CN112526051B

CN112526051B - 一种Fmoc-赖氨酸高效液相色谱测定方法

Info

Publication number: CN112526051B
Application number: CN202011504705.9A
Authority: CN
Inventors: 徐红岩; 夏伟冬; 马敬祥
Original assignee: Shanghai Jifeng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Jifeng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2040-12-18
Also published as: CN112526051A

Abstract

本发明公开了一种Fmoc‑赖氨酸高效液相色谱测定方法，主要解决现有Fmoc‑赖氨酸色谱分析方法中流动相需要除菌处理导致操作繁琐的技术问题。本发明测定方法包括以下步骤：一，准备测量的试剂，二，样品的前处理；三，样品溶液配制；四，进行高效液相色谱测定，色谱仪为安捷伦1260色谱仪，采用DAD紫外检测器，安捷伦氨基色谱柱，流动相为质量百分浓度为0.1%TFA水溶液（A）和质量百分浓度为100%乙腈（B），通本发明为Fmoc‑赖氨酸系列检测领域提供了可靠便捷的检测手段。

Description

一种Fmoc-赖氨酸高效液相色谱测定方法

技术领域

本发明涉及一种Fmoc-赖氨酸高效液相色谱测定方法。

背景技术

Fmoc-赖氨酸含量测定，有一种比色分析法，需要用到茚三酮显色剂，而茚三酮显色剂在常温下不稳定，需要在冰箱中低温保存；其次，还需要标准赖氨酸溶液的制备，也有一定的保质期，分析中还用到722分光光度计，操作比较麻烦；也有Fmoc-赖氨酸含量高效液相色谱分析方法，用到流动相，需要加0.1%TEA溶液，而TEA溶液是由50mM三乙醇胺、0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-X-100）和氯化钠组成，属于HP缓冲液，使用时还要过滤除菌处理，操作比较麻烦。

发明内容

本发明提供了一种Fmoc-赖氨酸的高效液相色谱测定方法，主要解决现有Fmoc-赖氨酸色谱分析方法中流动相需要除菌处理导致操作繁琐的技术问题。该方法可用于Fmoc-赖氨酸含量的定性分析和定量测定，它不但简单、准确、可靠，而且可以在短时间内分析Fmoc-赖氨酸的HPLC 分析方法，

本发明采用了以下技术方案：一种Fmoc-赖氨酸高效液相色谱测定方法，包括以下步骤：

步骤一，准备测量的试剂，测量的试剂包括乙腈-色谱纯，乙醇、石油醚，超纯水；

步骤二，样品的前处理，反应液加饱和的氯化钠水溶液溶解，静止分层，水相再用乙酸乙酯萃取，有机相用盐水萃取，得到有机相中加入硅酸吸附，然后过滤、浓缩；浓缩样品再次用乙酸乙酯溶解，冷却析出固体样品；

步骤三、样品溶液的配制，称取试样置于棕色容量瓶中，加入乙腈，室温条件下采用超声波溶解，用乙腈定容，最后试样用聚丙烯有机滤膜过滤后进行HPLC分析，当样品中Fmoc-赖氨酸浓度过高/低时，重新配制标准曲线，使目标化合物落在新的标准曲线的线性范围内再进行仪器分析计算;

步骤四，进行高效液相色谱测定;色谱测定的的过程为：色谱条件为样品室温度为25 ℃，自动进样器进样体积为10 µL，色谱柱为：氨基色谱柱，优选安捷伦氨基色谱柱（Agilent ZORBAX SB phenyl） C18 (4.6mm ×250mm, 5.0μm)，柱温：30 ℃，流速：1.0 mL/min，流动相为质量百分浓度为0.1%TFA水溶液（A）和质量百分浓度为100%乙腈（B）采用梯度洗脱程序，0～2min，V(B)为50%；2～12 min，V(B)从50%到95%，12～12.1 min，V(B)从90% 到50% 的初始比例，12.1～15 min，V(B)从50% 平衡系统；通过对流动相酸度值的控制，不使Fmoc-赖氨酸在色谱柱中分解；即保留时间为7.283 min的色谱峰采集到了Fmoc-赖氨酸的主成份。

所述的液相色谱测定时采用的色谱仪为安捷伦 1260色谱仪，该色谱仪采用DAD检测器。

本发明具有以下有益效果：本发明方法操作简便、快速、准确，稳定性好，适用于一种Fmoc-赖氨酸的定性分析和定量检测，本发明在研究中发现，经过特定的样品前处理，可以使Fmoc-赖氨酸的样品在乙腈溶液中为澄清透明溶液。本发明在硅胶吸附时回收率就达到最大值，回收效果最好。本发明的样品室温度设定为25℃，有利于样品室温的保存，又和柱温箱的温度接近，有利于整个液相体系的平稳运行。

附图说明

图1为流动相A:B=质量百分浓度0.1%三氟乙酸水溶液: 质量百分浓度0.1%三氟乙酸乙腈的色谱图。

图2.为流动相A:B=质量百分浓度0.1%三氟乙酸水溶液: 质量百分浓度100%乙腈谱图。

图3为流动相A:B=质量百分浓度100%水: 质量百分浓度100%乙腈色图谱。

图4为Fmoc-赖氨酸的线性范围、线性方程、相关系数图。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明的测定过程。

实验部分

1.1 主要仪器

安捷伦1260型高效液相色谱仪，配有DAD检测器，Agilent ZORBAX SB phenyl C18色谱柱，Agilent ZORBAX SB phenyl C18色谱柱的尺寸为4.6mm ×250mm, 5.0μm)；超声波提取仪(KQ5200E，郑州科泰实验设备有限公司)，0.22 μm聚丙烯有机滤膜（上海安谱科学仪器有限公司），电子分析天平（CPA225D，赛多利斯科学仪器（上海）有限公司）。

主要试剂

测量的试剂包括乙腈-色谱纯，乙醇、石油醚，电阻率为18.2 MΩ.cm的超纯水，色谱纯为乙腈

乙腈（色谱纯，德国Merck公司），三氟乙酸、 (色谱纯，阿拉丁公司)，石油醚、乙酸乙酯(分析纯，阿拉丁公司)；超纯水( 电阻率18.2 MΩ.cm，美国屈层氏)。

标准溶液的配制

准确称取Fmoc-赖氨酸的标准品0.010 g，用乙腈溶解至10 mL 棕色容量瓶中并定容，摇匀，配制成1000 mg/L的标准储备溶液，于25℃密封保存。

样品的前处理

称取Fmoc-赖氨酸试样约0.5g，置于50 mL棕色容量瓶中，加入20-30 mL乙腈，室温条件下超声波溶解3 min，用乙腈定容至50 mL。最后试样用0.22 µm聚丙烯有机滤膜过滤后进行HPLC分析，当样品中Fmoc-赖氨酸峰过低时，重新配制标准曲线，使目标化合物落在新的标准曲线的线性范围内再进行仪器分析计算。

分析条件

1.5.1 色谱条件：

样品室温度为25 ℃，自动进样器进样体积为10 µL，色谱柱为：Agilent ZORBAXSB phenyl C18色谱柱的尺寸为4.6mm ×250mm, 5.0μm，柱温：30 ℃，流速：1.0mL/min，流动相为质量百分浓度0.1%TFA水溶液（A）和质量百分浓度100%乙腈（B）；采用梯度洗脱程序，0～2min，V(B)为50%；2～12 min，V(B)从50%到95%，12～12.1 min，V(B)从90% 到50% 的初始比例，12.1～15 min，V(B)从50% 平衡系统；标准品的色谱见图3，实际样品的色谱图附图2。通过峰面积对比进行定量，即保留时间为7.283 min的色谱峰。

结果与讨论

2.1 样品前处理方法的选择与优化

目前在市场上的Fmoc-赖氨酸种类繁多，一般Fmoc-赖氨酸为固体晶型，本发明所测定的Fmoc-赖氨酸是直接从市场购买，根据相似相容原理，在进行样品的提取时一般使用甲醇、丙酮、二氯乙烷等有机溶剂。从Fmoc-赖氨酸的实际情况，本发明还试验了水作为萃取剂，本发明在Fmoc-赖氨酸反应液中加入60ml饱和的氯化钠水溶液溶解，静止30分钟分层，水相再用乙酸乙酯萃取二次，首先，选用乙酸乙酯作为萃取剂，研究表明萃取Fmoc-赖氨酸样品是有大量泡沫，回收率较低（10-35 %）。有机相再用40ml（pH=5水溶液）盐水萃取二次（回收率88-92 %），得到有机相中加入硅酸100克吸附，20分钟后过滤、浓缩（回收率80-85%）；浓缩样品再次用乙酸乙酯溶解，冷却析出固体样品；

随后，针对实际样品，本发明又进行了超声提取5 min后，用离心机以 5000 r/min离心10min，和超声后不离心对检测结果的比较，发现两种方法对检测的目标化合物的检测几乎没有影响。故本实验采用直接萃取过滤、吸附、浓缩、冷却的简便方法。

仪器条件的优化

2.2.1 色谱条件的优化

本发明在选择时分别对水-甲醇、水-乙腈、质量百分浓度0.1%三氟乙酸水溶液-质量百分浓度0.1%三氟乙酸乙腈、质量百分浓度0.1%三氟乙酸水溶液-质量百分浓度100%乙腈作为流动相时的分离效果进行了比较。采用水-甲醇、水-乙腈体系时发现，色谱峰形不对称，容易拖尾；采用质量百分浓度0.1%三氟乙酸水溶液-0.1%三氟乙酸乙腈体系时化合物会出现分解，峰面积或者峰高都小于质量百分浓度0.1%三氟乙酸水溶液（A相）-质量百分浓度100%乙腈（B相）体系，见图1。几种淋洗体系的对比结果表明，采用质量百分浓度0.1%三氟乙酸水溶液（A相）-质量百分浓度100%乙腈（B相）作为流动相时无论是分离度、灵敏度还是目标化合物的峰型、化合物的分解性都优于其他淋洗体系。故本实验采用质量百分浓度0.1%三氟乙酸水溶液（A相）-质量百分浓度100%乙腈（B相）作为淋洗液，梯度淋洗进行色谱分离。

本发明在选择色谱柱时还比较了WatersPuresil C18 (4.6mm×150mm, 5.0 μm)色谱柱和Agilent ZORBAX SB phenyl-C18 （4.6 mm×150 mm, 4.0 μm) 与AgilentZORBAX SB phenyl C18 （4.6mm ×250mm, 5.0μm），实验结果表明前两种色谱柱也能使峰分离，但是半峰宽较大，而AgilentZORBAX SB phenyl C18 （4.6mm ×250mm, 5.0μm）色谱柱能够使赖氨酸的主峰与杂质完全分离、峰对称且峰较窄，可降低目标化合物的检测限。故本发明采用AgilentZORBAX SB phenyl C18 （4.6mm ×250mm, 5.0μm）色谱柱。

本发明的样品室温度设定为25℃，有利于样品室中乙腈溶剂的保存，又和柱温箱的温度接近，有利于整个液相体系的平稳运行。本发明中设定柱温箱温度为30℃，当控制柱温箱温度为40℃时发现目标化合物的半峰宽变大，峰高下降，不利于检测，当温度设定为20℃时化合物与杂质的峰略微有重合，故最终设定柱温箱为30℃。

线性范围

采用不含Fmoc-赖氨酸的乙腈为空白基质，添加不同体积的浓度标准溶液配成450mg/L、900mg/L、1350mg/L、1700mg/L、2250mg/L按照上述色谱条件进行测定，以组分的质量浓度（x，µg/L）为横坐标，相应的质谱峰峰面积（y）为纵坐标得标准曲线。图4结果表明：化合物在一定范围内线性关系良好。

2.4 精密度和回收率

为对本发明的精密度和回收率进行比较，选择Fmoc-赖氨酸回收，24小时内，按照上述方法进行测定，每个浓度水平单独测定2次，回收率及相对标准偏差列于表1。由表1可知，Fmoc-赖氨酸回收率97.8%-100.2 %，相对标准偏差0.9-1.5%，说明该方法对Fmoc-赖氨酸有较好的回收率及重复性，能满足实际样品的分析要求。

表1

。

2.5 实际样品的测定

采用本方法对本单位研发的Fmoc-赖氨酸样品进行检测结果表明，本方法快速、准确、灵敏度高、选择性好，检测周期短，具有实际应用价值。

3 结论

本发明建立了一种测定Fmoc-赖氨酸含量的高效液相色谱法。该方法操作简便、快速、准确，稳定性好，适用于Fmoc-赖氨酸的定性分析和定量检测。为我国氨基酸之一的Fmoc-赖氨酸检测提供一种新的方法，具有积极意义。

Claims

1.一种Fmoc-赖氨酸高效液相色谱测定方法；其特征是；包括以下步骤：

步骤二，样品的前处理，反应液加饱和的氯化钠水溶液溶解，静止分层，水相再用乙酸乙酯萃取二次，有机相再用盐水萃取二次，得到有机相中加入硅酸吸附，然后过滤、浓缩；浓缩样品再次用乙酸乙酯溶解，冷却析出固体样品；

步骤三、样品溶液的配制，称取试样置于棕色容量瓶中，加入乙腈，室温条件下采用超声波溶解，用乙腈定容，最后试样用聚丙烯有机滤膜过滤后进行HPLC分析，当样品中Fmoc-赖氨酸浓度过高/低时，重新配制标准曲线，使目标化合物落在新的标准曲线的线性范围内再进行仪器分析计算；

步骤四，进行高效液相色谱测定;色谱测定的的过程为：色谱条件为样品室温度为25℃，自动进样器进样体积为10 µL，色谱柱为：安捷伦氨基色谱柱 C18，色谱柱的尺寸为4.6mm ×250mm, 5.0μm，柱温：30 ℃，流速：1.0 mL/min，流动相为质量百分浓度为0.1%TFA水溶液（A）和质量百分浓度为100%乙腈（B）采用梯度洗脱程序，0～2min，V(B)为50%；2～12min，V(B)从50%到95%，12～12.1 min，V(B)从90% 到50% 的初始比例，12.1～15 min，V(B)从50% 平衡系统；通过对流动相酸度值的控制，不使Fmoc-赖氨酸在色谱柱中分解；即保留时间为7.283 min的色谱峰采集到了Fmoc-赖氨酸的主成份。

2.根据权利要求1所述的一种Fmoc-赖氨酸高效液相色谱测定方法，其特征是：所述的液相色谱测定时采用安捷伦 1260 液相色谱仪，该色谱仪采用DAD为检测器。