CN112522276A

CN112522276A - 一种emc1核苷酸序列及其应用

Info

Publication number: CN112522276A
Application number: CN202011482058.6A
Authority: CN
Inventors: 李斌; 任盛
Original assignee: Wuhan Niufusi Biological Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Niufusi Biological Technology Co ltd
Priority date: 2020-12-15
Filing date: 2020-12-15
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2040-12-15
Also published as: CN112522276B

Abstract

本发明涉及生物医药基因治疗技术领域，公开了一种EMC1核苷酸序列及其应用。本发明所述核苷酸序列与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列有≥95％相同性。本发明证实密码子优化后的EMC1编码序列表达蛋白的效率要高于野生型序列，使用AAV2‑EMC1药物处理可以显著改善EMC1突变导致的视网膜细胞跨膜蛋白异常病变。用药物处理EMC1敲减的视网膜色素表皮细胞，EMC1可以在该细胞系中高效表达，并且减少细胞中的跨膜蛋白折叠错误，恢复跨膜蛋白在视网膜色素表皮细胞中的正常功能。因此AAV2‑EMC1药物具有预防或治疗视网膜色素变性的作用。

Description

一种EMC1核苷酸序列及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药基因治疗技术领域，更具体的说是涉及一种EMC1核苷酸序列及其应用。

背景技术

EMC1属于内质网膜蛋白复合体(endoplasmic reticulum(ER)membrane proteincomplex,EMC)家族的成员，EMC复合体在进化上高度保守，其作为分子伴侣辅助蛋白质的正确折叠以及顺利嵌入细胞膜，因此EMC复合体对细胞膜表面的多次跨膜蛋白克服能量障碍是必需的。EMC1作为EMC复合体不可分割的一部分，其编码基因的突变导致蛋白功能的缺失，会造成细胞内部分蛋白在内质网中的修饰紊乱，从而引发包括视网膜色素变性在内的一系列病变。

天然存在的AAV血清型通常无法在玻璃体腔一侧转导视网膜组织细胞，因为存在内限膜、神经胶质细胞等阻止AAV病毒粒子扩散的屏障。通过构建AAV2衣壳蛋白编码序列文库，在loop4的位置插入随机7氨基酸序列，将突变的血清型注入小鼠玻璃体腔进行筛选，富集到一种主要的突变亚型，称为AAV2/2-7M8，即AAV2～588LALGETTRP。AAV2/2.7M8血清型具有很强的视网膜组织趋性，该血清型包装的荧光报告蛋白通过玻璃体腔注射小鼠眼部，能够在整个视网膜中检测到荧光。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种EMC1核苷酸序列，使得所述核苷酸序列经过优化密码子使用偏好，DNA重复序列，mRNA二级结构，平衡序列中GC含量和CpG岛，排除冲突的酶切位点等多个参数，可以使EMC1表达效率更高；

本发明的另外一个目的在于提供承载上述核苷酸序列的病毒载体，并具备预防或治疗EMC1突变导致视网膜色素变性的作用；

本发明的另外一个目的在于提供包含上述病毒载体或核苷酸序列的药物制剂，并具备预防或治疗EMC1突变导致视网膜色素变性的作用；；

本发明的另外一个目的在于提供上述核苷酸序列、病毒载体以及药物制剂在预防或治疗EMC1突变导致视网膜色素变性领域的中相关应用，包括但不限于相关药品、试剂的制备以及预防或治疗方法中的应用；

本发明的另外一个目的在于提供上述药物制剂的递送方法，将所述药物制剂注射至眼部如视网膜下或玻璃体腔注射。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种EMC1核苷酸序列，其与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列有≥95％相同性。

作为优选，其与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列有≥98％相同性；进一步优选地，其与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列有≥99％相同性；在本发明具体实施方式中，其序列如SEQID NO:3所示。

作为优选，所述核苷酸序列为cDNA序列。

同时，本发明还提供了一种病毒载体，其包含有本发明所述核苷酸序列。

作为优选，所述病毒载体为腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体；在本发明具体实施方式中，本发明采用腺相关病毒载体，所述腺相关病毒载体的血清型为AAV2野生型或AAV2/2.7M8。

更具体地，所述病毒载体由启动子CMV(序列如SEQ ID NO:4所示)调控EMC1蛋白的表达。

此外，本发明还提供一种药物制剂，包含本发明所述的核苷酸序列或本发明所述的病毒载体。

作为优选，所述药物制剂为液体制剂；所述药物制剂还可以包括药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明对EMC1 cDNA序列进行密码子优化(codon optimization)得到coEMC1，对优化前后的序列wtEMC1/coEMC1进行细胞水平表达效率检测，发现优化后的序列表达效率显著提高。然后使用AAV-EMC1质粒转染HEK293细胞，验证EMC1蛋白表达在体外的有效性。随后对视网膜色素表皮细胞进行转染AAV-EMC1，可在该细胞系中检测到EMC1表达，免疫共沉淀(co-IP)验证了优化后的EMC1蛋白能够与钙联蛋白(calnexin)结合。将AAV2-EMC1病毒药物感染EMC1敲减细胞系，利用免疫荧光观察跨膜蛋白的分布状态，发现和对照AAV处理相比，AAV2-EMC1处理的EMC1敲减细胞中跨膜蛋白异常聚集显著减少。证明AAV2-EMC1药物具有预防或治疗视网膜色素变性的作用。

基于上述各项优异的技术效果，本发明提出了如下相关应用：

本发明所述核苷酸序列在制备预防或治疗EMC1突变导致的眼部疾病的病毒载体或药物制剂中的应用，或在预防或治疗EMC1突变导致的眼部疾病中的应用；

本发明所述病毒载体在制备预防或治疗EMC1突变导致的眼部疾病的药物制剂中的应用，或在预防或治疗EMC1突变导致的眼部疾病中的应用；

本发明所述的药物制剂在预防或治疗EMC1突变导致的眼部疾病中的应用。

其中，所述EMC1突变导致的眼部疾病为EMC1突变导致视网膜色素变性。

本发明还对应提供了一种本发明所述药物制剂的递送方法，将所述药物制剂注射至眼部，比如注射到视网膜下位置或玻璃体腔位置。

由以上技术方案可知，本发明证实密码子优化后的EMC1编码序列表达蛋白的效率要高于野生型序列，使用AAV2-EMC1药物处理可以显著改善EMC1突变导致的视网膜细胞跨膜蛋白异常病变。用药物处理EMC1敲减的视网膜色素表皮细胞，EMC1可以在该细胞系中高效表达，并且减少细胞中的跨膜蛋白折叠错误，恢复跨膜蛋白在视网膜色素表皮细胞中的正常功能。因此AAV2-EMC1药物具有预防或治疗视网膜色素变性的作用。

附图说明

图1-图4所示为wtEMC1和coEMC1序列比对；优化后差异性的密码子序列加粗并用下划线标注；

图5所示为AAV2-CMV-coEMC1载体图谱(A)和AAV2-CMV-wtEMC1载体图谱(B)；载体包含AAV2 5’ITR，CMV启动子，密码子优化后的EMC1cDNA或野生型EMC1 cDNA，bGH polyA序列和AAV2 3’ITR；

图6所示为AAV2-CMV-coEMC1和AAV2-CMV-wtEMC1质粒在HEK293细胞中的表达效率；

A：在HEK293细胞中分别转染AAV2-CMV-coEMC1和AAV2-CMV-wtEMC1质粒，48小时后裂解细胞，Western blot检测EMC1蛋白表达水平；

B：AAV2-CMV-coEMC1和AAV2-CMV-wtEMC1质粒转染HEK293细胞表达EMC1蛋白相对丰度；

图7所示为AAV2-CMV-coEMC1表达蛋白的功能验证；将AAV2-CMV-coEMC1质粒转染hTERT细胞，48小时后裂解细胞，一部分裂解产物用于EMC1特异性的免疫共沉淀，一部分裂解产物用于sec61特异性的免疫共沉淀，沉淀后的产物分别利用Western blot检测能与calnexin抗体结合的条带；

图8所示为AAV2/2.7M8-CMV-coEMC1病毒药物与AAV2/2.7M8-CMV-GFP对照分别感染EMC1敲减细胞系，48小时后进行免疫荧光染色，观察多次跨膜蛋白rhodopsin在细胞中的分布状况，对错误折叠蛋白的异常聚集点进行计数比较。

具体实施方式

本发明公开了一种EMC1核苷酸序列及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述核苷酸序列及其应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的核苷酸序列及其应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

EMC1的cDNA编码的蛋白序列参见SEQ ID NO:1所示，野生型的EMC1cDNA序列参见SEQ ID NO:2所示。

本发明通过优化密码子使用偏好，DNA重复序列，mRNA二级结构，平衡序列中GC含量和CpG岛，排除冲突的酶切位点等多个参数，得到了和wtEMC1序列显著不同的优化序列coEMC1(图1-4)。把wt/co EMC1序列构建到AAV2-CMV载体(图5)，然后用相同拷贝数的两种质粒分别转染HEK293细胞，并检测EMC1基因的表达，发现序列优化后的EMC1蛋白表达量显著高于野生型EMC1(图6)，证明密码子优化使EMC1在翻译动力学上很好地规避了野生型蛋白翻译过程存在的潜在阻碍，实现了更高效的蛋白表达。

本发明还将AAV2-CMV-coEMC1质粒转染人源视网膜色素表皮细胞，48小时后裂解细胞，将裂解产物分为两部分，分别与EMC1和sec61特异性抗体4℃孵育，免疫沉淀反应后得到对应的富集产物，将实验组产物(EMC1抗体富集)和对照组(sec61抗体富集)分别用对应的抗体和钙联蛋白(calnexin)特异性抗体进行Western blot检测。结果发现实验组和对照组都能检测到各自富集的阳性条带，但是实验组能检测到calnexin的阳性条带而对照组检测不到该条带(图7)，说明EMC1(实验组)能与calnexin蛋白在细胞体内相互结合，而sec61(对照组)在细胞体内与calnexin无相互作用。EMC1在细胞中通过与calnexin结合形成复合体，辅助跨膜蛋白的正确折叠，本发明的实验证明了优化后表达的coEMC1蛋白保留了细胞内与calnexin结合的能力，而同样定位在内质网膜上的sec61蛋白与calnexin无相互作用说明了这种结合具有特异性。

此外，本发明使用shRNA慢病毒系统构建了EMC1稳定敲减细胞系，并对EMC1敲减细胞系进行了实验组和对照组病毒感染。利用免疫荧光染色观察，实验结果发现，野生型细胞中没有多次跨膜蛋白rhodopsin的异常折叠，故观察不到泪点状的异常聚集；而AAV2/2.7M8-CMV-GFP(对照组)处理的EMC1敲减细胞中观察到大量的泪点状聚集；与对照组相比，AAV2/2.7M8-CMV-coEMC1药物处理过的EMC1敲减细胞中泪点状聚集显著减少(图8)。EMC1属于内质网膜蛋白复合体家族的成员，其在各种跨膜蛋白的翻译后正确折叠的过程中扮演重要的角色。视紫红质(rhodopsin)是视网膜组织细胞中重要的色素蛋白，EMC1缺陷引起的rhodopsin错误折叠会引起造成蛋白功能缺失，从而引发眼部病变。

综合以上结果，本发明证明了AAV2.2/7M8-CMV-coEMC1介导的EMC1能够显著降低视网膜色素表皮细胞中因rhodopsin错误折叠引发的泪点状蛋白聚集，因此EMC1基因治疗药物对EMC1突变引起的视网膜色素变性具有治疗作用，为进一步的临床应用开发奠定了基础。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：密码子优化的EMC1载体构建和表达验证

(1)质粒载体构建

1.将AAV2-CMV质粒骨架，coEMC1片段和wtEMC1片段分别同时用HindIII与XhoI双酶切，然后将酶切后的片段分别于骨架进行连接。

2.连接产物转化大肠杆菌，挑取单菌落进行酶切验证与测序验证。

(2)细胞转染

1.转染前一天，胰酶消化HEK293细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90％。

2.对于每孔细胞，使用50μl无血清DMEM培养基稀释0.8μg-1.0μg DNA。

3.对于每孔细胞，使用50μl DMEM培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。LIPOFECTAMINE 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合。

4.混合稀释的DNA和稀释的LIPOFECTAMINE 2000在室温保温20分钟。

5.直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

6.在37℃，5％的CO₂中培养48小时。

7.弃掉培养基后用PBS冲洗，胰酶消化后离心收集细胞待用。

(3)Western Blot

1.蛋白样品制备，按1:100的比例在裂解液中加入PMSF(按用量现配现用)。

2.使用强裂解液冰上裂解细胞30min；4℃，12000rpm离心15min，收集上清液待用。

3.使用BCA法测定蛋白浓度。

4.电泳

a、根据所检测蛋白大小配制相应的分离胶(5ml/块)，待分离胶凝固。

b、配制5％的浓缩胶(2ml/块)，加满玻璃板，插入梳子。

c、将5μl预染蛋白质分子marker SDS-PAGE加入加样孔内，使用1x的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液10μl上样到样品孔边上的空白加样孔内。

5.转膜

将转膜白夹子上面放上湿的垫层，垫层上面铺三张叠在一起的湿滤纸，滤纸上面依次放置湿pvdf膜、胶、滤纸、垫层、黑夹板，将装好的夹板放入装有转膜缓冲液的电泳槽，把转膜槽放置在冰浴中进行转膜2h。

6.封闭

转膜完毕后，漂洗1-2分钟，用滴管吸尽缓冲液，加入5％的脱脂奶粉，在侧摆摇床上缓慢摇动，室温封闭15-60min。加入TBS洗涤液洗涤5分钟。共洗涤3次。

7.一抗孵育

按照比例使用5％的脱脂奶粉/PBS+2％BSA稀释适量的一抗，4℃缓慢摇动孵育过夜或室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育2h。孵育后洗涤。

8.二抗孵育

加入稀释好的二抗，室温侧摆摇床上缓慢摇动孵育40min-1h。孵育后洗涤。

9.蛋白检测

使用ECL类试剂来检测蛋白，各取1ml混匀后，滴加在蛋白膜表面，避光孵育1-2min。用镊子将蛋白膜整齐的摆放在塑料纸上，放入凝胶成像仪上曝光。结果如图6A、图6B所示，序列优化后的EMC1蛋白表达量显著高于野生型EMC1，证明密码子优化使EMC1在翻译动力学上很好地规避了野生型蛋白翻译过程存在的潜在阻碍，实现了更高效的蛋白表达。

实施例2：优化后EMC1蛋白在人视网膜色素细胞中的功能验证

(1)细胞转染

1.hTERT细胞在细胞培养孔板中接板，待细胞生长至汇集度达到80-100％。

2.更换培养基为DMEM+1XGlutaMAX。

3.将质粒与PEI试剂分别用培养基稀释后混匀，比例为1：1或1:2，混匀后室温静置20min，将混合物添加到细胞培养液中，轻轻摇匀。

4.将细胞培养板置于37℃的CO₂培养箱培养48hr。

(2)免疫共沉淀

1.收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4℃裂解30min，12000g，30min后取上清。

2.取裂解液将1μg相应的抗体和10-50μl protein A-beads加入到细胞裂解液，4℃缓慢摇晃孵育过夜。

3.免疫沉淀反应后，在4℃以3,000g速度离心5min，将protein A-beads离心至管底；

4.protein A-beads用1ml裂解缓冲液洗3－4次，最后加入15μl的2×SDS Buffer加热10分钟，上样进行免疫印迹分析。

(3)Western Blot

参照实施例1步骤。

结果见图6，将AAV2-CMV-coEMC1质粒转染人源视网膜色素表皮细胞，48小时后裂解细胞，将裂解产物分为两部分，分别与EMC1和sec61特异性抗体4℃孵育，免疫沉淀反应后得到对应的富集产物，将实验组产物(EMC1抗体富集)和对照组(sec61抗体富集)分别用对应的抗体和钙联蛋白(calnexin)特异性抗体进行Western blot检测。结果发现实验组和对照组都能检测到各自富集的阳性条带，但是实验组能检测到calnexin的阳性条带而对照组检测不到该条带(图7)，说明EMC1(实验组)能与calnexin蛋白在细胞体内相互结合，而sec61(对照组)在细胞体内与calnexin无相互作用。EMC1在细胞中通过与calnexin结合形成复合体，辅助跨膜蛋白的正确折叠，我们的实验证明了优化后表达的coEMC1蛋白保留了细胞内与calnexin结合的能力，而同样定位在内质网膜上的sec61蛋白与calnexin无相互作用说明了这种结合具有特异性。

实施例3：AAV2/2.7M8-CMV-coEMC1基因治疗药物显著改善缺陷细胞中蛋白的错误折叠

(1)病毒包装，病毒药物感染EMC1敲减细胞系

1.聚合度90％以上的HEK293T细胞按1：3比例传盘。

2.转质粒前1-2h左右，换成无血清培养基，用转染试剂将目的基因质粒和辅助质粒(包含AAV2.7M8血清型元件)转入HEK293T中。

3.质粒转化24h后，换新的无血清培养基

4.转染72h收毒。带着培养基，吹下细胞，离心；然后分别收获培养基上清与细胞沉淀。用PEG8000沉淀培养基上清中的病毒，沉淀过夜后收集病毒沉淀。

5.将病毒的混合液用碘克沙醇密度梯度离心进行纯化，然后用超滤管进行浓缩。

6.构建EMC1敲减细胞系。

7.准备好5*10¹²vg/ml的AAV2/2.7M8-CMV-coEMC1药物和AAV2/2.7M8-CMV-GFP。

8.将病毒感染EMC1敲减的细胞。

(2)免疫荧光染色

1.细胞爬片，用0.01M PBS冲洗5min×3次。

2.滴加10％正常山羊血清37℃封闭45min。

3.吸去多余液体，加入一抗(1：100)，放入湿盒中，37℃1h后置于4℃冰箱中过夜(保持在湿盒中)。

4.0.01M PBS冲洗5min×3次。

5.在黑暗条件下加入二抗(1：200)，37℃温育45min。

6.在黑暗条件下吸弃二抗(注：不再冲洗)，加入DAPI染液，室温作用20min。

7.在黑暗条件下0.01M PBS冲洗5min×6次。

8.在黑暗条件下用防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察。

本实施例使用shRNA慢病毒系统构建了EMC1稳定敲减细胞系，并对EMC1敲减细胞系进行了实验组和对照组病毒感染。利用免疫荧光染色观察，实验结果发现，野生型细胞中没有多次跨膜蛋白rhodopsin的异常折叠，故观察不到泪点状的异常聚集；而AAV2/2.7M8-CMV-GFP(对照组)处理的EMC1敲减细胞中观察到大量的泪点状聚集；与对照组相比，AAV2/2.7M8-CMV-coEMC1药物处理过的EMC1敲减细胞中泪点状聚集显著减少(图8)。EMC1属于内质网膜蛋白复合体家族的成员，其在各种跨膜蛋白的翻译后正确折叠的过程中扮演重要的角色。视紫红质(rhodopsin)是视网膜组织细胞中重要的色素蛋白，EMC1缺陷引起的rhodopsin错误折叠会引起造成蛋白功能缺失，从而引发眼部病变。

综合以上结果，本发明证明了AAV介导的EMC1能够显著降低视网膜色素表皮细胞中因rhodopsin错误折叠引发的泪点状蛋白聚集，因此EMC1基因治疗药物对EMC1突变引起的视网膜色素变性具有治疗作用，为进一步的临床应用开发奠定了基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 武汉纽福斯生物科技有限公司

<120> 一种EMC1核苷酸序列及其应用

<130> MP2032070

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 993

<212> PRT

<213> EMC1 蛋白质序列(EMC1 protein)

<400> 1

Met Ala Ala Glu Trp Ala Ser Arg Phe Trp Leu Trp Ala Thr Leu Leu

1 5 10 15

Ile Pro Ala Ala Ala Val Tyr Glu Asp Gln Val Gly Lys Phe Asp Trp

20 25 30

Arg Gln Gln Tyr Val Gly Lys Val Lys Phe Ala Ser Leu Glu Phe Ser

35 40 45

Pro Gly Ser Lys Lys Leu Val Val Ala Thr Glu Lys Asn Val Ile Ala

50 55 60

Ala Leu Asn Ser Arg Thr Gly Glu Ile Leu Trp Arg His Val Asp Lys

65 70 75 80

Gly Thr Ala Glu Gly Ala Val Asp Ala Met Leu Leu His Gly Gln Asp

85 90 95

Val Ile Thr Val Ser Asn Gly Gly Arg Ile Met Arg Ser Trp Glu Thr

100 105 110

Asn Ile Gly Gly Leu Asn Trp Glu Ile Thr Leu Asp Ser Gly Ser Phe

115 120 125

Gln Ala Leu Gly Leu Val Gly Leu Gln Glu Ser Val Arg Tyr Ile Ala

130 135 140

Val Leu Lys Lys Thr Thr Leu Ala Leu His His Leu Ser Ser Gly His

145 150 155 160

Leu Lys Trp Val Glu His Leu Pro Glu Ser Asp Ser Ile His Tyr Gln

165 170 175

Met Val Tyr Ser Tyr Gly Ser Gly Val Val Trp Ala Leu Gly Val Val

180 185 190

Pro Phe Ser His Val Asn Ile Val Lys Phe Asn Val Glu Asp Gly Glu

195 200 205

Ile Val Gln Gln Val Arg Val Ser Thr Pro Trp Leu Gln His Leu Ser

210 215 220

Gly Ala Cys Gly Val Val Asp Glu Ala Val Leu Val Cys Pro Asp Pro

225 230 235 240

Ser Ser Arg Ser Leu Gln Thr Leu Ala Leu Glu Thr Glu Trp Glu Leu

245 250 255

Arg Gln Ile Pro Leu Gln Ser Leu Asp Leu Glu Phe Gly Ser Gly Phe

260 265 270

Gln Pro Arg Val Leu Pro Thr Gln Pro Asn Pro Val Asp Ala Ser Arg

275 280 285

Ala Gln Phe Phe Leu His Leu Ser Pro Ser His Tyr Ala Leu Leu Gln

290 295 300

Tyr His Tyr Gly Thr Leu Ser Leu Leu Lys Asn Phe Pro Gln Thr Ala

305 310 315 320

Leu Val Ser Phe Ala Thr Thr Gly Glu Lys Thr Val Ala Ala Val Met

325 330 335

Ala Cys Arg Asn Glu Val Gln Lys Ser Ser Ser Ser Glu Asp Gly Ser

340 345 350

Met Gly Ser Phe Ser Glu Lys Ser Ser Ser Lys Asp Ser Leu Ala Cys

355 360 365

Phe Asn Gln Thr Tyr Thr Ile Asn Leu Tyr Leu Val Glu Thr Gly Arg

370 375 380

Arg Leu Leu Asp Thr Thr Ile Thr Phe Ser Leu Glu Gln Ser Gly Thr

385 390 395 400

Arg Pro Glu Arg Leu Tyr Ile Gln Val Phe Leu Lys Lys Asp Asp Ser

405 410 415

Val Gly Tyr Arg Ala Leu Val Gln Thr Glu Asp His Leu Leu Leu Phe

420 425 430

Leu Gln Gln Leu Ala Gly Lys Val Val Leu Trp Ser Arg Glu Glu Ser

435 440 445

Leu Ala Glu Val Val Cys Leu Glu Met Val Asp Leu Pro Leu Thr Gly

450 455 460

Ala Gln Ala Glu Leu Glu Gly Glu Phe Gly Lys Lys Ala Asp Gly Leu

465 470 475 480

Leu Gly Met Phe Leu Lys Arg Leu Ser Ser Gln Leu Ile Leu Leu Gln

485 490 495

Ala Trp Thr Ser His Leu Trp Lys Met Phe Tyr Asp Ala Arg Lys Pro

500 505 510

Arg Ser Gln Ile Lys Asn Glu Ile Asn Ile Asp Thr Leu Ala Arg Asp

515 520 525

Glu Phe Asn Leu Gln Lys Met Met Val Met Val Thr Ala Ser Gly Lys

530 535 540

Leu Phe Gly Ile Glu Ser Ser Ser Gly Thr Ile Leu Trp Lys Gln Tyr

545 550 555 560

Leu Pro Asn Val Lys Pro Asp Ser Ser Phe Lys Leu Met Val Gln Arg

565 570 575

Thr Thr Ala His Phe Pro His Pro Pro Gln Cys Thr Leu Leu Val Lys

580 585 590

Asp Lys Glu Ser Gly Met Ser Ser Leu Tyr Val Phe Asn Pro Ile Phe

595 600 605

Gly Lys Trp Ser Gln Val Ala Pro Pro Val Leu Lys Arg Pro Ile Leu

610 615 620

Gln Ser Leu Leu Leu Pro Val Met Asp Gln Asp Tyr Ala Lys Val Leu

625 630 635 640

Leu Leu Ile Asp Asp Glu Tyr Lys Val Thr Ala Phe Pro Ala Thr Arg

645 650 655

Asn Val Leu Arg Gln Leu His Glu Leu Ala Pro Ser Ile Phe Phe Tyr

660 665 670

Leu Val Asp Ala Glu Gln Gly Arg Leu Cys Gly Tyr Arg Leu Arg Lys

675 680 685

Asp Leu Thr Thr Glu Leu Ser Trp Glu Leu Thr Ile Pro Pro Glu Val

690 695 700

Gln Arg Ile Val Lys Val Lys Gly Lys Arg Ser Ser Glu His Val His

705 710 715 720

Ser Gln Gly Arg Val Met Gly Asp Arg Ser Val Leu Tyr Lys Ser Leu

725 730 735

Asn Pro Asn Leu Leu Ala Val Val Thr Glu Ser Thr Asp Ala His His

740 745 750

Glu Arg Thr Phe Ile Gly Ile Phe Leu Ile Asp Gly Val Thr Gly Arg

755 760 765

Ile Ile His Ser Ser Val Gln Lys Lys Ala Lys Gly Pro Val His Ile

770 775 780

Val His Ser Glu Asn Trp Val Val Tyr Gln Tyr Trp Asn Thr Lys Ala

785 790 795 800

Arg Arg Asn Glu Phe Thr Val Leu Glu Leu Tyr Glu Gly Thr Glu Gln

805 810 815

Tyr Asn Ala Thr Ala Phe Ser Ser Leu Asp Arg Pro Gln Leu Pro Gln

820 825 830

Val Leu Gln Gln Ser Tyr Ile Phe Pro Ser Ser Ile Ser Ala Met Glu

835 840 845

Ala Thr Ile Thr Glu Arg Gly Ile Thr Ser Arg His Leu Leu Ile Gly

850 855 860

Leu Pro Ser Gly Ala Ile Leu Ser Leu Pro Lys Ala Leu Leu Asp Pro

865 870 875 880

Arg Arg Pro Glu Ile Pro Thr Glu Gln Ser Arg Glu Glu Asn Leu Ile

885 890 895

Pro Tyr Ser Pro Asp Val Gln Ile His Ala Glu Arg Phe Ile Asn Tyr

900 905 910

Asn Gln Thr Val Ser Arg Met Arg Gly Ile Tyr Thr Ala Pro Ser Gly

915 920 925

Leu Glu Ser Thr Cys Leu Val Val Ala Tyr Gly Leu Asp Ile Tyr Gln

930 935 940

Thr Arg Val Tyr Pro Ser Lys Gln Phe Asp Val Leu Lys Asp Asp Tyr

945 950 955 960

Asp Tyr Val Leu Ile Ser Ser Val Leu Phe Gly Leu Val Phe Ala Thr

965 970 975

Met Ile Thr Lys Arg Leu Ala Gln Val Lys Leu Leu Asn Arg Ala Trp

980 985 990

Arg

<210> 2

<211> 2982

<212> DNA

<213> 野生型的EMC1 cDNA序列(wild type EMC1 cDNA)

<400> 2

atggcggctg agtgggcttc tcgtttctgg ctttgggcta cgctgctgat tcctgcggcc 60

gcggtctacg aagaccaagt gggcaagttt gattggagac agcaatatgt tgggaaggtc 120

aagtttgcct ccttggaatt ttcccctgga tccaagaagt tggttgtagc cacagagaag 180

aatgtgattg cagcattaaa ttcccgaact ggggagatct tgtggcgcca tgttgacaag 240

ggcacggcag aaggggctgt ggatgccatg ctgctgcacg gacaggatgt gatcactgtg 300

tccaatggag gccgaatcat gcgttcctgg gagactaaca tcgggggcct gaactgggag 360

ataaccctgg acagtggcag tttccaggca cttgggctgg ttggcctgca ggagtctgta 420

aggtacatcg cagtcctgaa gaagactaca cttgccctcc atcacctctc cagtgggcac 480

ctcaagtggg tggaacatct cccagaaagt gacagcatcc actaccagat ggtgtattct 540

tacggctctg gggtggtgtg ggccctcgga gttgttccct tcagccatgt gaacattgtc 600

aagtttaatg tggaagatgg agagattgtt cagcaggtta gggtttcaac tccgtggctg 660

cagcacctgt ctggagcctg tggtgtggtg gatgaggctg tcctggtgtg tcctgacccg 720

agctcacgtt ccctccaaac tttggctctg gagacggaat gggagttgag acagatccca 780

ctgcagtctc tcgacttaga atttggaagt ggattccaac cccgggtcct gcctacccag 840

cccaacccag tggacgcttc ccgggcccag ttcttcctgc acttgtcccc aagccactat 900

gctctgctgc agtaccatta tggaacgctg agtttgctta aaaacttccc acagactgcc 960

ctagtgagct ttgccaccac tggggagaag acggtggctg cagtcatggc ctgtcggaat 1020

gaagtgcaga aaagtagcag ttctgaagat gggtcaatgg ggagcttttc ggagaagtct 1080

agttcaaagg actctctggc ttgcttcaat cagacctaca ccattaacct atacctcgtg 1140

gagacaggtc ggcggctgct ggacaccacg ataacattta gcctggaaca gagcggcact 1200

cggcctgagc ggctgtatat ccaggtgttc ttgaagaagg atgactcagt gggctaccgg 1260

gctttggtgc agacagagga tcatctgcta cttttcctgc agcagttggc agggaaggtg 1320

gtgctgtgga gccgtgagga gtccctggca gaagtggtgt gcctagagat ggtggacctc 1380

cccctgactg gggcacaggc cgagctggaa ggagaatttg gcaaaaaggc agatggcttg 1440

ctggggatgt tcctgaaacg cctctcgtct cagcttatcc tgctgcaagc atggacttcc 1500

cacctctgga aaatgtttta tgatgctcgg aagccccgga gtcagattaa gaatgagatc 1560

aacattgaca ccctggccag agatgaattc aacctccaga agatgatggt gatggtaaca 1620

gcctcaggca agctttttgg cattgagagc agctctggca ccatcctgtg gaaacagtat 1680

ctacccaatg tcaagccaga ctcctccttt aaactgatgg tccagagaac tactgctcat 1740

ttcccccatc ccccacagtg caccctgctg gtgaaggaca aggagtcggg aatgagttct 1800

ctgtatgtct tcaatcccat ttttgggaag tggagtcagg tagctccccc agtgctgaag 1860

cgccccatct tgcagtcctt gcttctccca gtcatggatc aagactacgc caaggtgttg 1920

ctgttgatag atgatgaata caaggtcaca gcttttccag ccactcggaa tgtcttgcga 1980

cagctacatg agcttgcccc ttccatcttc ttctatttgg tggatgcaga gcagggacgg 2040

ctgtgtggat atcggcttcg aaaggatctc accactgagc tgagttggga gctgaccatt 2100

cccccagaag tacagcggat cgtcaaggtg aaggggaaac gcagcagtga gcacgttcat 2160

tcccagggcc gtgtgatggg ggaccgcagt gtgctctaca agagcctgaa ccccaacctg 2220

ctggccgtgg tgacagagag cacagacgcg caccatgagc gcacctttat tggcatcttc 2280

ctcattgatg gcgtcactgg gcgtatcatt cactcctctg tgcagaagaa agccaaaggc 2340

cctgtccata tcgtgcattc agagaactgg gtggtgtacc agtactggaa caccaaggct 2400

cggcgcaacg agtttaccgt actggagctc tatgagggca ctgagcaata caacgccacc 2460

gccttcagct ccctggaccg cccccagctg ccccaggtcc tccagcagtc ctatatcttc 2520

ccgtcctcca tcagtgccat ggaggccacc atcaccgaac ggggcatcac cagccgacac 2580

ctgctgattg gactaccttc tggagcaatt ctttcccttc ctaaggcttt gctggatccc 2640

cgccgccccg agatcccaac agaacaaagc agagaggaga acttaatccc gtattctcca 2700

gatgtacaga tacacgcaga gcgattcatc aactataacc agacagtttc tcgaatgcga 2760

ggtatctaca cagctccctc gggtctggag tccacttgtt tggttgtggc ctatggtttg 2820

gacatttacc aaactcgagt ctacccatcc aagcagtttg acgttctgaa ggatgactat 2880

gactacgtgt taatcagcag cgtcctcttt ggcctggttt ttgccaccat gatcactaag 2940

agactggcac aggtgaagct cctgaatcgg gcctggcgat aa 2982

<210> 3

<211> 2982

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcagctg aatgggcatc tagattctgg ctctgggcaa ctttgcttat tcctgctgct 60

gcagtctacg aggatcaagt aggtaagttc gattggcggc aacagtacgt cggcaaggtt 120

aagttcgcct cattggagtt ctctccaggt agtaagaaac tggtggtcgc cacagagaag 180

aatgtcatcg cggccctcaa ctcaagaaca ggcgagatcc tctggcgcca tgtggacaaa 240

ggcacggctg agggtgcagt tgacgctatg ctgctgcacg gacaggatgt aattaccgtg 300

agcaatggag gtagaatcat gcggagttgg gagactaaca tcggcggcct gaactgggaa 360

attactctgg atagcggtag ctttcaagct cttggacttg tcgggctgca ggaatccgtg 420

agatacatcg ccgttctgaa gaaaactacg ctcgcactgc atcacctgag ctccggacat 480

ctgaaatggg tggaacatct gccagagtcc gacagcatcc actaccagat ggtgtacagc 540

tacggatcag gagttgtttg ggccctgggg gtcgtcccat tctctcatgt gaatattgtc 600

aagttcaacg tcgaagacgg agagattgta cagcaggtga gagtgagcac gccttggctc 660

cagcatctca gcggcgcttg tggcgttgtc gacgaagcag ttctcgtctg ccctgaccct 720

tcttctcggt ccctccagac cctcgcattg gagaccgagt gggaactgcg gcagatcccc 780

ctgcaaagtc tcgacctgga gtttgggtcc gggttccagc ccagggttct tccaacacag 840

ccgaatccgg ttgatgcttc cagggcacag tttttccttc atcttagtcc gtctcactat 900

gccctgctcc agtaccacta tggcacgctg agccttctca aaaacttccc ccaaactgcc 960

ctggtttcat ttgctactac tggtgaaaaa actgtggccg ctgttatggc ctgtcgcaac 1020

gaagtgcaaa aaagcagctc atctgaggac ggatcaatgg gatcattttc cgaaaaaagt 1080

agttcaaaag attctctcgc ctgctttaat caaacttaca ctatcaatct ctacctcgtc 1140

gagactggcc ggagactgct cgatacaact attacatttt ccctggaaca gtctggaacc 1200

cgacccgaga ggttgtacat acaggtgttt ctcaaaaaag acgatagcgt gggatataga 1260

gccctggttc agaccgagga ccatctcctc ctgttcctgc aacagctcgc cggaaaagtg 1320

gtgctgtgga gcagagagga gtcacttgcc gaggtggtct gtctggagat ggttgatctg 1380

ccactcacag gcgcccaagc ggagttggaa ggcgagttcg gtaagaaagc tgatggtctc 1440

cttggaatgt tcctgaaaag gctgagctct cagctcatcc ttttgcaggc ttggacaagt 1500

cacctttgga aaatgtttta cgatgctcgg aagccccgat cacaaataaa gaacgagatt 1560

aacatcgata cactcgccag agacgaattt aacctgcaaa agatgatggt tatggtgaca 1620

gcatcaggca aactgtttgg catcgagtca tcctctggca caatcctgtg gaaacagtac 1680

cttcccaacg tgaagcccga tagcagcttc aagctgatgg tgcagcggac aactgcacac 1740

tttccacatc caccgcagtg tacgttgctc gtgaaggata aggagtccgg aatgtcctct 1800

ctgtacgtgt tcaaccccat ctttggtaaa tggtctcagg ttgcgccccc agtcctgaaa 1860

agacctatcc tgcagagtct tctcctccct gtaatggacc aggactacgc caaggttctt 1920

cttctcattg atgacgaata caaggttact gctttcccag ctacaagaaa tgtgctgcga 1980

cagcttcacg agcttgcacc gagcatcttc ttttacctgg tggatgctga acaggggagg 2040

ttgtgcgggt atagactgcg gaaggacctt accaccgaac tgtcatggga gctcaccatc 2100

ccccctgaag tgcagcgaat cgtcaaagtg aaaggcaagc gctctagcga gcacgtccac 2160

tctcagggac gggtgatggg cgacaggagt gttctctaca agtcccttaa ccccaatctc 2220

cttgctgtgg ttacagagag caccgatgct catcacgaga gaacgtttat aggcatattc 2280

ctgatcgacg gagtgaccgg cagaattatc cattccagcg ttcaaaagaa ggccaagggg 2340

cctgtacaca tcgtgcactc tgagaactgg gttgtttacc agtactggaa cactaaggcc 2400

agaagaaatg aatttaccgt tctcgaactg tatgaaggaa cagagcagta taatgcgaca 2460

gccttctcat ccctggatcg cccgcaactg ccacaagtgc tgcagcagtc atacatcttt 2520

ccatctagta taagcgccat ggaagctacc ataaccgaga ggggtattac ctctaggcat 2580

ctgctgattg gtctgccatc tggagccatc ttgtcccttc ccaaagcgct cttggatcca 2640

aggcggcctg aaatcccgac tgaacaatct cgagaagaaa accttatccc ttacagcccc 2700

gacgtgcaaa tacatgccga acgcttcatc aattataatc agacagtttc caggatgcgg 2760

ggtatctata ccgccccctc cgggttggaa agcacttgtc tcgtggtggc ctacgggctg 2820

gatatttatc agactagggt gtaccccagc aagcaattcg atgttctgaa ggatgactat 2880

gactatgtcc tgatctcatc tgtgcttttc ggtctggtgt tcgcaaccat gatcacaaaa 2940

aggctggccc aggtgaaact tctgaatagg gcgtggagat ga 2982

<210> 4

<211> 203

<212> DNA

<213> CMV启动子序列(CMV promoter)

<400> 4

gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60

ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt gcaccaaaat caacgggact 120

ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt 180

gggaggtcta tataagcaga gct 203

Claims

1.一种EMC1核苷酸序列，其特征在于，其与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列有≥95％相同性，优选地与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列有≥98％相同性，更优选地与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列有≥99％相同性。

2.根据权利要求1所述核苷酸序列，其特征在于，其序列如SEQ ID NO:3所示。

3.根据权利要求1或2所述核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为cDNA序列。

4.权利要求1-3任意一项所述核苷酸序列在制备预防或治疗EMC1突变导致的眼部疾病的病毒载体或药物制剂中的应用，或在预防或治疗EMC1突变导致的眼部疾病中的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述EMC1突变导致的眼部疾病为EMC1突变导致视网膜色素变性。

6.一种病毒载体，其特征在于，其包含有权利要求1-3任意一项所述核苷酸序列。

7.根据权利要求6所述病毒载体，其特征在于，所述病毒载体为腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体。

8.根据权利要求7所述病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体的血清型为AAV2野生型或AAV2/2.7M8。

9.根据权利要求6-8任意一项所述病毒载体，其特征在于，所述病毒载体由启动子CMV调控EMC1蛋白的表达。

10.权利要求6-9任意一项所述病毒载体在制备预防或治疗EMC1突变导致的眼部疾病的药物制剂中的应用，或在预防或治疗EMC1突变导致的眼部疾病中的应用。

11.根据权利要求10所述应用，其特征在于，所述EMC1突变导致的眼部疾病为EMC1突变导致视网膜色素变性。

12.一种药物制剂，其特征在于，包含如权利要求1-3任一项所述的核苷酸序列或权利要求6-9任一项所述的病毒载体。

13.根据权利要求12所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为液体制剂。

14.根据权利要求12或13所述药物制剂，其特征在于，还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

15.权利要求12-14任意一项所述的药物制剂在预防或治疗EMC1突变导致的眼部疾病中的应用。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述EMC1突变导致的眼部疾病为EMC1突变导致视网膜色素变性。

17.一种药物制剂的递送方法，其特征在于，将权利要求12-14任意一项所述药物制剂通过视网膜下注射或者玻璃体腔注射至眼部。