JP2014037995A - 皮膚感作性測定試薬 - Google Patents
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Abstract
【課題】簡易な分析装置により測定が可能な皮膚感作性測定試薬の提供。
【解決手段】アミノ基を１個以上有する構造を有する有機化合物であって紫外、可視光又は近赤外域に吸収を有する有機化合物（Ｎ−（２−フェニルアセチル）リジン又はＮ−[２−(ナフタレン−１−イル)アセチル]リジンなど）を測定主薬として含む皮膚感作性測定試薬。
【選択図】なし
【解決手段】アミノ基を１個以上有する構造を有する有機化合物であって紫外、可視光又は近赤外域に吸収を有する有機化合物（Ｎ−（２−フェニルアセチル）リジン又はＮ−[２−(ナフタレン−１−イル)アセチル]リジンなど）を測定主薬として含む皮膚感作性測定試薬。
【選択図】なし
Description
本発明は、皮膚感作性測定試薬に関する。
医薬、農薬、及び化粧品等の製品に含まれる化学物質はアレルギー反応を引き起こさない物質であることが肝要であり、製品開発に当っては、使用する化学物質の皮膚感作性を確認する必要がある。皮膚感作性の測定として最終的には、Maximization試験、Buehler試験、Local Lymph Node Assay等の動物実験による試験結果が必要となる。
また、動物実験を行うことなく、被験物質の皮膚感作性を簡便かつ迅速に検定する方法として、システインペプチドやリジンペプチド（非特許文献１）およびグルタチオンを用いた皮膚感作試験などが提案されている（特許文献１及び２）。さらに、システイン残基を有する芳香族化合物を利用した方法によって、HPLC-UV法において高感度に検出できる方法が提案されている（特許文献３）。
G.F.Gerberick et al., Quantification of Chemical Peptide Reaction for Screening Contact Allergens: A Classification Tree Model Approach,Toxicol. Sci., 97(2), 417-427:2007.
上記したような皮膚感作性の測定のための動物実験は煩雑な作業や、多大の時間を必要とすると共に、動物倫理の観点から動物実験は最小限に留めるべきであり「動物の愛護及び管理に関する法律」ならびに関係法令を遵守する意味でも動物実験の削減が急務である。そのため、開発初期段階等において、動物を使用せず簡便かつ迅速な方法で化学物質の皮膚感作性を測定できる手段が求められている。また、システインペプチドやリジンペプチド（非特許文献１）およびグルタチオンを用いた皮膚感作試験（特許文献１及び２）については、これらの試験で用いることができる検出方法としてHPLC-UV法では極めて低感度であり、高感度測定法としては質量分析法に限られるという問題があった。
本発明の目的は、疎水性の化学物質及び／またはシステイン残基との反応が低い化学物質の皮膚感作性を簡便かつ迅速に測定するための試薬及び方法を提供することである。また、本発明の目的は、簡易な分析装置により、疎水性の化学物質及び／またはシステイン残基との反応が低い化学物質でも測定が可能な皮膚感作性測定試薬及び皮膚感作性の測定方法を提供することである。
本発明者らは、簡易な分析装置により検出可能な化合物を皮膚感作性測定試薬として用いることが上記課題の解決手段になりうると考え、鋭意研究の結果、本発明の完成に至った。
すなわち、本発明によれば、アミノ基を１個以上有する有機化合物であって、紫外、可視光又は近赤外域に吸収極大を有し、吸収極大波長におけるモル吸光係数（L/mol・cm）が10以上500000以下の有機化合物を測定主薬として含む皮膚感作性測定試薬が提供される。
好ましくは、有機化合物はε−アミノ基および芳香族基を有するリジンの誘導体である。
好ましくは、有機化合物はα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンである。
好ましくは、有機化合物はα−Ｎ−（２−フェニルアセチル）リジン又はα−Ｎ−[２−(ナフタレン−１−イル)アセチル]リジンである。
好ましくは、有機化合物はα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンである。
好ましくは、有機化合物はα−Ｎ−（２−フェニルアセチル）リジン又はα−Ｎ−[２−(ナフタレン−１−イル)アセチル]リジンである。
好ましくは、本発明の試薬は、粉末形態である。
好ましくは、有機化合物は、有機酸塩類を含む水性緩衝液もしくは水又はこれらと有機溶媒との混合溶媒に溶解した形態である。
好ましくは、有機化合物の濃度は0.1mM〜500mＭである。
好ましくは、有機化合物は、有機酸塩類を含む水性緩衝液もしくは水又はこれらと有機溶媒との混合溶媒に溶解した形態である。
好ましくは、有機化合物の濃度は0.1mM〜500mＭである。
本発明によればさらに、（１）アミノ基を１個以上有する構造を有する有機化合物であって紫外、可視光又は近赤外域に吸収極大を有し、吸収極大波長におけるモル吸光係数（L/mol・cm）が10以上500000以下の有機化合物と被験物質とを反応させること、及び、
（２）反応による有機化合物の量の低下を光学的測定により検出することを含む皮膚感作性の測定方法が提供される。
（２）反応による有機化合物の量の低下を光学的測定により検出することを含む皮膚感作性の測定方法が提供される。
本発明によればさらに、（１）アミノ基を１個以上有する構造を有する有機化合物であって紫外、可視光又は近赤外域に吸収極大を有し、吸収極大波長におけるモル吸光係数（L/mol・cm）が10以上500000以下の有機化合物と被験物質とを反応させること、及び、
（２）反応により生じた化合物を光学的測定により検出することを含む皮膚感作性の測定方法が提供される。
（２）反応により生じた化合物を光学的測定により検出することを含む皮膚感作性の測定方法が提供される。
上記の方法において、好ましくは、有機化合物はα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンである。
上記の方法は、好ましくは、工程（１）で得られる反応物をクロマトグラフィー処理することを含む。
上記の方法は、好ましくは、工程（１）で得られる反応物をクロマトグラフィー処理することを含む。
本発明により、疎水性の化学物質及び／またはシステイン残基との反応が低い化学物質についても、汎用の簡易な分析装置を用いて測定することが可能な皮膚感作性測定試薬が提供される。本発明の試薬により化学物質の皮膚感受性を簡便かつ迅速に測定することができる。
本明細書において、「〜」とはその前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用される。
本明細書において皮膚感作性の測定とは皮膚感作性の検定を含む意味であり、また、一定の基準の皮膚感作性の有無の判断、及び皮膚感作性の定量的測定を含む意味である。
本明細書において皮膚感作性の測定とは皮膚感作性の検定を含む意味であり、また、一定の基準の皮膚感作性の有無の判断、及び皮膚感作性の定量的測定を含む意味である。
本発明の皮膚感作性測定試薬に含まれる有機化合物は、アミノ基を有するため、システイン残基との反応が低い皮膚感作性物質とも反応性を有し、高いモル吸光係数を有するため、汎用の簡易な分析装置を用いて測定すること可能であり、疎水性の化学物質を溶解させるために用いられる有機溶媒比率の高い反応液においても十分な溶解度および安定性を有する。したがって、本発明の皮膚感作性測定試薬により、疎水性及び／またはシステイン残基との反応が低い化学物質についても、汎用の簡易な分析装置を用いて測定することが可能となる。
本発明の皮膚感作性測定試薬に含まれる有機化合物はそのままの状態、又は溶液状態で、好ましくは、波長１９０〜２５００ｎｍの領域で吸収を示す化合物であり、さらに好ましくは、波長２００〜７００ｎｍの領域に吸収を示す化合物である。さらに、該波長領域に吸収極大を有する化合物が好ましい。また、本発明の皮膚感作性測定試薬に含まれる有機化合物は、吸収極大波長におけるモル吸光係数（L/mol・cm）が10以上500000以下である化合物であり、好ましくは、吸収極大波長におけるモル吸光係数（L/mol・cm）が１０〜２０００である化合物であり、さらに好ましくは、吸収極大波長におけるモル吸光係数が１００〜２０００である化合物である。特に好ましくは、波長２００〜７００ｎｍの領域に吸収極大を有し、吸収極大波長におけるモル吸光係数が１００〜２０００である化合物である。
なおモル吸光係数（ε）は下記式で与えられる。
ε＝Ｄ／（ｃ・ｄ）
ここで、Ｄは溶液の吸光度を表し、ｃは溶質のモル濃度（mol／ｌ）、ｄは溶液層の厚さ（光路長）（ｃｍ）を表す。モル吸光係数は、市販の分光光度計を用いて吸収スペクトル又は吸光度を測定することにより求めることができる。
ε＝Ｄ／（ｃ・ｄ）
ここで、Ｄは溶液の吸光度を表し、ｃは溶質のモル濃度（mol／ｌ）、ｄは溶液層の厚さ（光路長）（ｃｍ）を表す。モル吸光係数は、市販の分光光度計を用いて吸収スペクトル又は吸光度を測定することにより求めることができる。
本発明の皮膚感作性測定試薬に含まれる有機化合物は被検物質との反応性の観点で１級アミノ基を有することが好ましく、ε−アミノ基を有するリジン誘導体であることがより好ましい。リジンの誘導体として、リジンのカルボキシル基および／またはα−アミノ基が少なくとも一つの置換基によって修飾されたリジン誘導体が挙げられる。
本発明では、該置換基とは特に限定されない。
本発明では、該置換基とは特に限定されない。
本発明の皮膚感作性測定試薬に含まれる有機化合物は芳香族基を有することが好ましい。芳香族基としてはフェニル基、ナフチル基などの炭化水素系芳香族基のほか、ピリジル基、フリル基、チオフェニル基などのヘテロ元素を有するものであってもよい。芳香族基としてはフェニル基およびナフチル基が好ましい。
本発明の皮膚感作性測定試薬に含まれる有機化合物としては例えば、ε−アミノ基および芳香族基を有するリジンの誘導体が挙げられる。
本発明の皮膚感作性測定試薬に含まれる有機化合物として、さらに具体的には、リジンのα-アミノ基又はカルボキシル基にアミド結合などによりベンゼン環やナフタレン環などのアリール基を結合させた化合物が挙げられる。このうち、Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンが特に好ましい。Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンにおいて、アリール基は炭素数６〜１６程度であればよい。アリール基として、ベンゼン環、ナフタレン環などが挙げられる。またアルキルカルボニル基における炭素数は２〜１１程度であればよい。カルボニル基に結合するアルキル基は直鎖状、分岐鎖状、環状のいずれでもよく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ヘキシル基、へプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、２−エチルヘキシル基、シクロプロピル基などを挙げることができる。本発明の皮膚感作性測定試薬に含まれる有機化合物としての具体例としては、Ｎ−（２−フェニルアセチル）リジン（以下PAL）、及びＮ−[２−(ナフタレン−１−イル)アセチル]リジン（NAL）が挙げられる。
本発明の皮膚感作性測定試薬に含まれる有機化合物は公知の方法に準じて製造することが可能であり、例えば、PALおよびNALは以下のように合成することができる。
ε-N-Boc-リジン5.0ｇ、水酸化ナトリウム1.6ｇ、水20ｍLの溶液を氷水にて冷却した。この溶液にフェニルアセチルクロリド2.9ｍLを滴下した。氷冷下2時間撹拌後、さらに水酸化ナトリウム0.2ｇとフェニルアセチルクロリド0.3ｍLを添加した。室温下2時間撹拌した後、反応混合物に濃塩酸1.8ｍLと水10ｍLの混合物を滴下した。析出した結晶を濾取し、水で洗浄した。得られた結晶を水30ｍLから再結晶し、濾取、乾燥し、ε-N-Boc-α-N-フェニルアセチルリジン5.6ｇを得た。
上記で得たε-N-Boc-α-N-フェニルアセチルリジン5.4ｇとジクロロメタン35ｍLの混合物に室温下、トリフルオロ酢酸22ｍLを加えた。室温下2時間撹拌した後、減圧下に溶媒を留去した。残渣に水22ｍLを加え、不溶物を濾去した後、濾液に20％水酸化ナトリウム水溶液を加えｐHを約6にした。氷冷下、1時間撹拌した後、析出した結晶を濾取、水洗、乾燥しPALを3.2ｇ得た。
1H-NMR（DMSO-ｄ6+DCl）データ：δ7.98(br.s, 3H)，7.36-7.14(m, 5H)，4.16(m, 1H)，3.92(br.s, 2H)，2.70(br.dd, 2H)，1.80-1.42(m, 4H)，1.35(m, 2H)
吸収極大波長は、およそ255nm付近に存在し、モル吸光係数はおよそ200（L/mol・cm）程度であった。
1H-NMR（DMSO-ｄ6+DCl）データ：δ7.98(br.s, 3H)，7.36-7.14(m, 5H)，4.16(m, 1H)，3.92(br.s, 2H)，2.70(br.dd, 2H)，1.80-1.42(m, 4H)，1.35(m, 2H)
吸収極大波長は、およそ255nm付近に存在し、モル吸光係数はおよそ200（L/mol・cm）程度であった。
1-ナフチル酢酸5.6ｇ、N,N-ジメチルホルムアミド1滴、トルエン30ｍLの混合物に塩化チオニル6.5ｍLを室温下に滴下した。混合物を60℃に加熱し2時間撹拌した。減圧下に揮発分を留去し、次の反応に用いた。
ε-N-Boc-リジン5.0ｇ、水酸化ナトリウム0.8ｇ、水20ｍLの溶液を氷水にて冷却した。この溶液に、上記で得た1-ナフチルアセチルクロリド4.9ｇと10％水酸化ナトリウム水溶液を反応液のpHが約11となるように滴下した。室温下4時間撹拌を続けた後、濃塩酸1.6ｍLを添加した。反応混合物を熱酢酸エチルにて抽出し、抽出液を室温に冷却した。析出した結晶を濾取、乾燥し、ε-N-Boc-α-N-(1-ナフチル)アセチルリジン6.1ｇを得た。
ε-N-Boc-リジン5.0ｇ、水酸化ナトリウム0.8ｇ、水20ｍLの溶液を氷水にて冷却した。この溶液に、上記で得た1-ナフチルアセチルクロリド4.9ｇと10％水酸化ナトリウム水溶液を反応液のpHが約11となるように滴下した。室温下4時間撹拌を続けた後、濃塩酸1.6ｍLを添加した。反応混合物を熱酢酸エチルにて抽出し、抽出液を室温に冷却した。析出した結晶を濾取、乾燥し、ε-N-Boc-α-N-(1-ナフチル)アセチルリジン6.1ｇを得た。
上記で得たε-N-Boc-α-N-(1-ナフチル)アセチルリジン5.9ｇとジクロロメタン35ｍLの混合物に室温下、トリフルオロ酢酸22ｍLを加えた。室温下1.5時間撹拌した後、減圧下に溶媒を留去した。残渣に水20ｍLを加え、さらに20％水酸化ナトリウム水溶液を加えｐHを約6にした。酢酸エチル50ｍLで抽出後、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、得られた目的物をメタノール/酢酸エチルから再結晶した。乾燥後NALを0.5ｇ得た。融点239〜240℃。
1H-NMR（DMSO-ｄ6）データ：δ8.56（ｄ, 1H)，8.10(m, 1H)，7.94(m, 1H)，7.81(m, 1H)，7.76(brs., 2H)，7.58-7.49(m, 2H)，7.52-7.38(m, 2H)，4.20(m, 1H)，3.98(s, 2H)，2.75(br.dd, 2H)，1.81-1.58(m, 2H)，1.53(m, 2H)，1.36(m, 2H)
吸収極大波長は、およそ280nm付近に存在し、モル吸光係数はおよそ400（L/mol・cm）程度であった。
1H-NMR（DMSO-ｄ6）データ：δ8.56（ｄ, 1H)，8.10(m, 1H)，7.94(m, 1H)，7.81(m, 1H)，7.76(brs., 2H)，7.58-7.49(m, 2H)，7.52-7.38(m, 2H)，4.20(m, 1H)，3.98(s, 2H)，2.75(br.dd, 2H)，1.81-1.58(m, 2H)，1.53(m, 2H)，1.36(m, 2H)
吸収極大波長は、およそ280nm付近に存在し、モル吸光係数はおよそ400（L/mol・cm）程度であった。
本発明の皮膚感作性測定試薬は、上記の有機化合物のみからなるものであってもよく、測定主薬である上記の有機化合物のほかに１又は２以上の添加剤を含んでいるものであってもよい。添加剤の例としては、ｐＨ調整剤、安定化剤、等が挙げられる。また、本発明の皮膚感作性測定試薬は、上記の測定主薬及び必要に応じて上記の添加剤を、水、水性緩衝液、有機溶媒、又はこれらいずれかの混合溶媒等に溶解させたものであってもよい。
本発明の皮膚感作性測定試薬は、溶液、液体状、固体状（粉末、顆粒、凍結乾燥物、錠剤等）のいずれの形態で提供されてもよい。
本発明の皮膚感作性測定試薬は、溶液、液体状、固体状（粉末、顆粒、凍結乾燥物、錠剤等）のいずれの形態で提供されてもよい。
本発明の皮膚感作性測定試薬は、例えば、酢酸アンモニウムなどの有機酸塩類またはリン酸塩などの無機塩類を含む水性緩衝液もしくは水又はこれらと有機溶媒との混合溶媒に溶解した形態で、例えば約0.01μＭ〜約1Ｍ程度、通常約0.1mM〜約500mＭ程度の上記有機化合物の濃度として使用すればよい。被験物質は、例えば、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトンなどの有機溶媒又はこれらの混合溶媒に、例えば約0.01μＭ〜約１Ｍ程度の濃度、通常約0.1mＭ〜約500mＭ程度の濃度となるように溶解すればよい。次いで、本発明の皮膚感作性測定試薬の測定主薬である上記有機化合物と被験物質溶液とを、上記有機化合物と被験物質のモル濃度比が例えば1：100〜10：1となるように混合し反応させればよい。反応は、上記有機化合物と被験物質とを含む溶液を、例えば約4℃〜約60℃程度の温度範囲にて保温しながら、通常約1分〜約2日間程度攪拌又は静置することによって行うことができる。
上記反応により、上記有機化合物と被験物質との反応性を調べることによって、被験物質の皮膚感作性を測定することができる。上記の反応性を調べるためには、皮膚感作性測定試薬溶液と被験物質溶液との混合液中における上記有機化合物の残存量および／又は上記有機化合物と被験物質との反応生成物の生成量を分析すればよい。この分析を経時的に行うことにより、上記有機化合物と被験物質との反応速度定数を求め、異なる被験物質の反応速度定数を比較することや、被験物質の反応速度定数を動物実験により皮膚感作性の有無や強度が確認されている化合物について求めた反応速度定数と比較することにより、被験物質の皮膚感作性を評価することができる。
なお、残存量を分析する場合、皮膚感作性測定試薬は反応液中で何らかの変化を起こす可能性がある場合は、必要に応じて被験物質のみを含まない反応液（コントロール群）を別途用意して分析を行い、この反応液中の残残量の値を元にして補正しても良い。
化合物および上記反応により生成した化合物の分析方法としては、特に限定されないが、例えば、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、ガスクロマトグラフィー（GC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）などにより、上記反応により生成した化合物、上記有機化合物及び被験物質を分離して分析する方法が挙げられる。上記HPLC、GC又はTLCに用いることのできるクロマトグラフ手法としては、逆相、順相、イオン交換などを挙げることができる。このようなクロマトグラフ手法に使用可能な市販のカラムやTLCとしては、例えば、LCカラムとしてはCAPCELL-PAK（資生堂製）、L-column ODS（化学品評価研究機構製）、Shodex Asahipak （昭和電工製）などを挙げることができ、TLCプレートではシリカゲル60F254（メルク社製）、Silica Gel Plate（ナカライテスク社製）などを挙げることができる。
上記反応により生成した化合物又は残存する上記有機化合物の検出方法は、特に限定されないが、例えば上記HPLC分析で利用することのできる検出器としては、紫外可視検出器、近赤外検出器、蛍光検出器、示差屈折率検出器、電気伝導度検出器、蒸発光散乱検出器などが挙げられる。紫外可視検出器としては、例えば、単波長紫外可視検出器、二波長紫外可視検出器、フォトダイオードアレイ検出器などが挙げることができる。また、このような検出法に使用可能な市販の検出器としては、紫外可視検出器、示差屈折率検出器、電気伝導度検出器の場合、島津製作所製、日立製作所製、ウォーターズ製、資生堂製などの検出器、蒸発光散乱検出器としては島津製作所製などが挙げられる。
本発明の皮膚感作性測定試薬を用いた測定方法における検出は、上記に限定されず、例えば、特開2003-14761号公報又は特開2008-139275号公報に記載の方法を参照して、分子量等に基づく、特定の質量のイオン検出により行ってもよい。
また、本発明の皮膚感作性測定試薬を用いた方法においては、好ましくは光学的検出方法を用いることができる。好ましくは、上述の紫外可視検出器、近赤外検出器を用いるとよい。
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
試験例１：HPLC-UVの検出感度
（１）NALについて（本発明）
[NAL溶液の調製]
NAL（分子量314.38）を39.3 mg秤量して、100mM酢酸アンモニウム水溶液（pH=10.2）を加えて溶解し、100 mlに定容した（1.25 mM溶液）。
（１）NALについて（本発明）
[NAL溶液の調製]
NAL（分子量314.38）を39.3 mg秤量して、100mM酢酸アンモニウム水溶液（pH=10.2）を加えて溶解し、100 mlに定容した（1.25 mM溶液）。
［標準溶液調製方法］
1ml用バイアル瓶に上記の1.25mMの NAL溶液（pH＝10.2）400μlと酢酸アンモニウム溶液（pH＝10.2）250μlとを混合し、さらにアセトニトリルを350μlを添加して撹拌した。この混合液を15μl分取して、蒸留水／アセトニトリル＝75/25（0.1%トリフルオロ酢酸含有）溶液を135μl添加して混合した後に、下記条件にてHPLCに供した。
1ml用バイアル瓶に上記の1.25mMの NAL溶液（pH＝10.2）400μlと酢酸アンモニウム溶液（pH＝10.2）250μlとを混合し、さらにアセトニトリルを350μlを添加して撹拌した。この混合液を15μl分取して、蒸留水／アセトニトリル＝75/25（0.1%トリフルオロ酢酸含有）溶液を135μl添加して混合した後に、下記条件にてHPLCに供した。
[HPLC測定条件]
装置：LC-20AD（島津製作所製）
カラム：Zorbax SB-C18（2.0×100 mm）
カラム温度：40℃
流速：0.2 ml/min.
検出波長：220 nm
溶離液A：蒸留水／アセトニトリル＝98／2（0.1%トリフルオロ酢酸）
溶離液B：アセトニトリル／蒸留水＝90/10（0.1%トリフルオロ酢酸）
溶出条件：下記グラジエント
装置：LC-20AD（島津製作所製）
カラム：Zorbax SB-C18（2.0×100 mm）
カラム温度：40℃
流速：0.2 ml/min.
検出波長：220 nm
溶離液A：蒸留水／アセトニトリル＝98／2（0.1%トリフルオロ酢酸）
溶離液B：アセトニトリル／蒸留水＝90/10（0.1%トリフルオロ酢酸）
溶出条件：下記グラジエント
注入量：10μl
分析時間：15分間
分析時間：15分間
（２）Lys-P について（比較例）
[Lys-P溶液の調製]
非特許文献１（G.F.Gerberick et al., Toxicol. Sci., 97(2), 417-427:2007）に記載されたリジンペプチド（Ac-Arg-Phe-Ala-Ala-Lys-Ala-Ala-COOH：以下Lys-P）（分子量775.91）を24.2 mg秤量して、100mM酢酸アンモニウム水溶液（pH=10.2）を加えて溶解し、25mlに定容した（1.25 mM溶液）。
[Lys-P溶液の調製]
非特許文献１（G.F.Gerberick et al., Toxicol. Sci., 97(2), 417-427:2007）に記載されたリジンペプチド（Ac-Arg-Phe-Ala-Ala-Lys-Ala-Ala-COOH：以下Lys-P）（分子量775.91）を24.2 mg秤量して、100mM酢酸アンモニウム水溶液（pH=10.2）を加えて溶解し、25mlに定容した（1.25 mM溶液）。
［標準溶液調製方法］
上記の1.25mM Lys-P溶液（pH＝10.2）400μlと酢酸アンモニウム溶液（pH＝10.2）250μlとを混合し、さらにアセトニトリルを350μlを添加して撹拌した。この混合液を15μl分取して、蒸留水／アセトニトリル＝75/25（0.1%トリフルオロ酢酸含有）溶液を135μl添加して混合した後に以下に記載の条件にてHPLCに供した。
上記の1.25mM Lys-P溶液（pH＝10.2）400μlと酢酸アンモニウム溶液（pH＝10.2）250μlとを混合し、さらにアセトニトリルを350μlを添加して撹拌した。この混合液を15μl分取して、蒸留水／アセトニトリル＝75/25（0.1%トリフルオロ酢酸含有）溶液を135μl添加して混合した後に以下に記載の条件にてHPLCに供した。
[HPLC測定条件]
上記の（１）NALについての場合と同じ。
上記の（１）NALについての場合と同じ。
（３）測定結果
各クロマトグラムは、図１に示す。Lys-Pを最も感度高く検出できる波長220nmでピークを確認した結果、50μMのピーク面積は299569（μV・sec）であり、この波長におけるNALの50μMのピーク面積は4074389（μV・sec）であった。220nmにおける感度比較では、NALはLys-Pに比べて14倍高感度に検出できることがわかった。
各クロマトグラムは、図１に示す。Lys-Pを最も感度高く検出できる波長220nmでピークを確認した結果、50μMのピーク面積は299569（μV・sec）であり、この波長におけるNALの50μMのピーク面積は4074389（μV・sec）であった。220nmにおける感度比較では、NALはLys-Pに比べて14倍高感度に検出できることがわかった。
試験例２：アルデヒド化合物の評価
[被験物質]
感作性化合物として以下の３化合物を使用して、以下に記載の方法に従って皮膚感作性の測定を行った。
（感作性化合物）
化合物A：グルタルアルデヒド（皮膚感作性：強度）（分子量100.12）
化合物B：フタル酸無水物（皮膚感作性：強度）（分子量148.12）
化合物C：トリメリット酸無水物（皮膚感作性：強度）（分子量192.13）
上記の皮膚感作性は、前述の非特許文献１（G.F.Gerberick et al., Toxicol. Sci., 97(2), 417-427:2007）に記載されたLLNA試験（マウスを用いた試験）による評価結果である。
[被験物質]
感作性化合物として以下の３化合物を使用して、以下に記載の方法に従って皮膚感作性の測定を行った。
（感作性化合物）
化合物A：グルタルアルデヒド（皮膚感作性：強度）（分子量100.12）
化合物B：フタル酸無水物（皮膚感作性：強度）（分子量148.12）
化合物C：トリメリット酸無水物（皮膚感作性：強度）（分子量192.13）
上記の皮膚感作性は、前述の非特許文献１（G.F.Gerberick et al., Toxicol. Sci., 97(2), 417-427:2007）に記載されたLLNA試験（マウスを用いた試験）による評価結果である。
（１）NALについて（本発明）
[NAL溶液調製]
NAL（分子量314.38）を39.3 mg秤量して、100mM酢酸アンモニウム水溶液（pH=10.2）を加えて溶解し、100 mlに定容した（1.25 mM溶液）。
[NAL溶液調製]
NAL（分子量314.38）を39.3 mg秤量して、100mM酢酸アンモニウム水溶液（pH=10.2）を加えて溶解し、100 mlに定容した（1.25 mM溶液）。
［反応液調製方法］
1ml用バイアル瓶に1.25mM のNAL溶液400μlと酢酸アンモニウム溶液（pH＝10.2）250μlとを混合し、さらに被験物質（化合物A,B又はC）の100mMアセトニトリル溶液を350μlを添加して撹拌した。この混合液を混合直後、1時間後、2時間後、4時間後、８時間後および24時間後にそれぞれ15μlずつサンプリングして、蒸留水／アセトニトリル＝75/25（0.1%トリフルオロ酢酸含有）溶液を135μl添加して混合した後に以下に記載の条件にてHPLCに供した。また、NALの標準溶液を調製後に以下に記載の条件にてHPLCに供した。得られたクロマトグラムからNALを定量して、混合液中におけるNALの残存量を求めた。
1ml用バイアル瓶に1.25mM のNAL溶液400μlと酢酸アンモニウム溶液（pH＝10.2）250μlとを混合し、さらに被験物質（化合物A,B又はC）の100mMアセトニトリル溶液を350μlを添加して撹拌した。この混合液を混合直後、1時間後、2時間後、4時間後、８時間後および24時間後にそれぞれ15μlずつサンプリングして、蒸留水／アセトニトリル＝75/25（0.1%トリフルオロ酢酸含有）溶液を135μl添加して混合した後に以下に記載の条件にてHPLCに供した。また、NALの標準溶液を調製後に以下に記載の条件にてHPLCに供した。得られたクロマトグラムからNALを定量して、混合液中におけるNALの残存量を求めた。
[HPLC測定条件]
装置：LC-20AD（島津製作所製）
カラム：CAPCELL-PAK ODS（3.0×150 mm）
カラム温度：40℃
流速：0.4 ml/min.
検出波長：220 nm
溶離液A：蒸留水／アセトニトリル＝98／2（0.1%トリフルオロ酢酸）
溶離液B：アセトニトリル／蒸留水＝90/10（0.1%トリフルオロ酢酸）
溶出条件：下記グラジエント
装置：LC-20AD（島津製作所製）
カラム：CAPCELL-PAK ODS（3.0×150 mm）
カラム温度：40℃
流速：0.4 ml/min.
検出波長：220 nm
溶離液A：蒸留水／アセトニトリル＝98／2（0.1%トリフルオロ酢酸）
溶離液B：アセトニトリル／蒸留水＝90/10（0.1%トリフルオロ酢酸）
溶出条件：下記グラジエント
分析時間：15分間
（２）Ｎ−（２−ナフチルアセチル）システイン（以下NAC）について（比較例）
NALの代わりに、特許文献３（特開２０１１−０５９１０２号公報）に記載のNACを用いて、上記（１）NALについての場合と同様にNACを定量して、混合液中におけるNACの残存量を求めた。ただし、NAC溶液の調製は以下のように行い、測定においてはNAL同様HPLCを用いた。測定条件は、以下に示す。
NALの代わりに、特許文献３（特開２０１１−０５９１０２号公報）に記載のNACを用いて、上記（１）NALについての場合と同様にNACを定量して、混合液中におけるNACの残存量を求めた。ただし、NAC溶液の調製は以下のように行い、測定においてはNAL同様HPLCを用いた。測定条件は、以下に示す。
[NAC溶液調製]
NAC（分子量289.35）を 36.2mg秤量して、窒素ガス置換した100mMリン酸緩衝液（pH=7.5)を加えて100 mlに定容した（1.25 mM溶液）。
NAC（分子量289.35）を 36.2mg秤量して、窒素ガス置換した100mMリン酸緩衝液（pH=7.5)を加えて100 mlに定容した（1.25 mM溶液）。
[HPLC測定条件]
装置：LC-20AD（島津製作所製）
カラム：CAPCELL-PAK ODS（3.0×150 mm）
カラム温度：40℃
流速：0.4 ml/min.
検出波長：220 nm
溶離液A：蒸留水／アセトニトリル＝98／2（0.1%トリフルオロ酢酸）
溶離液B：アセトニトリル／蒸留水＝90/10（0.1%トリフルオロ酢酸）
溶出条件：下記グラジエント
装置：LC-20AD（島津製作所製）
カラム：CAPCELL-PAK ODS（3.0×150 mm）
カラム温度：40℃
流速：0.4 ml/min.
検出波長：220 nm
溶離液A：蒸留水／アセトニトリル＝98／2（0.1%トリフルオロ酢酸）
溶離液B：アセトニトリル／蒸留水＝90/10（0.1%トリフルオロ酢酸）
溶出条件：下記グラジエント
分析時間：15分間
上記の測定結果を、図２に示す。
［結果］
いずれの化合物においても、NALとの反応速度は極めて大きく、１時間以内にNALの残存率はほぼ0%となった。一方、NACにおいては、いずれの化合物においても反応速度はNALに比べて小さく、24時間反応後においても約半分のNACが残存していた。
いずれの化合物においても、NALとの反応速度は極めて大きく、１時間以内にNALの残存率はほぼ0%となった。一方、NACにおいては、いずれの化合物においても反応速度はNALに比べて小さく、24時間反応後においても約半分のNACが残存していた。
NACの反応速度からでは、「感作性：低度」程度と判断してしまう可能性の高い化合物について、NALでは「感作性：強度」または「感作性：極めて強度」と正確な判断ができることがわかった。
試験例３：疎水性感作性物質の評価
［被験物質］
疎水性感作性物質として以下の３化合物を使用して、上記試験例２に従った皮膚感作性の測定を行った。
（疎水性感作性物質）
化合物D：テトラクロロサリチルアニリド（皮膚感作性：極めて強度）
（分子量351.01）（CLogP=5.30）
化合物E：α-ヘキシルシンナムアルデヒド（皮膚感作性：低度）
（分子量216.32）（CogP=5.00）
化合物F：ミリスチン酸イソプロピル（皮膚感作性：なし）
（分子量270.45）（CLogP=7.37）
上記の皮膚感作性は、前述の非特許文献１（G.F.Gerberick et al., Toxicol. Sci., 97(2), 417-427:2007）に記載されたLLNA試験による評価結果である。また、CLogPは「ChemBioDraw Ultra ver.12.0」を用いて算出した。
［被験物質］
疎水性感作性物質として以下の３化合物を使用して、上記試験例２に従った皮膚感作性の測定を行った。
（疎水性感作性物質）
化合物D：テトラクロロサリチルアニリド（皮膚感作性：極めて強度）
（分子量351.01）（CLogP=5.30）
化合物E：α-ヘキシルシンナムアルデヒド（皮膚感作性：低度）
（分子量216.32）（CogP=5.00）
化合物F：ミリスチン酸イソプロピル（皮膚感作性：なし）
（分子量270.45）（CLogP=7.37）
上記の皮膚感作性は、前述の非特許文献１（G.F.Gerberick et al., Toxicol. Sci., 97(2), 417-427:2007）に記載されたLLNA試験による評価結果である。また、CLogPは「ChemBioDraw Ultra ver.12.0」を用いて算出した。
［反応液調製方法］
1ml用バイアル瓶にLys-PまたはNAL 5.0mM溶液100μlとアセトニトリル 250μlとを混合し、さらに被験物質（化合物D,E又はF）の100mMアセトニトリル溶液350μlを添加して撹拌した（水／溶媒＝10/90）。この混合液を混合直後、1時間後、2時間後、4時間後、８時間後および24時間後にそれぞれ15μlずつサンプリングして、アセトニトリル（0.1%トリフルオロ酢酸含有）溶液を135μl添加して混合した後に以下に記載の条件にてHPLCに供した。また、NALの標準溶液を調製後に以下に記載の条件にてHPLCに供した。得られたクロマトグラムからNALを定量して、混合液中におけるLys-PまたはNALの残存量を求めた。
1ml用バイアル瓶にLys-PまたはNAL 5.0mM溶液100μlとアセトニトリル 250μlとを混合し、さらに被験物質（化合物D,E又はF）の100mMアセトニトリル溶液350μlを添加して撹拌した（水／溶媒＝10/90）。この混合液を混合直後、1時間後、2時間後、4時間後、８時間後および24時間後にそれぞれ15μlずつサンプリングして、アセトニトリル（0.1%トリフルオロ酢酸含有）溶液を135μl添加して混合した後に以下に記載の条件にてHPLCに供した。また、NALの標準溶液を調製後に以下に記載の条件にてHPLCに供した。得られたクロマトグラムからNALを定量して、混合液中におけるLys-PまたはNALの残存量を求めた。
[HPLC測定条件]
上記試験例２の（１）NALについての場合と同じ。
上記試験例２の（１）NALについての場合と同じ。
[測定結果］
試験例３の条件においてアセトニトリル溶液に被検物質を添加せずに、Lys-P標準溶液を処理した後、0.1%トリフルオロ酢酸含有のアセトニトリル溶液に溶解してHPLC測定すると、Lys-Pのピーク面積は、50μMのピーク面積が81467（μV・sec）となり、試験例１の比較例（Lys-Pを使用した場合）に記載されているピーク面積に比べて著しく低下した（試験例１の比較例のピーク面積の約1/4）。これは、ペプチドの変性などの影響と思われる。 試験例３の条件において被験物質を添加した場合には、検出感度不足となりHPLC測定ができなかった。
試験例３の条件においてアセトニトリル溶液に被検物質を添加せずに、Lys-P標準溶液を処理した後、0.1%トリフルオロ酢酸含有のアセトニトリル溶液に溶解してHPLC測定すると、Lys-Pのピーク面積は、50μMのピーク面積が81467（μV・sec）となり、試験例１の比較例（Lys-Pを使用した場合）に記載されているピーク面積に比べて著しく低下した（試験例１の比較例のピーク面積の約1/4）。これは、ペプチドの変性などの影響と思われる。 試験例３の条件において被験物質を添加した場合には、検出感度不足となりHPLC測定ができなかった。
一方、試験例３の反応条件において、NAL標準溶液では試験例１のNALを使用した場合の条件と検出波長を変更して測定したが、S/N比はほぼ同程度で十分な感度でピークが検出され、経時的な定量が可能であった。測定結果は、図４に示す。
NALを用いた試験例３の結果、感作性が極めて強度な化合物Dに比べて、感作性が低度の化合物Eおよび感作性なしの化合物Fでは、化合物の残存率が低かったことから、皮膚感作性は各時間におけるNALの残存率(%)が低いほど高いと判断される。
NALは有機溶媒比率の高い反応液においても十分な検出感度があり、反応性も有しているため、疎水性化合物の評価が可能であり、その結果は、LLNA試験による皮膚感作性の強度と対応していることがわかった。
NALは有機溶媒比率の高い反応液においても十分な検出感度があり、反応性も有しているため、疎水性化合物の評価が可能であり、その結果は、LLNA試験による皮膚感作性の強度と対応していることがわかった。
［参考例］
［反応液調製方法］
1ml用バイアル瓶にLys-PまたはNAL 1.25mM溶液400μlと酢酸アンモニウム溶液（pH＝10.2）250μlとを混合し、さらに被験物質の100mM アセトニトリル溶液を350μlを添加して撹拌した（水／溶媒＝65/35）。この混合液を混合直後、1時間後、2時間後、4時間後、８時間後および24時間後にそれぞれ15μlずつサンプリングして、蒸留水／アセトニトリル＝75/25（0.1%トリフルオロ酢酸含有）溶液を135μl添加して混合した後に以下に記載の条件にてHPLCに供した。また、NALの標準溶液を調製後に以下に記載の条件にてHPLCに供した。得られたクロマトグラムからLys-PまたはNALを定量して、混合液中におけるLys-PまたはNALの残存量を求めた。
［反応液調製方法］
1ml用バイアル瓶にLys-PまたはNAL 1.25mM溶液400μlと酢酸アンモニウム溶液（pH＝10.2）250μlとを混合し、さらに被験物質の100mM アセトニトリル溶液を350μlを添加して撹拌した（水／溶媒＝65/35）。この混合液を混合直後、1時間後、2時間後、4時間後、８時間後および24時間後にそれぞれ15μlずつサンプリングして、蒸留水／アセトニトリル＝75/25（0.1%トリフルオロ酢酸含有）溶液を135μl添加して混合した後に以下に記載の条件にてHPLCに供した。また、NALの標準溶液を調製後に以下に記載の条件にてHPLCに供した。得られたクロマトグラムからLys-PまたはNALを定量して、混合液中におけるLys-PまたはNALの残存量を求めた。
［HPLC測定条件］
上記試験例２の（１）NALについての場合と同じ。
上記試験例２の（１）NALについての場合と同じ。
［測定結果］
参考例の反応液条件では、Lys-PおよびNALにおいて、すべての被験物質は白濁または沈殿を生じて、正確な測定ができなかった。
参考例の反応液条件では、Lys-PおよびNALにおいて、すべての被験物質は白濁または沈殿を生じて、正確な測定ができなかった。
Claims (11)
- アミノ基を１個以上有する有機化合物であって、紫外、可視光又は近赤外域に吸収極大を有し、吸収極大波長におけるモル吸光係数（L/mol・cm）が10以上500000以下の有機化合物を測定主薬として含む皮膚感作性測定試薬。
- 有機化合物がε−アミノ基および芳香族基を有するリジンの誘導体である請求項１に記載の試薬。
- 有機化合物がα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンである請求項２に記載の試薬。
- 有機化合物がα−Ｎ−（２−フェニルアセチル）リジン又はα−Ｎ−[２−(ナフタレン−１−イル)アセチル]リジンである請求項３に記載の試薬。
- 粉末形態である請求項１〜４のいずれか一項に記載の試薬。
- 有機化合物が、有機酸塩類を含む水性緩衝液もしくは水又はこれらと有機溶媒との混合溶媒に溶解した形態である請求項１〜４のいずれか一項に記載の試薬。
- 有機化合物の濃度が0.1mM〜500mＭである請求項６に記載の試薬。
- （１）アミノ基を１個以上有する構造を有する有機化合物であって紫外、可視光又は近赤外域に吸収極大を有し、吸収極大波長におけるモル吸光係数（L/mol・cm）が10以上500000以下の有機化合物と被験物質とを反応させること、及び、
（２）反応による有機化合物の量の低下を光学的測定により検出することを含む皮膚感作性の測定方法。 - （１）アミノ基を１個以上有する構造を有する有機化合物であって紫外、可視光又は近赤外域に吸収極大を有し、吸収極大波長におけるモル吸光係数（L/mol・cm）が10以上500000以下の有機化合物と被験物質とを反応させること、及び、
（２）反応により生じた化合物を光学的測定により検出することを含む皮膚感作性の測定方法。 - 有機化合物がα−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンである請求項８又は９に記載の方法。
- 工程（１）で得られる反応物をクロマトグラフィー処理することを含む請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
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