CN112501023A - 一种植物根表微生物组的获取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种植物根表微生物组的获取方法，属于微生物技术领域，所述获取方法包括以下步骤：将所述植物的根系浸没于表面活性剂中，进行超声波处理，收集含有植物根表微生物组的悬液。本发明采用表面活性剂弱化植物根表胞外膜蛋白或多糖层的粘附，从而降低微生物在根表的吸附能力。进一步通过超声波的震荡作用，可以使微生物从根表脱落，从而获得根表微生物悬液。本发明具有操作简便、针对性强、收集效率高等优点，有助于广泛应用于绝大多数种类土壤和(或)植物的根表活体微生物组的获取。

Description

一种植物根表微生物组的获取方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种植物根表微生物组的获取方法。
背景技术
植物根系提供了一个复杂的微生态环境，是大量微生物的互动栖息地。在植物根系直接影响的几毫米范围内生长繁殖的微生物被称为植物根系微生物，这些微生物显著影响着植物的生长发育和营养吸收等过程。根据不同的空间位置，植物根系又被分为根内、根表及根际三个生态位，它们之间的微生物群落结构具有显著差异。因此，充分利用和发挥根系不同生态位的微生物资源，开发生物肥料和生物防控剂，从而降低传统农业对化肥和农药的过度依赖，对于提高作物产量、保障农业的可持续发展等具有重要意义。
作为根内环境和土壤环境的中间屏障，根表在根内微生物定殖过程中起着重要的筛选作用。虽然国内外对植物根系微生物的研究取得了一定进展，但目前主要集中在根际和根内微生物组方面的研究，这是由于根表微生物含量通常较少且获取难度大。特别是，根表微生物通常表现为具有生物膜、细胞积聚性高，与植物根部表面结合密切，不易脱落等特点。因此，当前有关根表微生物提取方法的欠缺及有效性低是限制根表微生物研究的重要因素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物根表微生物组的获取方法，本发明的获取方法具有针对性强、收集效率高等优点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种植物根表微生物组的获取方法，包括以下步骤：将所述植物的根系浸没于表面活性剂中，进行超声波处理，收集含有植物根表微生物组的悬液。
优选的，所述表面活性剂包括Tween 80。
优选的，所述Tween 80的浓度为0.3～0.8mmol/L。
优选的，所述超声波处理的温度为1～4℃；所述超声波处理的功率为50～120W；所述超声波处理的频率为40～60kHz。
优选的，所述超声波处理的次数为2～4次，每次超声波处理的时间独立为0.01～3min。
优选的，在所述收集含有植物根表微生物组的悬液后，还包括对所述悬液进行离心，收集沉淀，所述沉淀中含有植物根表微生物组。
优选的，所述离心的离心力为3000～5000g；所述离心的时间为5～10min。
优选的，在将所述植物的根系浸没于表面活性剂中前，还包括冲洗去除所述根系表面的土壤；所述冲洗采用的试剂包括磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的pH值和所述根系的土壤的pH值一致。
优选的，所述冲洗的次数为2～3次。
优选的，所述植物包括烟草。
本发明提供了一种植物根表微生物组的获取方法，包括以下步骤：将所述植物的根系浸没于表面活性剂中，进行超声波处理，收集含有植物根表微生物组的悬液。本发明采用表面活性剂可有效弱化植物根表胞外膜蛋白或多糖层的粘附，从而降低微生物在根表的吸附能力。而且超声波的震荡作用，可以使微生物从根表脱落，从而获得含有根表微生物的悬液。本发明的方法获取的植物根表微生物组可直接用于微生物组DNA提取，也可将获得的根表微生物悬液直接平板涂布获得类群繁多的活体菌株，便于后续相关菌株的针对性研究。本发明具有操作简便、根表微生物特异性强、收集效率高等优点，有助于广泛应用于绝大多数种类土壤和(或)植物的根表活体微生物组的获取。
附图说明
图1为不同提取方法下2种类型土壤烟草根表微生物组间细菌群落变异的非线性多维标度分析(NMDS)；其中，R1，R2分别为实施例1中编号1，2所代表土壤的烟草根表活体微生物组；S1，S2分别为对比例1中编号1，2所代表土壤的烟草根表活体微生物组。
具体实施方式
本发明提供了一种植物根表微生物组的获取方法，包括以下步骤：将所述植物的根系浸没于表面活性剂中，进行超声波处理，收集含有植物根表微生物组的悬液。
在本发明中，所述植物优选的包括烟草。
在本发明中，所述表面活性剂优选的包括Tween 80；所述Tween 80的浓度优选为0.3～0.8mmol/L的Tween 80，进一步优选为0.5mmol/L。本发明采用表面活性剂弱化植物根表胞外膜蛋白或多糖层的粘附，弱化微生物与植物根表的结合，从而降低微生物在根表的吸附能力，分散微生物集聚现象。
在本发明中，所述超声波处理的温度优选为1～4℃，避免微生物自身增殖；在本发明中，所述超声波的处理温度优选通过在表面活性剂中加冰块实现；所述超声波处理的功率优选为50～120W，进一步优选为80～100W；所述超声波处理的频率优选为40～60kHz，进一步优选为50kHz。
在本发明中，所述超声波处理的次数优选为2～4次，进一步优选为3次，每次超声波处理的时间优选为0.01～3min，进一步优选为0.1～2min，更进一步优选为0.5～1min。
本发明利用超声波的空化效应和机械效应，使微生物从根表脱落。
本发明利用表面活性剂和超声波的作用，使处理后植株根表的微生物脱落并有效维持脱落微生物的活性。
在本发明中，本发明在所述收集含有烟草植物根表微生物组的悬液后，优选还包括对所述悬液进行离心，收集沉淀，得到烟草植物根表微生物组。在本发明中，所述离心的离心力优选为3000～5000g，进一步优选为4000g；所述离心的时间优选为5～10min，进一步优选为8min。
在本发明中，在将所述烟草植株的根系浸没于表面活性剂中前，还包括冲洗去除所述根系的土壤；所述冲洗采用的试剂包括磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的pH值和所述根系的土壤的pH值一致。
在本发明中，所述冲洗的次数为2～3次。
在冲洗前，本发明优选的还包括除去根际微生物；所述除去根际微生物的方法优选的包括以下步骤：
将去除明土的植物根系置于装有PBS缓冲液的容器中震荡，取出植物根系；所述PBS缓冲液的pH值优选为与根际土壤pH接近；所述震荡的作用是使得根系表面含有根际微生物的土壤全部进入PBS缓冲液中。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、选择烟田土壤进行烟草盆栽试验：
两种供试土壤(编号1,2)为湖南永州典型烟田土壤(pH 6.91和7.49)，烟草品种为“云烟87”。
2、烟草根表微生物组的获取：
用小钢铲除去盆栽烟草植株周边土壤，小心拔出烟草，抖去根系明土，剪掉植株地上部，用无菌镊子夹住根系在装有PBS缓冲液(pH 6.91和7.49)的锥形瓶中剧烈搅动，使得根系表面的土壤全部进入缓冲液中；
再将根系用PBS缓冲液冲洗干净，置于装有0.5mmol/LTween 80溶液的试管中，Tween 80溶液刚好浸没根系，于放有冰块的超声波清洗仪中超声1min(120w，40kHz)，将根系取出，获得含有烟草根表微生物组的悬液。将微生物组悬液离心(4000g，10min)，以获得烟草根表菌体细胞(混杂极少量土)。
3、获得烟草根表可培养细菌组：
吸取1mL烟草根表微生物组悬液，稀释10-2、10-3、10-4、10-5和10-6系列梯度，分别取200μL的10-4、10-5、10-6浓度的悬液均匀地涂布于0.1TSA培养基(含放线菌酮)上，每个浓度梯度重复2次，20℃黑暗培养5d。
对比例1
用PBS缓冲液对根系进行冲洗，直接得到微生物悬液，省略表面活性剂和超声处理。其余和实施例1相同。
实施例1和对比例1烟草根表微生物组、根表可培养微生物组进行高通量测序：
采用Fast DNA SPIN Kit for soil试剂盒直接提取烟草根表微生物组DNA；用无菌刀片从可培养细菌平板(10-3梯度)中刮取表面细菌于1.5mL离心管中，采用相同试剂盒提取平板细菌DNA。DNA质检后交由测序公司进行高通量测序。
据高通量测序结果比较烟草对比例1和实施例1根表微生物组的差异性(图1；表1)：虽然不同土壤类型间微生物组成差异明显，但两种处理方法获得的烟草根表细菌组差异显著。变形菌门是与植物生长关系最为密切的细菌类群，易于在植物根表定殖，其多少可表征植物根表微生物组获取效率。从表1可以看出，与对比例1相比，本发明处理方法可显著增加变形菌门的相对丰度，分别提高了142.7％、99.7％。此外，各微生物类群于实施例1和对比例1中根表的相对丰度变化趋势并未随土壤类型的变化而发生改变(表1)，间接验证了本发明中烟草根表微生物组获取方法的可靠、稳定性。
表1高通量测序鉴定的对比例1和实施例1的烟草根表微生物组(门水平Top9)
Figure BDA0002827934310000051
Figure BDA0002827934310000061
注：表中所列数值为均值±标准差(n＝4)；不同大写字母代表某微生物类群于同一种土壤的根表间比较差异显著(P<0.01；t检验)。
6、比较烟草根表微生物组和根表可培养微生物组的组成，为获得的烟草根表菌体的活性状态提供参考：
由高通量测序结果，编号1土壤测得烟草根表微生物组约274个属种类，根表可培养细菌组约166个属种类，占微生物组的61％；编号2土壤测得烟草根表微生物组约479个属种类，根表可培养细菌组约181个属种类，占微生物组的38％。鉴于目前土壤中可培养微生物种类尚少(不足全部微生物类群的1％)，并不能100％获得根表微生物组的可培养株。但本实例中高达61％的可培养菌株属种类占比直接验证了本发明中获得烟草根表微生物组的方法是可以有效保障微生物活性的，这便于研究人员开展后续试验研究。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种植物根表微生物组的获取方法，包括以下步骤：将所述植物的根系浸没于表面活性剂中，进行超声波处理，收集含有植物根表微生物组的悬液。
2.根据权利要求1所述的获取方法，其特征在于，所述表面活性剂包括Tween 80。
3.根据权利要求2所述的获取方法，其特征在于，所述Tween 80的浓度为0.3～0.8mmol/L。
4.根据权利要求1所述的获取方法，其特征在于，所述超声波处理的温度为1～4℃；所述超声波处理的功率为50～120W；所述超声波处理的频率为40～60kHz。
5.根据权利要求1或4所述的获取方法，其特征在于，所述超声波处理的次数为2～4次，每次超声波处理的时间独立为0.01～3min。
6.根据权利要求1所述的获取方法，其特征在于，在所述收集含有植物根表微生物组的悬液后，还包括对所述悬液进行离心，收集沉淀，所述沉淀中含有植物根表微生物组。
7.根据权利要求6所述的获取方法，其特征在于，所述离心的离心力为3000～5000g；所述离心的时间为5～10min。
8.根据权利要求1所述的获取方法，其特征在于，在将所述植物的根系浸没于表面活性剂中前，还包括冲洗去除所述根系表面的土壤；所述冲洗采用的试剂包括磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的pH值和所述根系的土壤的pH值一致。
9.根据权利要求8所述的获取方法，其特征在于，所述冲洗的次数为2～3次。
10.根据权利要求1所述的获取方法，其特征在于，所述植物包括烟草。
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