22) HakemlipiM —Anaeknlnjadat 29.10.75 (23) Alkupllvi — Glltighetadaf 29.10.75 (41) Tullut Julkiseksi — Bllvlt offentll| 30 OU 77 j. nklMrilullltu.

Patent- och raglttarstyralaan ' Ansekan uttagd och uti.ikrtftwi publictr*d 29.05.81 (32)(33)(31) **yy^*«y «uoikeua—ftetirt pnoritat (71) Geomet, Incorporated, 50 Monroe Street, Rockville, Maryland 20850, USA(US) (72) Rudolph H. Moyer, West Covina, California, Donald J. Sibbett, Cucamonga,

California, USA(US) (7M Antti Impola (5^) Menetelmä ja laite nesteen koaguloitumisuopeuden mittaamiseksi - Förfarande och anordning för mätning av koaguleringshastigheten hos en vätska

Keksinnön kohteena on menetelmä sellaisen nesteen koaguloitumisr.o-peuden mittaamiseksi toistettavasti, jonka nesteen viskositeetti suurenee sen jälkeen, kun se on yhdistetty vähintään yhteen reagenssiin, joka kykenee muuttamaan näytteen viskositeettia, jonka menetelmän mukaan näyte sijoitetaan pitkänomaiseen putkeen, ja laite menetelmän toteuttamiseksi.

Seuraavassa esityksessä keksintö selitetään sovellettuna kokoveren tai veriplasman pienien näytteiden hyytymiskyvyn määrittämiseen tai toteamiseen protrombiiniaika-, osittaisentromboplastiiniaika- tai muiden tämänkaltaisten kokeiden yhteydessä suoritettujen mittausten perusteella.

Seuraavassa selitetään sopivasti ensin yleisesti veren hyytymiseen liittyvät luonnolliset ilmiöt. Näihin monimutkaisiin ilmiöihin liittyy sarja entsymaattisia ja fysikaalisia keskinäisiä vaikutuksia, joiden seurauksena nestemäinen veri muuttuu kiinnitarttuvaksi massaksi, Pääprosesse-ja ovat proentsyymin eli protrombiinin muuttuminen entsyymiksi eli trom-biiniksi, ja trombiinin vaikutus fibrinogeeniin siten, että muodostuu fib-riiniä. Fibriini erottuu pitkinä kuituina eli lankoina, jotka ovat erittäin kiinnitarttuvia. Nämä langat tarttuvat toisiinsa, verisoluihin,kudoksiin ja vieraisiin aineisiin ja muodostavat kolmiulotteisen verkon eli hyytymän. Tämä kiinnitarttuvuus saattaa hyytyneen veren pysymään koossa ja tarttumaan lujasti kiinni vahingoittuneisiin kudoksiin verenvuodon estämiseksi. Koko hyy tymissar ja voidaan kaaviollisesti esittää seuraavasti: 2 59679

Edistää K-vitsmiini;

Estää suun kautta nautitut anti-koagulantit _ v

Maksa _ Protrombiini

Aktivoitu Ca++:n ja tromboplastiiniaineiden vaikutuksesta

V

Trombiini l .

Fibrinogeeni -? Fibriini (hyytymä)

Veri ei normaalisti hyydy suonistossa, koska trombiini esiintyy ei-aktiivisessa muodossaan protrombiinina, joka aktivoituu trombiinik-si siinä tapauksessa, että veri vuotaa vahingoittumisen takia tai poistetaan verisuonista. Protrombiinin aktivoituminen johtuu aineista, jot-tunnetaan tromboplastiineina, ja joita esiintyy verihiutaleissa ja erilaisissa kudoksissa, erikoisesti keuhko- ja aivokudoksissa. Eräissä sairauksissa voi protrombiinin osittaista aktivoitumista esiintyä verisuonissa, mikä johtaa veritulppautumien muodostumiseen. Tämä tilanne on vaarallinen sellaisissa sairauksissa kuten sydäninfarktissa, reumaattisissa sydänsairauksissa, aivojen suonistosairauksissa, laskimo-tromboosissa ja keuhkojen tulppautumassa, joiden tilanteiden käsittelemiseksi on käytettävä antikoagulantteja suonensisäisten tulppautumien muodostumisen estämiseksi mutta silti normaalin hemostaasin eli verenvuodon tyrehdyttämiskyvyn pysyttämiseksi.

Antikoagulanttien antaminen näiden sairauksien käsittelyn eräänä osana on suuresti empiirinen, ja annostusta säädetään päivittäin, kunnes on saatu todetuksi kunkin potilaan reaktio antikoagulanttiin nähden. Senkin jälkeen, kun on säädetty pitkäaikaista käsittelyä varten sopiva annos, valvotaan potilaan reaktiota yleensä kaksiviikkoittaisen tai kuukausittaisen tarkastuksen mukaan.

Vanhin ja laajimmin käytetty menetelmä, jonka avulla valvotaan potilaan reaktiota antikoagulaattihoitoon, on yksivaiheisen protrombii-niajan mittaus, jonka on ehdottanut Quick, tai tämän perusmenetelmän 3 59679 jokin sovellutus. Yksivaiheisen protrombiiniajän mittauksessa veri kerätään natriumsitraattiin tai -oksalaattiin, joka kelatoi kalsiumin ja estää protrorabiinin aktivoitumisen ennen mittauksen alkua. Veri sentrifugoidaan, ja plasmanäyte sekoitetaan aivo- tai keuhkokudoksesta saatuun ylimäärin käytettyyn tromboplastiiniuutokseen, joka sisältää riittävästi kalsiumia kelatoivan aineen vaikutuksen voittamiseksi. Sekoittaminen suoritetaan nopeasti säädetyissä olosuhteissa. Hyytymien muodostumisen alkuun kuluvaa aikaa sanotaan protrombiiniajaksi. Hyytymisten muodostuminen voidaan todeta visuaalisesti tai mitata kaupan saatavien mekaanisten kojeiden avulla. Kun mittaus suoritetaan 37 °C: ssa, on normaalin ihmisplasman protrombiiniaika tavallisesti 12 sekuntia. Suun kautta tapahtuva antikoagulanttihoito säädetään yleensä siten, että saadaan noin 25 sekunnin pituisia protrombiiniaikoja.

Nykyisessä kliinisessä käytännössä protrombiiniaikojen mittaukset tehdään verinäytteillä, jotka otetaan potilaista ja sitten siirretään laboratorioon analyysiä varten. Vaikka nämä mittaukset voidaan suorittaa suhteellisen helposti eivätkä ne edellytä monimutkaisten tai kalliiden reagenssien käyttöä, vaativat ne kuitenkin erikoiskoulutetun henkilökunnan aikaa sekä erikoista laitteistoa ja laboratoriovarus-teita. Pakko turvautua laboratorioanalyysiin edustaa huomattavaa ajal*-lista viivästymistä näytteenottoajän ja sen ajankohdan välillä, jolloin analyysin tulos on käytettävissä apuna hoidon säätöä varten. Vaikka tämä viivästyminen tavallisesti ei ole luonteeltaan kriittinen, on se kuitenkin haitaksi sekä potilaalle että hoitavalle lääkärille» Laskimon toistuvia puhkaisuja on tehtävä pitkien aikajaksojen kuluessa niiden eri näytteiden saamiseksi, jotka ovat välttämättömiä kunkin potilaan antikoagulanttihoidon valvomiseksi sen jälkeen, kun määrätty hoi-torutiini on saatu aikaan. Laskimoiden tällaiset puhkaisut voivat esim. vanhahkoiden potilaiden kohdalla olla vaikeasti suoritettavissa, ja ne voivat osoittautua potilaalle traumaattisiksi.

Edellä selitettyjen mittausten suorittamiseksi olisi eduksi saada käyttöön sellainen menetelmä ja laite, jotka soveltuvat protrombii-niajan nopeisiin mittauksiin soimen puhkaisussa saatua koaguloitumaton-ta kokoveripisaraa käyttäen. Tässä menetelmässä voidaan käyttää lait-tetta, johon sisältyvät kaikki ne reagenssit ja välineet, jotka ovat tarpeen protrombiiniajän mittaamiseksi. Tällainen menetelmä ja laite edustaisi huomattavaa parannusta ennestään tunnettuun tekniikkaan verrattuna .

On ennestään tunnettua mitata protrombiiniaikoja pienissä säiliöissä kuten koeputkissa tai -kennoissa, joihin plasmanäyte pannaan 4 59679 yhdessä reagenssien kanssa, joina voidaan käyttää jotain niistä lukuisista tromboplastiinireagensseista, joita on kaupan saatavissa, sekä tarpeen vaatiessa ylimääräistä kalsiumia. Aikaa, joka kuluu reagenssien ja näytteen sekoittamisesta hyytymisen alkamiseen voidaan valvoa visuaalisesti näytteen läpinäkyvyyden muutoksia ilmaisevan optisen instrumentoinnin avulla, hyytymien kiinnitarttumista lankoihin tai kuituihin ilmaisevien fibrometrien avulla, edelleen mittaamalla johtokyvyn muutoksia tai soveltamalla erilaisia viskositeetin suurenemiseen kohdistuvia mittauksia. Yksivaiheisen protrombiiniajan mittauksen kehitti ja esitti Quick, joka myös saattoi menetelmän populaariseen muotoon.

Tämä koe on herkkä veren tekijöille V (labiilitekijä eli pro-akseleriini), VII (prokonvertiini), X (Stuart-Prower-tekijä) ja II (protrombiini). Protrombiiniaikaa Quick'in menetelmän avulla määritettäessä oletetaan näiden tekijöiden esiintyvän ylimäärin, protrombiinia lukuunottamatta. Tekijät VII ja X voivat kuitenkin pienentyä antikoa-gulanttihoidon aikana.

Aikaisemmin on ehdotettu erilaisia menetelmiä koaguloitumisno-peuksien mittaamiseksi. Niinpä on käytetty kapillaarista viskosimetriä sen sokerimäärän mittaamiseksi, joka tarvitaan erilaisten hyytelöiden valmistamiseksi hedelmämehuista. Putken sanotaan säätävän virtausta, vaikka käytetään kapillaariputkea. Tällainen viskosimetri perustuu logaritmiseen riippuvuuteen virtauksesta, toisin sanoen sokeripitoisuudesta, suhteellisesta viskositeetista ja kapillaariputken pituudesta. Tämä riippuvuus on normaali viskositeetin mittauksissa. Verinäytteiden hyytymisajan mittaamiseksi on esitetty laite, jossa vereen sekoitetaan reagensseja, minkä jälkeen veri pumputaan takaisin kapillaariputken läpi paineilman avulla. Hyytymisajaksi mitataan siihen ajankohtaan kuluva aika, jolloin virtaus kapillaariputken läpi estyy, niin että ei enää voida suorittaa uusia pumppuamisjaksoja painetta suurentamatta. Tavallisesti käytetään suhteellisen paljon verta (yleensä 20 ml).

Tällaisen laitteen avulla saatujen tulosten toistettavuus riippuu paineenvaihtelujen amplitudin ilmaisusta jokaisen pumppuamisiskun aikan hyytymisajän määrittämiseksi. Reagenssien ja verinäytteen välillä käytetään kapillaariliitäntää hyytymisilmiön vahvistamiseksi. Tällaisessa monimutkaisessa laitteessa on käytettävä pumppuamislaitteita, paineelle herkkiä laitteita, jne.

Eräs toinen tunnettu laite perustuu siihen, että ruiskeneula työnnetään laskimoon ja mitataan veren vuotaminen taipuisaan muoviputkeen, kunnes hyytymistä esiintyy. Kerätty tilavuus mitataan ajan funk- 5 59679 tiona tromboosiin päättymiseen asti. Tämä aika ja tilavuus pidetään mittana potilaan tromboosialttiudelle. Sileän mittausputken halkaisija on rajoissa noin 0,5...1 mm. Mittaus suoritetaan kemikaalisiareagensseja lisäämättä ja saadaan mitatuksi koko veren hyytymisaika mutta ei sitä reaktiota, jota rajoittavat protrombiinit ja muut tähän liittyvät veritekijät.

Keksinnön ansoista saadaan menetelmä sellaisen nesteen koaguloitu-misnopeuden mittaamiseksi toistettavasti, jonka nesteen viskositeetti suurenee sen jälkeen, kun se on yhdistetty vähintään yhteen reagenssiin, joka kykenee muttamaan nestenäytteen viskositeettia, jonka menetelmän mukaan näyte sijoitetaan pitkänomaiseen putkeen, ja tämä menetelmä tunnetaan siitä, että käytetään putkea, jonka sisähalkaisija on riittävän suuri tällaisen näytteen viskositeetin vaikutuksen poistamiseksi, sijoitetaan pieni määrä mainittua nestenäytettä mainitun putken yläpäähän, yhdistetään nestenäyte vähintään yhteen mainittuun reagenssiin, saatetaan putkessa oleva näyte painovoiman vaikutuksesta kannattamalla putkea yleisesti pystysuuntaisena liikkumaan alaspäin tässä putkessa valvottua laskeutumis-liikettä suorittaen, ja mitataan aika, joka on tarpeen viskositeetin kasvattamiseksi siten, että näyte tulee liikkumattomaksi sen jälkeen, kun se on laskeutunut putken läpi.

Keksinnön mukaan saadaan myös laite nestenäytteen hyytymisnopeuk-sien määrittämiseksi sen jälkeen, kun tämä näyte on yhdistetty vähintään yhteen reagenssiin, joka kykenee suurentamaan täten yhdistetyn näytteen viskositeettia pitkänomaisessa reaktioputkessa, ja tämä laite tunnetaan siitä, että reaktioputken sisähalkaisija on niin suuri,että saadaan pääasiallisesti kumotuksi nestenäytteen alkuperäisen viskositeetin vaikutukset, jossa putkessa on ensimmäinen avoyläpää,huokoinen tulppa, joka sisältää mainitun reagenssin ja joka sijaitsee tässä putkessa lähellä tätä ensimmäistä päätä, jolloin tämä putki on kalibroitu tämän yläpään alapuolella siten, että toistettavasti voidaan mitata nestenäytteen hyytymiseen tarvittava aika sen jälkeen, kun näyte on joutunut kosketukseen mainitun reagenssin kanssa, suorana funktiona siitä matkasta, jonka mainittuun, yläpäähän sijoitettu nestenäyte laskeutuu reaktioputkessa ennen kuin se muuttuu liikkumattomaksi.

Keksinnön eräät suositut suoritusmuodot selitetään seuraavassa esimerkkeinä oheisten piirustusten perusteella.

Kuvio 1 esittää kaaviollisesti keksinnön mukaan konstruoitua laitetta hyytymisnopeuden määrittämiseksi.

Kuvio 2 esittää kuvion 1 mukaista laitetta, johon on merkitty vyöhykkeet, toisin sanoen värilliset vyöhykkeet.

6 59679

Kuvio 3 esittää kuvion Λ mukaisen tyypillisen laitteen kali-brointiarvoja.

Keksinnön mukainen menetelmä perustuu reaktioputkeen tai -sylinteriin, joka sisältää erikoisesti valmistettuja ja sijoitettuja reagensseja, joiden avulla suoritetaan reaktioita veren, plasman tai muiden nesteiden kanssa. Putken yläpäähän lisätään pieni näyte tutkittavasta nesteestä. Tämä näyte laskeutuu putkessa, liuentaa reagenssit ja pysähtyy kohtaan, joka on suhteessa reaktion ajalliseen pituuteen. Reaktion nopeuden mittana on se kohta pitkin putken pituutta, jossa nestenäyte muuttuu liikkumattomaksi. Sopivia reagensseja käytettäessä tämä kohta on suorassa suhteessa veri- tai plasmanäytteen protrombii-niaikaan. Tämä protrombiiniaika on suoraviivaisessa suhteessa nesteen putkea pitkin laskemaan matkaan.

Jotta koe tapahtuisi tehokkaasti ja toistettavasti, on näytteen kostutettava putken tai sylinterin sisäpinta tasaisesti. Putken määrättyyn kohtaan on ennen putken käyttöä sijoitettu kemiallisina rea-gensseina tromboplastiinireagenssia ja eräitä lisäaineita sopivin määrin siten, että protrombiinireaktio tapahtuu, kun nämä reagenssit ovat liuenneet nestemäiseen näytteeseen. Nämä reagenssit lyofiloidaan putken välittömästi kalibrointimerkin alapuolella sijaitsevaan kohtaan. Tämä merkki osoittaa sitä näytetilavuutta eli -määrää, jolla putki on täytettävä. Lyofiloinnin jälkeen putki suljetaan tiiviisti vedenkestä-vään koteloon, josta se otetaan vasta käyttöhetkenä.

Vaihtoehtoisesti voidaan reagenssi ennalta sekoittaa näytteen kanssa, ennen kuin näyte sijoitetaan reaktioputkeen eli -sylinteriin. Tämä viimeksi mainittu tekniikka on kuitenkin yleensä vähemmän sopiva siinä suhteessa, että esisekoittamisen ja viskositeettimittauksen välinen aikajakso voi tulla huomattavan pitkäksi.

Sisäaukoltaan pääasiallisesti tasapaksua putkea käytetään sijoittamalla veri- tai plasmanäyte putken yläpäähän. Sopivan halkaisijan omaavaa putkea käytettäessä näyte voidaan sijoittaa putkeen saattamalla tämän täyttöpää kosketukseen näytteen pinnan kanssa, jolloin näyte tulee imetyksi kapillaarivaikutuksen avulla. Näytteen annetaan nousta ylösalaisin käännetyssä putkessa, kunnes meniski saavuttaa kalibroidun täyttömerkin. Tässä vaiheessa putki käännetään pystyasentoon siten, että näyte joutuu putken yläpäähän. Painovoiman vaikutuksesta tämä mitattu näyte- tai nestemäärä laskeutuu alaspäin reaktiota varten tarvittavien lyofiloitujen reagenssien läpi. Reagenssien liuottua nes-tetulppa jatkaa laskeutumistaan putkessa eli sylinterissä, kunnes se hyytyy. Kulkumatkaa lyofiloitujen reagenssien alapinnan korkeudelta 7 59679 hyytyneen tulpan alapintaan asti voidaan käyttää reaktionopeuden suorana mittana. Useissa putkivalmisteissa tämä matka on sopivasti kalibroitu protrombiiniajan funktiona, joka on määritelty standardityyp-pisen yksivaiheisen Quick-kokeen avulla. Katso julkaisuja A.J. Quick: Amer. J. Med. Se. 190,501,(1936); Proc. Sc. Exper. Biol. and Med., 42, 788 (1939); Amer. J. Clin. Path., 15, 560 (19^-5); Thromb. Diath. Haemorrh., 2, 226 (1958); Amer. J. Med. Sei., 246, 517 (1963). Pro-trombiiniajan käyrä eli tulpan laskema matka putkea pitkin alaspäin on yksinkertainen suoraviivainen funktio.

Putki voidaan periaatteessa tehdä tarvittavan pitkäksi siten, että sitä voidaan käyttää antamalla nestetulpan rajoituksitta virrata alaspäin pitkin putkea. Mukavuuden vuoksi on kuitenkin käytetty eri menetelmiä laskeutumisnopeuden rajoittamiseksi.

Niinpä on putken alapäähän sijoitettu aukkoja, jotka vähentävät ilman vuotamisnopeutta nestemäisen näytetulpan alapuolella sijaitsevasta putkenosasta. Putki voidaan myös sijoittaa siten, että se muodostaa kulman pystyakselin kanssa, jolloin näytteen paino toimii käyttövoimana nestetulpan laskeutuessa, ja tämä voima kerrataan tekijällä, joka on yhtä kuin sen kulman kosini, jonka putki muodostaa pystyakselin kanssa. Laskeutumisnopeutta voidaan myös säätää sisäpuolisella seinämänpäällysteellä tai sylinterin sisäpinnassa olevilla fysikaalisilla ulkonemilla. Joka tapauksessa lopullinen pysähtymisasento edustaa näytteen protrombiiniajan suoraa mittaa.

Normaalissa kliinisessä käytännössä Quick-menetelmän mukaan saadut protrombiiniajat määritetään 37 °C:ssa. On todettu, että reak-tioputkimenetelmän avulla protrombiinimatkoja määritettäessä voidaan koe sopivasti tehdä huoneenlämmössä sillä edellytyksellä, että käytetään kalibrointipiirrosta, joka asettaa molemmat tietoryhmät oikeaan suhteeseen keskenään (toisin sanoen standardi-protrombiiniajat 37 °C: ssa suhteessa reaktioputken protrombiiniaikoihin huoneenlämmössä, esim.

22...23 °C:ssa).

Selitettyjen protrombiini-reaktioputkien toistettavissa olevan suorituksen saavuttamiseksi on tarkasti määriteltävä ne fysikaaliset ja kemialliset parametrit, jotka ohjaavat reaktionopeutta ja nesteen liikkumisnopeutta putkissa. Näitä parametrejä ovat: a) putken sisähal-kaisija ja sen vaihtelu, b) putken sisäpinnan puhtaus ja tasaisuus, e) näytteen tilavuus, d) reagenssin koostumus ja sijainti, e) reagens-sin liukenemisnopeus ja/tai reagenssin tiheys ja huokoisuus putkessa, f) reagenssin absoluuttinen määrä, g) reaktiolämpotila, h) ilman vuo-tamisnopeus näytetulpan alapuolella olevasta tilasta, tai kulma, jon- 8 59679 ka putki muodostaa pystyakselin kanssa. Kaikki parametrit on pidettävä suhteellisen ahtaissa rajoissa.

Tärkein parametri on reaktioputken sisähalkaisijan valinta. Tämän halkaisijan on oltava niin suuri, että hyytymätön nestenäyte pääsee virtaamaan alaspäin painovoiman vaikutuksesta sen jälkeen, kun tämä näyte ja reagenssit on aluksi yhdistetty. Halkaisija valitaan myös siten, että näyte on hyytynyt ja muuttunut liikkumattomaksi sen jälkeen, kun se on kulkenut sopivan matkan pitkin putken pituutta. Tässä selitettyä suoritusmuotoa varten käytetään sopivasti 1,8 mm halkaisijaa, kun määritetään kokoveren tai plasman protrombiiniaika.

Koe on suoritettava olosuhteissa, joissa veren viskositeetin vaikutukset ovat mahdollisimman pienet. Menetelmän avulla voidaan pro-trombiiniajan mittaukset suorittaa noin kahdessa minuutissa ja tällöin saada lopullinen tulos, jolloin on saatu poistetuksi kaikki viivytykset, eikä tarvita koulutettua henkilökuntaa eikä myöskään määrätyllä tavalla varustettua erikoislaboratoriota. Jokaista mittausta varten tarvittavana näytteenä on hyytymätön pisara kokoverta sormen puhkaisusta, joten tullaan toimeen ilman sitä epämukavaa laskimon puhkaisua, joka on tarpeen ennestään tunnetun tekniikan mukaista menetelmää sovellettaessa. Ei myöskään ole mitään kriittistä aikaa tuloksen lukemiseksi. Koe voidaan aloittaa ja tulos tarkastaa ja tallentaa miten käyttäjälle parhaiten sopii. Tuloksen lopullinen tila säilyy melkein loppumattomiin.

Kuvio 1 esittää pienen tasaisen porauksen omaavaa lasiputkea, jonka aukon halkaisija on 1,8 mm + 2 ja pituus on 18 cm. Putki on kalibroitu täytettäväksi 35 mikrolitralla verta tai plasmaa osoitettuun täyttöviivaan asti. Putken pituus on kalibroitu millimetrimerkin-nöin, jotka ulottuvat alaspäin lyofiloitua reagenssia olevan laskeuman alareunasta. Etäisyys d on reagoivan nestenäytetulpan kulkumatkan mitta kohtaan, jossa tämä tulppa pysähtyy hyytymisen tapahtuessa. Kuvion 3 perustana olevat kalibrointitiedot koskevat sellaista reaktio-putkea, jossa ilmavuodon säätämiseen käytettiin 20 mm pituista ruostumatonta terästä olevaa kapillaariputkea, jonka sisähalkaisija oli noin 0,15 mm.

Koeolosuhteissa ja 23 °C:ssa näytteen jokainen sentimetrin pituisen kulkumatkan hyytymiskohtaan asti on todettu vastaavan 2,1 sekuntia protrombiiniajaeta, joka on mitattu 37 °C:ssa. Näissä kokeissa vaihtelukerroin oli + 6...8 %,

Joukko tällaisia kalibrointeja on suoritettu vaihtelemalla lämpötiloja, putken halkaisjoita ja pituuksia, ilman vuotonopeuksia ja Q 59679 9 näytetilavuuksia. Saavutetut numeeriset arvot ovat pysyttäneet standardit yyppisen kliinisen laboratoriomenetelmän avulla mitattujen pro-trombiiniaikojen ja tämän selityksen mukaisen reaktioputken välisen suoraviivaisen suhteensa. Täten saadaan sangen sopiva menetelmä yksivaiheisen protrombiiniajan ja osittaisen protrombiiniajan mittaamiseksi keksinnön mukaisella laitteella.

Eräs niistä päätekijöistä, jotka koskevat protrombiinireaktio-putken suorituskykyä, on ollut tromboplastiinireagenssin optimointi reaktiokyvyn, mekaanisen stabiliteetin ja liukenemisnopeuden mukaan määriteltynä. On kokeiltu joukko kaupan saatavia tromboplastiinival-misteita. Kaikki osoittavat omaavansa sopivia reaktiokyky-ominaisuuksia, kun käytetään sellaisia absoluuttisia määriä, että saavutetaan kuivan valmistemäärän ja näytetilavuuden väliset määrätyt konsentraa-tiot, (jolloin toisin sanoen näytetilavuus on 35 mikrolitraa tässä esitetyn selityksen mukaan). Tämä tarkoittaa noin 10 mg/ml useille kaupan saataville valmisteille. Jäädyttämällä kuivatun valmisteen saattamiseksi pysymään mekaanisesti stabiilina putkessa, lisätään kuitenkin gelatiinia 10 mg/ml suuruisena konsentraationa. Huokoisuus, joka on tarpeen reagenssien saattamiseksi nopeasti liukenemaan näytteeseen, saavutetaan lisäämällä hienojakoisia täyteaineita. Kuviossa 3 esitettyjä lukuarvoja laskettaessa käytettiin valmisteessa lisäaineina tuotetta MCab, -0-SilM, höyrystettyä piidioksidia, joka oli laatua "M-5", jolloin konsentraatio oli 5 mg/ml.

Tromboplastiinireagenssia valmistettiin liuoksena mainituin konsentraatioin. 30 mikrolitran annos sijoitettiin automaattisen mikro-pipetin avulla keskelle puhtaan jäädytetyn (-20 °C) reaktioputken kohtaa, joka oli 2,2 cm päässä putken yläpäästä. Putket kuljetettiin lyo-filointilaitteeeeen, jäädytyskuivattiin, sijoitettiin kuiviin säiliöihin, joiden suhteellinen kosteus oli 5 #, ja varustettiin lasitulpalla. Tämän menettelyn avulla saatiin muodostumaan huokoinen reagenssitulp-pa, jonka korkeus oli noin 1 cm jokaisessa putkessa. Putket varastoitiin huoneenlämmössä, kunnes niitä tarvittiin. Varastokestoisuus todettiin rajattomaksi.

Tällä tavoin valmistettuja putkia voidaan kalibroida vyöhykkeittäin, jolloin vyöhykkeet ilmaisevat saatujen tulosten merkitykset. Kuvio 2 esittää esimerkkinä värikoodilla varustettua putkea, jota voidaan käyttää antikoagulaattihoidon vaikutuksen rutiinimaiseen tarkastamiseen. Sinisellä nauhalla on merkitty kapea normaalivyöhyke, joka vastaa 12...14 sekunnin protrombiiniaikoja. Vihreällä värillä on merkitty vyöhyke, joka osoittaa antikoagulanttiannoksen haluttua vaiku- 10 59679 tusta. Tämä alue vastaa protrombiini-aktiviteettifunktion lisätukah-duttamista*

Edellä selitettyä menetelmää voidaan soveltaa veren ja plasman muidenkin hyytymisominaisuuksien mittaamiseksi,joista mainittakoon ko-konais-protrombiiniaika, protrombiinin kulutusaika, kaksivaiheinen protrombiinikoe, ja tekijöitä V, VIII ja ΣΧ koskevat kokeet. Lisäksi reaktioputkea voidaan käyttää reaktioissa, joissa herkkiä reagenssejä tarvitaan mikromäärin, ja halutaan kiinteä reaktioaika ennen kuin veren, plasman tai seerumin reaktiotuotteita tutkitaan spektrofotometri-sesti tai kolorimetrisesti.

Sopivasti vaihtelemalla reagenssien koostumusta ja soveltamalla tavanomaisia menetelmiä vastaavien analyysien suorittamiseksi voidaan selitetyntyyppistä laitetta käyttää erilaisiin mittauksiin ja kokeisiin, joista mainittakoon polymeroitumisreaktiot, proteolyyttisten entsyymien kokeet, urokinaasin aktiviteetti, fibrinogeenin valmistus ja veren henkilökohtaiset hyytymistekijät, samoin kuin mitkä tahansa muut mittaukset, jotka ammattimies helposti ymmärtää tästä selityksestä.

Tässä esimerkkinä esitettyjä putken tarkkoja mittoja ei ole pidettävä rajoittavina, vaan reaktioputkien mittoja voidaan vaihdella siten, että saavutetaan saatujen tietojen mikä tahansa haluttu diskriminointi eli erottelu ja tarkkuus. Jokaista käyttöä voidaan sopivasti vaihdella putken mittoja halutun virtausnopeuden perusteella.

Claims (17)

1 1 59679

1. Menetelmä sellaisen nesteen koaguloitumisnopeuden mittaamiseksi toistettavasti, jonka nesteen viskositeetti suurenee sen jälkeen, kun se on yhdistetty vähintään yhteen reagenssiin, joka kykenee muuttamaan näytteen viskositeettia, ja jonka menetelmän mukaan näyte sijoitetaan pitkänomaiseen putkeen, tunnettu siitä, että käytetään putkea, jonka sisähalkaisija on riittävän suuri tällaisen näytteen viskositeetin vaikutuksen poistamiseksi, sijoitetaan pieni määrä mainittua nestenäytettä mainitun putken yläpäähän, yhdistetään nestenäyte vähintään yhteen mainittuun reagenssiin, saatetaan putkessa oleva näyte painovoiman vaikutuksesta kannattamalla putkea yleisesti pystysuuntaisena liikkumaan alaspäin tässä putkessa valvottua laskeutumisliikettä suorittaen, ja mitataan aika, joka on tarpeen viskositeetin kasvattamiseksi siten, että näyte tulee liikkumattomaksi sen jälkeen, kun se on laskeutunut putken läpi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reagenssi esisekoitetaan mainittuun nestenäyttee-seen mainitun lisäysvaiheen aikana.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siihen sisältyy käsitellyn näytteen liikkeen valvonta, kunnes on saavutettu pääasiallisesti liikkumaton tila.

4. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen 1,2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu reagenssi on lyofiloitu ja sisältää tromhoplastiinia ja kalsium!; Ja että näyte on kokoverta tai plasmaa.

5. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reagenssi on lyfiloitun a tulppana, joka on sijoitettu putkeen lähelle sen sisäänmeno-päätä.

6. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reagenssi on sijoitettu välittömästi kalihrointimerkin alapuolelle, joka osoittaa sen näytteen tilavuutta, joka aikaisemmin on ruiskutettu putkeen.

7. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näytteen laskeutumis-nopeutta säädetään käyttämällä putken vastakkaisessa päässä olevaa rajoittavaa aukkoa. 12 59679

8. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä tunnett siitä, että kallistetaan putkea eri kulmiin pystyakseliin nähden näytteen laskeutumisnopeuden säätämiseksi.

9. Laite jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen 1- 8 mukaisen menetelmän toteuttamiseksi käsittäen putken, jossa on sisäinen huokoinen tulppa, tunnettu siitä, että reaktioputken sisähalkaisija on niin suuri, että saadaan pääasiallisesti kumotuksi nestenäytteen alkuperäisen viskositeetin vaikutukset, jossa putkessa on ensimmäinen avoyläpää, huokoinen tulppa, joka sisältää mainitun reagenssin ja joka sijaitsee tässä putkessa lähellä tätä ensimmäistä päätä, jolloin tämä putki on kalibroitu tämän yläpään alapuolella siten, että toistettavasti voidaan mitata nestenäytteen hyytymiseen tarvittava aika sen jälkeen, kun näyte on joutunut kosketukseen mainitun reagenssin kanssa, suorana funktiona siitä matkasta, jonka mainittuun yläpäähän sijoitettu nestenäyte laskeutuu reaktioputkessa ennen kuin se muuttuu liikkumattomaksi.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen laite, tunnettu siitä, että mainitussa ensimmäisessä yläpäässä on osa, joka kykenee vastaanottamaan näytteen ja yhdistämään tämän reagenssiin.

11. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen laite, tunnettu siitä, että siinä on kuristuskohta lähellä mainitun putken alapäätä.

12. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen 9» 10 tai 11 mukainen laite, tunnettu siitä, että putken sisäseinä-mässä on laskeutumisnopeutta säätävät ulkonemat.

15. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen 10 - 12 mukainen laite, tunnettu siitä, että putki on kalibroitu myös eri kaltevuuksiin pystyakseliin nähden.

14. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen 9-13 mukainen laite, tunnettu siitä, että putkessa on kalibrointi-merkki, joka osoittaa näytemäärän, jolla putki on täytettävä.

15· Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen 14 mukainen laite, tunnettu siitä, että mainitut kalibroinnit ovat merkittyjä vyöhykkeitä.

16. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen 13, 14 tai 15 mukainen laite, tunnettu siitä, että mainitut kalibroinnit ovat pitkin putken ulkoseinämää olevia asteikkomerkintöjä. i3 59679 PATENTKHAV