CN112514797A

CN112514797A - 一种桃砧木培养基及其使用方法

Info

Publication number: CN112514797A
Application number: CN202011525613.9A
Authority: CN
Inventors: 王鸿; 张雪冰; 张帆; 陈建军; 李宽莹; 李小兰
Original assignee: INSTITUTE OF FRUIT AND FLORICULTURE RESEARCH GANSU ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE OF FRUIT AND FLORICULTURE RESEARCH GANSU ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2040-12-22
Also published as: CN112514797B

Abstract

本发明提供了一种桃砧木培养基及其使用方法，先将外植体采用初代培养基进行诱导培养，得到初代组培苗；将所述初代组培苗用增殖培养基进行继代培养，继代培养过程中，切取新梢转接入生根培养基进行生根培养，显著提高组培苗增殖系数、生根率、平均根长及平均根数量。本发明只有3种培养基配方，极大的简化了生产步骤。

Description

一种桃砧木培养基及其使用方法

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，特别是涉及一种桃砧木培养基及其使用方法。

背景技术

桃属于蔷薇科落叶乔木果树，成熟时颜色鲜红，营养丰富，是重要的果树，具有很高的食用和药用价值，在我国广泛栽培，发展潜力巨大。采用组织培养技术可以快速繁殖作物新品种，加快新品种的培养基推广速度，同时植物组织培养培育的组培苗，遗传基因高度一致，生产稳定，苗木品质性能好,能为产业化生产提供优质的苗木。

我国植物组织培养的研究从20世纪50年代开始，至今培养基已有六七十年的历史，组织培养的发展进展快速，已有丰硕的研究成果,尤其近10多年来培养基全国各地许多农业科研院所和高校都开展了植物组织培养研究工作，其发展更为迅速，培养基研究范围涉及农作物、观赏植物、园艺作物、经济林木等上千种植物品种，植物茎尖培养脱病培养基毒技术以及离体快繁技术也日趋成熟。但我国植物组织培养中仍然存在很多问题,其中茎尖培养基常出现的主要致命问题如组培苗的污染、褐化、玻璃化以及繁殖系数较低等,很多技术环节培养基至今未能达到理想效果导致不能进行规模化生产，阻碍了我国组培脱毒苗木的规模化生产培养基进程。

培养基植物的组织培养是否成功，在很大程度上取决于培养基选用是否合适。培养基好比土壤，是组织培养中离体材料赖以生存和发展的基地，而选择培养基更应该综合考虑植培养基物组织不同材料以及不同生长阶段，根据植物生长需要配置最适合的培养基。培养基的产生最早是Sacks培养基(1680)和Knop培养基(1681),他们根据植物从土中主要是吸收无机盐营养,设计培养基出了由无机盐组成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应培养基用。40年代White培养基用得较多。而到60和70年代则大多采用MS等高浓度培养基，可以保证培养材料对营养的需要，并能生长快、分化快。

目前，我国主要采用微茎尖技术、组织培养技术繁培养基育具有生长优势的良种果树脱毒种苗，一般采用MS基本培养基，与其它培养基的基本成分培养基相比,MS培养基中的硝酸盐、钾和钙的含量高。MS基本培养基较高的无机盐浓度，对保证组培养基织生长所需的矿质营养和加速愈伤组织的生长十分有利。由于配方中的离子浓度高，在配培养基制、贮存、消毒等过程中，即使有些成分略有出入,也不致影响离子间的平衡。MS固体培养基可用来诱导愈伤组织，或用于胚、茎段、茎尖及花药培养，它的液体培养基用于细胞悬浮培培养基养时能获得明显成功。这种培养基中的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细培养基胞在营养上和生理上的需要。

GF677(P .amygdalus×P .persica)桃砧木由法国INRA(Institut National dela Recherche Agronomique)于20 世纪60 年代杂交选育而成, 根系发达，长势健壮，树冠高大，与桃/油桃品种间嫁接亲和力强，并具有抗钙质碱性土缺铁性黄化、耐重茬、耐旱等优良特性。由于其为无性系砧木，不能采用种子繁殖，GF677 通过营养繁殖的方式才能保持其优良的遗传特性,采用常规的扦插方法进行繁殖时，育苗成活率较低、季节性强、一致性差、繁殖系数低，采用常规的组培方法进行繁殖时，试管苗增殖系数低，平均生根率、平均根数较低，根长较短，在短期内不能大量繁殖。法国、意大利、西班牙、土耳其等国都通过组培快繁大量的GF677 用于生产，尽管国外GF677 组培快繁技术较为成熟, 但关于GF677 的组培快繁技术核心极少报道，国内有少量关于GF677 的组培快繁技术研究相关报道，但繁殖效率不高，还存在褐变、玻璃化等致命问题。桃树生产周期较短，老龄桃树重茬果园及一些碱性土壤的新植桃园急需GF677 这类优良抗性砧木。

发明内容

本发明的目的就是要提供一种桃砧木培养基及其使用方法，通过建立GF677 离体快繁技术体系，为GF677的工厂化育苗提供参考，为GF677等桃砧木种质资源离体保存奠定技术基础，显著提高了试管苗的增殖系数、生根率、平均根长和平均根数。

为实现上述目的，本发明是通过如下方案实现的：

一种桃砧木培养基，包含：

(a)初始培养基：

所述初始培养基是在1/2 MS培养基中添加6-BA（6-苄氨基嘌呤）、NAA（1-萘乙酸）和GA3（赤霉素）而得，6-BA的终浓度为0.5～1.0 mg/L，NAA的终浓度为0.01～0.2 mg/L，GA3的终浓度为0.2～0.5mg/L，初始培养基的pH为5.5～5.8；

(b)增殖培养基：

所述增殖培养基是在ER培养基中添加6-BA、IBA（吲哚丁酸）而得，6-BA的终浓度为0.5～1.0mg/L,IBA的终浓度为0.05～0.2mg/L,增殖培养基的pH为5.5～5.8；

(c)生根培养基：

所述生根培养基是在ER培养基中添加IBA和纳米凝胶后得到的培养基，IBA的终浓度为0.4～1.2mg/L,所述纳米凝胶的终浓度为0.8～1.2mg/L,生根培养基的pH为5.5～5.8。

优选的，所述MS培养基包含：NH₄NO₃1320～1980mg/L，KNO₃1520～2280mg/L，CaCl₂·2H₂O 352～528mg/L，MgSO₄·7H₂O 298～442mg/L，KH₂PO₄136～204mg/L，KI 0.664～0.996mg/L，H₂BO₃4.96～6.4mg/L，MnSO₄·4H₂O 17.84～26.76mg/L，ZnSO₄·7H₂O 6.88～10.32mg/L，Na₂MoO₄·5H₂O 0.20～0.30mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.020～0.030mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025 ～0.030mg/L，FeSO₄·7H₂O 22.24～33.40mg/L，Na₂-EDTA·2H₂O 29.84～44.76mg/L，肌醇80～120mg/L，烟酸0.4～0.6mg/L，甘氨酸1.6～2.4mg/L，盐酸吡哆醇 0.4～0.6mg/L，盐酸硫胺素0.08～0.12mg/L。

优选的，所述ER培养基包含：NH₄NO₃1200mg/L，KNO₃1900mg/L，CaCl₂ 332.02mg/L，MgSO₄ 180.54mg/L，KH₂PO₄340mg/L，H₂BO₃0.63mg/L，MnSO₄·H₂O 1.69mg/L，ZnSO₄·7H₂O9.15mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.025mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.0025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.0025mg/L，FeNaEDTA 36.7mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L。

优选的，所述初始培养基、增殖培养基、生根培养基中均含有蔗糖和琼脂，蔗糖的终浓度为18～20g/L，琼脂的终浓度为6～7g/L。

优选的，所述增殖培养基中还添加GA3，其终浓度为0.5～3mg/L。

优选的，以重量份计，所述生根培养基中的纳米凝胶是通过以下方法制备得到的：将1份硒酸钠溶于10～12份无水乙醇的盐酸溶液中，低温等离子反应器中反应10～20min后加入5～7份钛酸异丙酯继续反应20～30min，反应温度为-12～-6℃，反应完毕后加入0.1～0.2份蛹虫草微粒，超声波振荡均匀；调节pH为2～3，再置于低温等离子体反应器内-5～0℃静置12小时以上，形成均一溶胶，再取出蒸发干燥转变为凝胶，得纳米凝胶；其中，所述无水乙醇的盐酸溶液是将无水乙醇加入6～8倍重量的10～12mol/L盐酸溶液中，超声波振荡均匀而得。

进一步优选的，所述蛹虫草微粒是先将蛹虫草于70～80℃烘干，粉碎至40～50目，再超微粉碎至粒径1μm以下，即得。

上述一种桃砧木培养基的使用方法，先将外植体采用初始培养基进行诱导培养，得到初代组培苗，然后将所述初代组培苗用增殖培养基进行增殖培养，增殖培养即为继代培养，继代培养过程中，取新梢段转入生根培养基进行生根培养；其中，初始培养基中的培养条件为：培养温度20～22℃,每天光照14～16小时、黑暗8～10小时，光照强度为1800～2000lx，第一代3天后更换一次初始培养基，28天后转增殖培养基；增殖培养基中的培养条件为：培养温度20～22℃,每天光照14～16小时、黑暗8～10小时，光照强度为1800～2000lx，培养时间为28～32天；生根培养基的培养条件为：培养温度22～24℃，黑暗培养13～14天；后转入培养温度20～22℃,每天光照14～16小时、黑暗8～10小时，光照强度为1800～2200lx，培养时间为35～40天。

优选的，所述外植体为春季萌发10cm以内的新梢段，具体培养方法如下：前一年10月份到12月份，从果园采集一年生枝条,保存于4℃培养基冰箱；当年2月下旬到3月上旬，取枝条插入无菌水中，22～25℃,每天光照8小时,黑暗16小时,光培养基照强度1500～2000lx,催芽，每7天换一次新鲜无菌水；4月上中旬，待芽萌动后，取多个带芽茎段，剪成1～1.5cm高、带一个嫩芽的茎段。

优选的，所述外植体进行消毒处理，具体方法如下：先用含100mg/L羧苄青霉素的自来水浸泡处理2.5小时后,再采用混合消毒液涡旋振荡5～8分钟,接着剥去苞片，混合消毒液再次消毒5～8分钟。

进一步优选的，所述混合消毒液是通过以下方法制备得到的：从爱力克TMA-B中，取一片A片和一片B片溶于培养基500ml无菌水，加入终质量浓度为0.01%的吐温20，搅拌混匀，即得混合消毒液；在混合消毒培养基液中，爱力克A、B的浓度均为500mg/L。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

（1）本发明先将外植体采用初代培养基进行诱导培养，得到初代组培苗；将所述初代组培苗用增殖培养基进行继代培养，继代培养过程中，切取新梢转接入生根培养基进行生根培养，显著提高组培苗增殖系数、生根率、平均根长及平均根数量。本发明只有3种培养基配方，极大的简化了生产步骤。

（2）与常规扦插繁殖方法相比，本发明克服了桃砧木GF677苗扦插繁殖系数低的缺点,获得大量无性系试管苗，其遗传性状稳定、增殖率高,为遗传转化和扩大栽培面积提供了大量的试管苗。

（3）本发明采用春季10cm以内的新梢为外植体，降低了污染与褐化，缩短了丛生芽生长时间；取消酒精消毒，缩短杀菌剂的消毒时间，提高了成活率。

（4）与常规组培方法相比，本发明的消毒方式利用爱力克TMA-B代替升汞，安全无毒，采用春季萌发的10cm新梢段作为外植体,降低了褐化率和污染率；初始培养第一代在初始培养基上3天后立即转入新的初始培养基，进一步降低了褐化率；组培苗增殖系数显著提高，增殖过程即继代过程，过程中可产生大量3cm以上的新梢，生长健康，叶片平展，叶片绿色,无玻璃化现象，可用于生根培养；本发明生根方法显著提高组培苗增殖系数、生根率、平均根长和平均根数。

（5）本发明在生根培养基中加入了纳米凝胶，是以硒酸钠、钛酸异丙酯和蛹虫草微粒为原料制备得到，纳米粒经，更易吸收，硒、钛以及蛹虫草中的氨基酸、维生素等共同提供营养支持，促进根生长，进一步提高生根率、平均根长和平均根数。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种桃砧木培养基，包含：

(a)初始培养基：

所述初始培养基是在1/2 MS培养基中添加6-BA（6-苄氨基嘌呤）、NAA（1-萘乙酸）和GA3（赤霉素）而得，6-BA的终浓度为0.5 mg/L，NAA的终浓度为0.2 mg/L，GA3的终浓度为0.2mg/L，初始培养基的pH为5.8；

(b)增殖培养基：

所述增殖培养基是在ER培养基中添加6-BA、IBA（吲哚丁酸）而得，6-BA的终浓度为0.5mg/L,IBA的终浓度为0.2mg/L,增殖培养基的pH为5.5；

(c)生根培养基：

所述生根培养基是在ER培养基中添加IBA和纳米凝胶后得到的培养基，IBA的终浓度为1.2mg/L,所述纳米凝胶的终浓度为0.8mg/L,生根培养基的pH为5.8。

所述MS培养基包含：NH₄NO₃1320mg/L，KNO₃2280mg/L，CaCl₂·2H₂O 352mg/L，MgSO₄·7H₂O 442mg/L，KH₂PO₄136mg/L，KI 0.996mg/L，H₂BO₃4.96mg/L，MnSO₄·4H₂O26.76mg/L，ZnSO₄·7H₂O 6.88mg/L，Na₂MoO₄·5H₂O 0.30mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.020mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.030mg/L，FeSO₄·7H₂O 22.24mg/L，Na₂-EDTA·2H₂O 44.76mg/L，肌醇80mg/L，烟酸0.6mg/L，甘氨酸1.6mg/L，盐酸吡哆醇0.6mg/L，盐酸硫胺素0.08mg/L。

所述ER培养基包含：NH₄NO₃1200mg/L，KNO₃1900mg/L，CaCl₂ 332.02mg/L，MgSO₄180.54mg/L，KH₂PO₄340mg/L，H₂BO₃0.63mg/L，MnSO₄·H₂O 1.69mg/L，ZnSO₄·7H₂O 9.15mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.025mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.0025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.0025mg/L，FeNaEDTA 36.7mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L。

所述初始培养基、增殖培养基、生根培养基中均含有蔗糖和琼脂，蔗糖的终浓度为20g/L，琼脂的终浓度为6g/L。

所述生根培养基中的纳米凝胶是通过以下方法制备得到的：将1g硒酸钠溶于10g无水乙醇的盐酸溶液中，低温等离子反应器中反应20min后加入5g钛酸异丙酯继续反应30min，反应温度为-12℃，反应完毕后加入0.2g蛹虫草微粒，超声波振荡均匀；调节pH为2，再置于低温等离子体反应器内0℃静置12小时以上，形成均一溶胶，再取出蒸发干燥转变为凝胶，得纳米凝胶；其中，所述无水乙醇的盐酸溶液是将无水乙醇加入6倍重量的2mol/L盐酸溶液中，超声波振荡均匀而得。

所述蛹虫草微粒是先将蛹虫草于70℃烘干，粉碎至50目，再超微粉碎至粒径1μm以下，即得。

上述一种桃砧木培养基的使用方法，先将外植体采用初始培养基进行诱导培养，得到初代组培苗，然后将所述初代组培苗用增殖培养基进行增殖培养，增殖培养即为继代培养，继代培养过程中，取新梢段转入生根培养基进行生根培养；其中，初始培养基中的培养条件为：培养温度20℃,每天光照16小时、黑暗8小时，光照强度为2000lx， 28天后转增殖培养基；增殖培养基中的培养条件为：培养温度20℃,每天光照16小时、黑暗8小时，光照强度为2000lx，培养时间为28天；生根培养基的培养条件为：培养温度24℃，黑暗培养13天；后转入培养温度22℃,每天光照14小时、黑暗10小时，光照强度为1800lx，培养时间为40天。

所述外植体为春季萌发10cm以内的新梢段，具体培养方法如下：前一年10月份到12月份，从果园采集一年生枝条,保存于4℃培养基冰箱；当年2月下旬到3月上旬，取枝条插入无菌水中，22℃,每天光照8小时,黑暗16小时,光培养基照强度2000lx,催芽，每7天换一次新鲜无菌水；4月上中旬，待芽萌动后，取多个带芽茎段，剪成1cm高、带一个嫩芽的茎段。

所述外植体进行消毒处理，具体方法如下：先用含100mg/L羧苄青霉素的自来水浸泡处理2.5小时后,再采用混合消毒液涡旋振荡8分钟,接着剥去苞片，混合消毒液再次消毒5分钟。

所述混合消毒液是通过以下方法制备得到的：从爱力克TMA-B中，取一片A片和一片B片溶于培养基500ml无菌水，加入终质量浓度为0.01%的吐温20，搅拌混匀，即得混合消毒液；在混合消毒培养基液中，爱力克A、B的浓度均为500mg/L。

实施例2：

一种桃砧木培养基，包含：

(a)初始培养基：

所述初始培养基是在1/2 MS培养基中添加6-BA（6-苄氨基嘌呤）、NAA（1-萘乙酸）和GA3（赤霉素）而得，6-BA的终浓度为1.0 mg/L，NAA的终浓度为0.01 mg/L，GA3的终浓度为0.5mg/L，初始培养基的pH为5.5；

(b)增殖培养基：

所述增殖培养基是在ER培养基中添加6-BA、IBA（吲哚丁酸）而得，6-BA的终浓度为1.0mg/L,IBA的终浓度为0.05mg/L,增殖培养基的pH为5.8；

(c)生根培养基：

所述生根培养基是在ER培养基中添加IBA和纳米凝胶后得到的培养基，IBA的终浓度为0.4mg/L,所述纳米凝胶的终浓度为1.2mg/L,生根培养基的pH为5.5。

所述MS培养基包含：NH₄NO₃1980mg/L，KNO₃1520mg/L，CaCl₂·2H₂O 528mg/L，MgSO₄·7H₂O 298mg/L，KH₂PO₄204mg/L，KI 0.664mg/L，H₂BO₃6.4mg/L，MnSO₄·4H₂O17.84mg/L，ZnSO₄·7H₂O 10.32mg/L，Na₂MoO₄·5H₂O 0.20mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.030mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，FeSO₄·7H₂O 33.40mg/L，Na₂-EDTA·2H₂O 29.84mg/L，肌醇120mg/L，烟酸0.4mg/L，甘氨酸2.4mg/L，盐酸吡哆醇 0.4mg/L，盐酸硫胺素0.12mg/L。

所述初始培养基、增殖培养基、生根培养基中均含有蔗糖和琼脂，蔗糖的终浓度为18g/L，琼脂的终浓度为7g/L。

所述生根培养基中的纳米凝胶是通过以下方法制备得到的：将1g硒酸钠溶于12g无水乙醇的盐酸溶液中，低温等离子反应器中反应10min后加入7g钛酸异丙酯继续反应20min，反应温度为-6℃，反应完毕后加入0.1g蛹虫草微粒，超声波振荡均匀；调节pH为3，再置于低温等离子体反应器内-5℃静置12小时以上，形成均一溶胶，再取出蒸发干燥转变为凝胶，得纳米凝胶；其中，所述无水乙醇的盐酸溶液是将无水乙醇加入8倍重量的10mol/L盐酸溶液中，超声波振荡均匀而得。

所述蛹虫草微粒是先将蛹虫草于80℃烘干，粉碎至40目，再超微粉碎至粒径1μm以下，即得。

上述一种桃砧木培养基的使用方法，先将外植体采用初始培养基进行诱导培养，得到初代组培苗，然后将所述初代组培苗用增殖培养基进行增殖培养，增殖培养即为继代培养，继代培养过程中，取新梢段转入生根培养基进行生根培养；其中，初始培养基中的培养条件为：培养温度22℃,每天光照14小时、黑暗10小时，光照强度为1800lx，28天后转增殖培养基；增殖培养基中的培养条件为：培养温度22℃,每天光照14小时、黑暗10小时，光照强度为1800lx，培养时间为32天；生根培养基的培养条件为：培养温度22℃，黑暗培养14天；后转入培养温度20℃,每天光照16小时、黑暗8小时，光照强度为2200lx，培养时间为35天。

所述外植体为春季萌发10cm以内的新梢段，具体培养方法如下：前一年10月份到12月份，从果园采集一年生枝条,保存于4℃培养基冰箱；当年2月下旬到3月上旬，取枝条插入无菌水中， 25℃,每天光照8小时,黑暗16小时,光培养基照强度1500lx,催芽，每7天换一次新鲜无菌水；4月上中旬，待芽萌动后，取多个带芽茎段，剪成1.5cm高、带一个嫩芽的茎段。

所述外植体进行消毒处理，具体方法如下：先用含100mg/L羧苄青霉素的自来水浸泡处理2.5小时后,再采用混合消毒液涡旋振荡5分钟,接着剥去苞片，混合消毒液再次消毒8分钟。

实施例3：

一种桃砧木培养基，包含：

(a)初始培养基：

所述初始培养基是在1/2 MS培养基中添加6-BA（6-苄氨基嘌呤）、NAA（1-萘乙酸）和GA3（赤霉素）而得，6-BA的终浓度为0.8 mg/L，NAA的终浓度为0.1 mg/L，GA3的终浓度为0.3mg/L，初始培养基的pH为5.6；

(b)增殖培养基：

所述增殖培养基是在ER培养基中添加6-BA、IBA（吲哚丁酸）而得，6-BA的终浓度为0.8mg/L,IBA的终浓度为0.15mg/L,增殖培养基的pH为5.7；

(c)生根培养基：

所述生根培养基是在ER培养基中添加IBA和纳米凝胶后得到的培养基，IBA的终浓度为1mg/L,所述纳米凝胶的终浓度为1mg/L,生根培养基的pH为5.6。

所述MS培养基包含：NH₄NO₃1550mg/L，KNO₃2000mg/L，CaCl₂·2H₂O 465mg/L，MgSO₄·7H₂O 336mg/L，KH₂PO₄175mg/L，KI 0.753mg/L，H₂BO₃5.5mg/L，MnSO₄·4H₂O20.33mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.15mg/L，Na₂MoO₄·5H₂O 0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.028mg/L，FeSO₄·7H₂O 30.05mg/L，Na₂-EDTA·2H₂O 40.08mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸吡哆醇 0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L。

所述初始培养基、增殖培养基、生根培养基中均含有蔗糖和琼脂，蔗糖的终浓度为19g/L，琼脂的终浓度为6.5g/L。

所述增殖培养基中还添加GA3，其终浓度为2mg/L。

所述生根培养基中的纳米凝胶是通过以下方法制备得到的：将1g硒酸钠溶于11g无水乙醇的盐酸溶液中，低温等离子反应器中反应15min后加入6g钛酸异丙酯继续反应25min，反应温度为-10℃，反应完毕后加入0.15g蛹虫草微粒，超声波振荡均匀；调节pH为2.5，再置于低温等离子体反应器内-2℃静置12小时以上，形成均一溶胶，再取出蒸发干燥转变为凝胶，得纳米凝胶；其中，所述无水乙醇的盐酸溶液是将无水乙醇加入7倍重量的11mol/L盐酸溶液中，超声波振荡均匀而得。

所述蛹虫草微粒是先将蛹虫草于75℃烘干，粉碎至50目，再超微粉碎至粒径1μm以下，即得。

上述一种桃砧木培养基的使用方法，先将外植体采用初始培养基进行诱导培养，得到初代组培苗，然后将所述初代组培苗用增殖培养基进行增殖培养，增殖培养即为继代培养，继代培养过程中，取新梢段转入生根培养基进行生根培养；其中，初始培养基中的培养条件为：培养温度21℃,每天光照15小时、黑暗9小时，光照强度为1900lx，第一代3天后更换一次初始培养基，28天后转增殖培养基；增殖培养基中的培养条件为：培养温度21℃,每天光照15小时、黑暗9小时，光照强度为1900lx，培养时间为30天；生根培养基的培养条件为：培养温度23℃，黑暗培养13天；后转入培养温度21℃,每天光照15小时、黑暗9小时，光照强度为2000lx，培养时间为38天。

所述外植体为春季萌发10cm以内的新梢段，具体培养方法如下：前一年10月份到12月份，从果园采集一年生枝条,保存于4℃培养基冰箱；当年2月下旬到3月上旬，取枝条插入无菌水中，23℃,每天光照8小时,黑暗16小时,光培养基照强度1800lx,催芽，每7天换一次新鲜无菌水；4月上中旬，待芽萌动后，取多个带芽茎段，剪成1.2cm高、带一个嫩芽的茎段。

所述外植体进行消毒处理，具体方法如下：先用含100mg/L羧苄青霉素的自来水浸泡处理2.5小时后,再采用混合消毒液涡旋振荡6分钟,接着剥去苞片，混合消毒液再次消毒6分钟。

对比例1

一种桃砧木培养基，包含：

(a)初始培养基：

(b)增殖培养基：

(c)生根培养基：

所述生根培养基是在ER培养基中添加IBA后得到的培养基，IBA的终浓度为1.2mg/L,生根培养基的pH为5.8。

对比例2

一种桃砧木培养基，包含：

(a)初始培养基：

(b)增殖培养基：

(c)生根培养基：

所述生根培养基中的纳米凝胶是通过以下方法制备得到的：将1g硒酸钠溶于10g无水乙醇的盐酸溶液中，低温等离子反应器中反应20min后加入5g钛酸异丙酯继续反应30min，反应温度为-12℃，反应完毕后超声波振荡均匀；调节pH为2，再置于低温等离子体反应器内0℃静置12小时以上，形成均一溶胶，再取出蒸发干燥转变为凝胶，得纳米凝胶；其中，所述无水乙醇的盐酸溶液是将无水乙醇加入6倍重量的2mol/L盐酸溶液中，超声波振荡均匀而得。

对比例3

1)外植体采集与消毒：从田间选取生长健壮的一年生枝条，剪取幼嫩枝条作为外体，采用洗衣粉漂洗，自来水冲洗30min。超净工作台上，将处理后的外植体用体积浓度75%的酒精培养基灭菌20s,0.1 %的升汞灭菌9min,无菌水冲洗4-5次。解剖刀去除鳞片，切取裸芽接种于培养基诱导培养基上，每瓶接种3个外植体。

诱导培养基为：在1/2MS培养基中添加6-BA、IBA、GA3、培养基蔗糖和琼脂，其中6-BA的终浓度为1.Omg/L,培养基IBA的终浓度为0.2mg/L,GA3的终浓度为2.Omg/L,蔗糖的终浓度为30g/L,琼脂的终浓度为6g/L,pH = 5.8，培养条件为：每天光照16h、黑暗培养基8h,温度25℃,光照强度1800lx。

2)丛生芽诱导：采用诱导培养基培养15d左右待芽长到1cm左右，切取新梢转接到的诱导培养基上，30-40d后形成新芽，每21d继代一次，60天可以获得丛生芽。培养条件培养基为:每天光照16h、黑暗8h,温度26℃,光照强度1800lx。

3)继代培养:新梢转接到继代培养基培养，继代培养基配方：1/2MS中添加6-BA、IBA、蔗糖和琼脂,6-BA的终浓度为1.5mg/L、IBA的终浓度为0.2mg/L、蔗糖的终浓度为30g/L，琼脂的终浓度为6g/L,pH= 5.8。培养条件为:每天光照16h、黑暗8h,温度26℃，光照强度1800lx。

4）生根培养:切取1-1.5cm生长健壮的新梢转接到生根培养基上，暗处理5d后，转培养基移到光下培养60d,得到生根苗。生根培养基配方为：1/2MS中添加IBA、蔗糖和琼脂，IBA的终培养基浓度为0.6mg/L、蔗糖的终浓度为60g/L、琼脂的终浓度为6g/L,pH=5.8。培养条件为:每天培养基光照16h、黑暗8h,温度25℃,光照强度1800lx。

试验例

统计实施例1～3和对比例3初代组培苗的平均褐化率、污染率和成活率以及叶片、植株生长情况,结果见表1。

由表1可知，实施例1～3的初代组培苗叶片、植株生长情况尚可，平均褐化率、污染率低，成活率高，其中，实施例3在第一代3天后更换一次初始培养基，初代组培苗情况相对更好。对比例3采用常规组培快繁方法培养，各项指标均明显变差。

考察实施例1～3和对比例3的增殖系数和玻璃化比率，结果见表2。

由表2可知，实施例1～3的增殖系数高，无玻璃化现象，说明芽的分化较好，其中实施例3添加了GA3，增殖系数进一步提高。对比例3采用常规组培快繁方法培养，增殖系数低，玻璃化现象严重，叶片小而薄，呈卷取、透明状，淡绿色，茎干细弱。

考察实施例1～3和对比例1～3的生根情况，结果见表3。

由表3可知，实施例1～3生根情况良好，生根率、平均根长、平均根数等指标都较高。对比例1对比例1略去纳米凝胶，对比例2在制备纳米凝胶时略去蛹虫草微粒，对比例3采用常规组培快繁方法培养，各项指标均明显变差。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims

1.一种桃砧木培养基，其特征在于，包含：

(a)初始培养基：

所述初始培养基是在1/2 MS培养基中添加6-BA、NAA和GA3而得，6-BA的终浓度为0.5～1.0 mg/L，NAA的终浓度为0.01～0.2 mg/L，GA3的终浓度为0.2～0.5mg/L，初始培养基的pH为5.5～5.8；

(b)增殖培养基：

所述增殖培养基是在ER培养基中添加6-BA、IBA而得，6-BA的终浓度为0.5～1.0mg/L,IBA的终浓度为0.05～0.2mg/L,增殖培养基的pH为5.5～5.8；

(c)生根培养基：

2.根据权利要求1所述的一种桃砧木培养基，其特征在于，所述MS培养基包含：NH₄NO₃1320～1980mg/L，KNO₃1520～2280mg/L，CaCl₂·2H₂O 352～528mg/L，MgSO₄·7H₂O 298～442mg/L，KH₂PO₄136～204mg/L，KI 0.664～0.996mg/L，H₂BO₃4.96～6.4mg/L，MnSO₄·4H₂O17.84～26.76mg/L，ZnSO₄·7H₂O 6.88 ～10.32mg/L，Na₂MoO₄·5H₂O 0.20～0.30mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.020～0.030mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025 ～0.030mg/L，FeSO₄·7H₂O 22.24～33.40mg/L，Na₂-EDTA·2H₂O 29.84～44.76mg/L，肌醇80～120mg/L，烟酸0.4～0.6mg/L，甘氨酸1.6～2.4mg/L，盐酸吡哆醇 0.4～0.6mg/L，盐酸硫胺素0.08～0.12mg/L。

3.根据权利要求1所述的一种桃砧木培养基，其特征在于，所述ER培养基包含：NH₄NO₃1200mg/L，KNO₃1900mg/L，CaCl₂ 332.02mg/L，MgSO₄ 180.54mg/L，KH₂PO₄340mg/L，H₂BO₃0.63mg/L，MnSO₄·H₂O 1.69mg/L，ZnSO₄·7H₂O 9.15mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.025mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.0025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.0025mg/L，FeNaEDTA 36.7mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L。

4.根据权利要求1所述的一种桃砧木培养基，其特征在于，所述初始培养基、增殖培养基、生根培养基中均含有蔗糖和琼脂，蔗糖的终浓度为18～20g/L，琼脂的终浓度为6～7g/L。

5.根据权利要求1所述的一种桃砧木培养基，其特征在于，所述增殖培养基中还添加GA3，其终浓度为0.5～3mg/L。

6.根据权利要求1所述的一种桃砧木培养基，其特征在于，以重量份计，所述生根培养基中的纳米凝胶是通过以下方法制备得到的：将1份硒酸钠溶于10～12份无水乙醇的盐酸溶液中，低温等离子反应器中反应10～20min后加入5～7份钛酸异丙酯继续反应20～30min，反应温度为-12～-6℃，反应完毕后加入0.1～0.2份蛹虫草微粒，超声波振荡均匀；调节pH为2～3，再置于低温等离子体反应器内-5～0℃静置12小时以上，形成均一溶胶，再取出蒸发干燥转变为凝胶，得纳米凝胶；其中，所述无水乙醇的盐酸溶液是将无水乙醇加入6～8倍重量的10～12mol/L盐酸溶液中，超声波振荡均匀而得。

7.一种权利要求1～6所述桃砧木培养基的使用方法，其特征在于，先将外植体采用初始培养基进行诱导培养，得到初代组培苗，然后将所述初代组培苗用增殖培养基进行增殖培养，增殖培养即为继代培养，继代培养过程中，取新梢段转入生根培养基进行生根培养；其中，初始培养基中的培养条件为：培养温度20～22℃,每天光照14～16小时、黑暗8～10小时，光照强度为1800～2000lx，第一代3天后更换一次初始培养基，28天后转增殖培养基；增殖培养基中的培养条件为：培养温度20～22℃,每天光照14～16小时、黑暗8～10小时，光照强度为1800～2000lx，培养时间为28～32天；生根培养基的培养条件为：培养温度22～24℃，黑暗培养13～14天；后转入培养温度20～22℃,每天光照14～16小时、黑暗8～10小时，光照强度为1800～2200lx，培养时间为35～40天。

8.根据权利要求7所述一种桃砧木培养基的使用方法，其特征在于，所述外植体为春季萌发10cm以内的新梢段，具体培养方法如下：前一年10月份到12月份，从果园采集一年生枝条,保存于4℃培养基冰箱；当年2月下旬到3月上旬，取枝条插入无菌水中，22～25℃,每天光照8小时,黑暗16小时,光培养基照强度1500～2000lx,催芽，每7天换一次新鲜无菌水；4月上中旬，待芽萌动后，取多个带芽茎段，剪成1～1.5cm高、带一个嫩芽的茎段。

9.根据权利要求7所述一种桃砧木培养基的使用方法，其特征在于，所述外植体进行消毒处理，具体方法如下：先用含100mg/L羧苄青霉素的自来水浸泡处理2.5小时后,再采用混合消毒液涡旋振荡5～8分钟,接着剥去苞片，混合消毒液再次消毒5～8分钟。

10.根据权利要求9所述一种桃砧木培养基的使用方法，其特征在于，所述混合消毒液是通过以下方法制备得到的：从爱力克TMA-B中，取一片A片和一片B片溶于培养基500ml无菌水，加入终质量浓度为0.01%的吐温20，搅拌混匀，即得混合消毒液；在混合消毒培养基液中，爱力克A、B的浓度均为500mg/L。