CN112500496A - 万古霉素完全抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

万古霉素完全抗原及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112500496A
CN112500496A CN202011413478.9A CN202011413478A CN112500496A CN 112500496 A CN112500496 A CN 112500496A CN 202011413478 A CN202011413478 A CN 202011413478A CN 112500496 A CN112500496 A CN 112500496A
Authority
CN
China
Prior art keywords
vancomycin
detection
complete antigen
monoclonal antibody
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011413478.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112500496B (zh
Inventor
何扬锦
陈颖
吴杰
张丽平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Quasi Policy Biological Technology Co ltd
Original Assignee
Zhejiang Quasi Policy Biological Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Quasi Policy Biological Technology Co ltd filed Critical Zhejiang Quasi Policy Biological Technology Co ltd
Priority to CN202011413478.9A priority Critical patent/CN112500496B/zh
Publication of CN112500496A publication Critical patent/CN112500496A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112500496B publication Critical patent/CN112500496B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/006—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure
    • C07K9/008—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure directly attached to a hetero atom of the saccharide radical, e.g. actaplanin, avoparcin, ristomycin, vancomycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/77—Ovalbumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了万古霉素完全抗原及其在万古霉素特异性单克隆抗体制备和免疫法检测中的应用。本发明还公开了用该完全抗原制备的抗万古霉素单克隆抗体，产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞以及用于检测万古霉素的检测卡和检测试剂盒。本发明公开了检测万古霉素的ELISA法和荧光免疫层析法，本发明的荧光免疫层析法具备操作简单、检测时间短、成本低、特异性高、重复性好等优点。

Description

万古霉素完全抗原及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及小分子药物的检测。具体地说，本发明涉及万古霉素完全抗原、利用该完全抗原获得的万古霉素单克隆抗体及其在荧光免疫层析法检测万古霉素中的应用。
背景技术
近年，由于临床抗菌药物广泛应用及不合理使用导致细菌的耐药问题的日益严重。为对抗迅速增长耐药菌，许多制药公司都积极研发新的抗菌药。万古霉素是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌和肠球菌所致的重症感染包括败血症、肺部感染、皮肤软组织感染的疗效确切又比较安全的抗生素。对于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌院内肺部感染，万古霉素为首选药物。现在，在多个国家出现的“超级细菌”可以抵御几乎所有抗生素，目前最好的抗生素是替加环素和万古霉素。
然而，抗菌药物在治愈并挽救了无数患者生命的同时，也因抗菌药物的不合理应用也会造成耐药菌增加的不利后果。不合理用药是事关全人类健康的大事，是全世界所有国家普遍存在的问题。我国药物的不合理情况亦非常严重，据国家食品药品监督管理局通报，每年至少有20万人因用错药、用药不当而死亡，40％死于抗菌药物应用不合理。合理用药的问题一直是专业人士和公众关注的热点。
因此，对患者有必要进行血药浓度的监测，以确保药物的有效治疗，优化万古霉素的临床使用，减少耐药菌株的产生及不良反应的发生。要达到此目的需建立简便、快速、灵敏、可靠的万古霉素定量检测方法。
目前，万古霉素的检测主要包括高效液相色谱法、免疫分析法和液质联用技术等。高效液相色谱法是最早用于测定万古霉素血药浓度的方法，该法具有准确、灵敏、廉价的特点，但该法操作繁琐、重现性较差、难以实现自动化检测，且测定时间较长，检测浓度有限。近年来虽然国内外一直出现试图在进行对高效液相色谱法测定精神类药物血药浓度的技术改进，如直接蛋白沉淀法结合反相液相色谱法、固相萃取结合高相液相、直接蛋白沉淀结合色谱质谱联用等，但仍存在各自的局限。此外，免疫分析法也是万古霉素检测的常用方法。荧光偏振免疫法在十多年前就被开发成商品化的仪器，实现了自动化检测。但其最大的缺陷在于专属性不强，测定时易受代谢物的干扰。酶放大免疫法，该技术监测血药浓度具有较好的精密度和准确度，虽已实现商品化，但由于其费用太高，给患者带来沉重的经济负担，导致临床上推广使用困难。
影响免疫分析法检测质量的根本原因是抗体的特异性与亲和性，这些性质又取决于免疫半抗原的分子结构，所以免疫半抗原分子设计与选择是产生特异性抗体和建立小分子药物含量快速检测技术最关键的步骤。
因此，本领域急需万古霉素的完全抗原，以及通过该完全抗原获得的万古霉素特异性抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供万古霉素的完全抗原，通过该完全抗原可以获得万古霉素的特异性抗体。
本发明的另一目的在于提供通过本发明的万古霉素完全抗原获得的万古霉素特异性抗体以及包含该抗体的检测试剂盒和定量测定万古霉素的方法。
在第一方面，本发明提供一种万古霉素完全抗原，所述完全抗原具有式I所示的结构：
Figure BDA0002815112770000021
式中，R为任选取代的C1-C6烷基；优选任选取代的C2-C4烷基；
Protein为蛋白质载体。
在具体的实施方式中，所述完全抗原具有式II所示的结构：
Figure BDA0002815112770000031
式中，Protein为蛋白质载体。
在优选的实施方式中，所述蛋白质载体为选自下组中的任何一种蛋白质：牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。
在具体的实施方式中，所述蛋白质载体是牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)。
在第二方面，本发明提供一种制备第一方面所述的万古霉素完全抗原的方法，所述方法包括步骤：
将万古霉素通过连接试剂与蛋白质载体连接，以制得权利要求所述的完全抗原。
在优选的实施方式中，所述连接试剂是戊二醛。
在优选的实施方式中，所述蛋白质载体为选自下组中的任何一种蛋白质：牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。
在进一步的优选实施方式中，所述蛋白质载体是牛血清白蛋白(BSA)、或卵清蛋白(OVA)。
在第三方面，本发明提供第一方面所述的万古霉素完全抗原的用途，用于制备万古霉素的特异性单克隆抗体。
在第四方面，本发明提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合万古霉素。
在优选的实施方式中，所述单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系产生，所述杂交瘤细胞系由中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉，武汉大学)保藏，保藏号为CCTCC NO:C202032；分类命名为：杂交瘤细胞株C214231。
在优选的实施方式中，所述的单克隆抗体检测万古霉素的灵敏度低于1ng/ml；优选低于0.8ng/ml；更优选约为0.6ng/ml。
在第五方面，本发明提供一种产生第四方面所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述杂交瘤细胞系由中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉，武汉大学)保藏，保藏号为CCTCC NO:C202032；分类命名为：杂交瘤细胞株C214231。
在第六方面，本发明提供第四方面所述的单克隆抗体的用途，用于制备检测样品中万古霉素的试剂、检测卡或试剂盒。
在优选的实施方式中，所述样品是生物样品，优选血液样品。
在第七方面，本发明提供一种检测样品中是否存在万古霉素的方法，所述方法包括步骤：
(a)将所述样品与第四方面所述的单克隆抗体接触；
(b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在万古霉素。
在优选的实施方式中，所述单克隆抗体带有可检测标记物；优选地，所述的标记物选自下组：胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
在优选的实施方式中，所述检测方法为荧光检测法。
在优选的实施方式中，所述检测方法是体外非诊断性的。
在第八方面，本发明提供一种检测万古霉素的荧光免疫层析检测卡，所述检测卡包括基片；吸液部件；检测部件；加样部件，其特征在于，检测部件固定在基片上，在检测部件中部设置质控带和检测带，在检测部件的两端以部分重叠的方式固定吸液部件和加样部件，其中，检测带上包被有本发明第一方面所述的万古霉素完全抗原，质控带上包被有兔抗体IgG。
在优选的实施方式中，所述万古霉素荧光免疫层析检测卡还包括卡盒，所述卡盒由下盖和上盖组成，上盖设有加样窗口和检测窗口，所述万古霉素荧光免疫层析检测卡完全设置于下盖中，所述检测窗口和加样窗口分别对应与所述万古霉素荧光免疫层析检测卡上的加样部件和质控带及检测带。
在优选的实施方式中，所述上盖上还设有产品编号区；条形码识别区。
在优选的实施方式中，所述基片是深色硬质基片；优选黑色PVC基片。
在优选的实施方式中，所述检测部件是硝酸纤维素膜。
在优选的实施方式中，所述加样部件是玻璃纤维。
在优选的实施方式中，所述吸液部件是吸水纸。
在第九方面，本发明提供一种检测万古霉素的检测试剂盒，所述试剂盒装有：
(a)第八方面所述的万古霉素荧光免疫层析检测卡；和
(b)与第八方面所述的万古霉素荧光免疫层析检测卡配套的万古霉素检测分析液；和
(c)利用所述万古霉素检测试剂盒检测万古霉素的使用说明书；
其中，所述检测分析液为包含有荧光标记的第四方面所述的单克隆抗体和抗兔IgG抗体的检测分析液。
在优选的实施方式中，所述检测分析液中的标记用荧光染料包括但不限于，FITC(Fluorescein)、Alexa Fluor 647、CFTM647、TRITC(Rhodamine)和CAL Fluor(R)Red 610等。
在优选的实施方式中，所述检测分析液的溶剂部分是含有BSA的磷酸缓冲液。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了万古霉素免疫原和包被原的紫外扫描图谱。
图2显示了万古霉素检测卡的结构；其中图2A显示了未装塑料卡的万古霉素检测卡的结构；图2B显示了带有塑料卡盒的万古霉素检测卡的结构。
图3显示了万古霉素荧光免疫层析检测标准曲线图谱。
图4显示了万古霉素ELISA检测标准曲线图谱。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，将万古霉素半抗原与适当的蛋白质载体连接合成了完全抗原，以此为免疫原免疫Balb/C小鼠，将其脾细胞与小鼠骨髓瘤SP20细胞融合，获得特异性分泌抗万古霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，进而制备并纯化得到了万古霉素单克隆抗体，随后利用所述万古霉素单克隆抗体制备了具有高灵敏度和特异性的万古霉素免疫检测卡。在此基础上，完成了本发明。
完全抗原
具有免疫原性与免疫反应性的物质，称为完全抗原(complete antigen)，如大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒素、动物血清等。完全抗原既能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞，还能与其在体内、体外发生特异性结合反应。
通常，半抗原需要和大分子如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或血蓝蛋白(KLH)或以共价键方式偶联，成为既具有免疫反应性，又具有免疫原性的完全抗原。
本文所用的术语，“完全抗原”是指利用合适的连接试剂将万古霉素与适当的蛋白质载体结合后的产物。本文所用的术语，“蛋白质载体”是指任何在免疫学上可接受的用于形成完全抗原的蛋白质，包括但不限于：牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等，优选牛血清白蛋白(BSA)、或卵清蛋白(OVA)。
在具体的实施方式中，本发明的万古霉素完全抗原的结构如式I所示：
Figure BDA0002815112770000061
其中，R为任选取代的C1-C6烷基；优选任选取代的C2-C4烷基；
Protein为蛋白质载体。
在优选的实施方式中，利用戊二醛作为连接试剂将万古霉素与适当的蛋白质载体结合。因此，本发明的万古霉素完全抗原的结构如式II所示：
Figure BDA0002815112770000071
单克隆抗体的制备
本文所用的术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即，除了可能存在少量可能的自发突变，组成该群体的抗体个体都相同。因此，修饰语“单克隆的”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，本发明完全抗原，可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人,In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。
代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞系，例如鼠类的骨髓瘤细胞系，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞系(可购自SalkInstitute Cell Distribution Center，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type Culture Collection，洛克维尔，马里兰，美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用(MonoclonalAntibodies Production Techniques and Applications)，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987)]。
对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生，例如通过体外结合分析，如酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法生长(Goding，单克隆抗体(Monoclonal Antibodies)：原则和实践(Principles and Practice)，Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
本发明的单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系产生，所述杂交瘤细胞系已于2020年3月4日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉，武汉大学)，保藏号为CCTCC NO:C202032；分类命名为：杂交瘤细胞株C214231。
在具体的实施方式中，本发明的单克隆抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
在具体的实施方式中，本发明的单克隆抗体检测万古霉素的灵敏度低于1ng/ml；优选低于0.8ng/ml；更优选约为0.6ng/ml。本发明的单克隆抗体与万古霉素完全抗原的载体蛋白，例如BSA或OVA没有交叉反应。进一步地，本发明的单克隆抗体也不结合其它抗生素，包括但不限于氟康唑、喹诺酮类、呋噻米、利福平、磷霉素、庆大霉素、链霉素。
检测试剂盒
本发明的检测试剂盒是指含有本发明的单克隆抗体并可用于万古霉素检测的试剂盒。所述的试剂盒可根据需要包括容器、使用说明书、缓冲剂、免疫助剂等。
本发明的检测试剂盒可采用多种形式，例如检测卡、含有各种测试所需试剂的测试盒等。实施例中采用检测卡为例对本发明的试剂盒进行说明，但不应理解为本发明的试剂盒仅限于检测卡。
在具体的实施方式中，本发明的检测万古霉素的荧光免疫层析检测卡包括基片；吸液部件；检测部件；和加样部件；其中，检测部件固定在基片上，在检测部件中部设置质控带和检测带，在检测部件的两端以部分重叠的方式固定吸液部件和加样部件，其中，检测带上包被有本发明的完全抗原，质控带上包被有兔抗体IgG。
在优选的实施方式中，本发明的万古霉素荧光免疫层析检测卡还包括卡盒，所述卡盒由下盖和上盖组成，上盖设有加样窗口和检测窗口，所述万古霉素荧光免疫层析检测卡完全设置于下盖中，所述检测窗口和加样窗口分别对应与所述万古霉素荧光免疫层析检测卡上的加样部件和质控带及检测带。在上盖上还可设有产品编号区；条形码识别区。所述基片可以是深色硬质基片；优选黑色PVC基片。所述检测部件可以是硝酸纤维素膜。所述加样部件可以是玻璃纤维。所述吸液部件可以是吸水纸。
本文所述的“部分重叠的方式固定”表示相邻的两个部件形成一定的重叠区域，而非一个部件完全包含在另一部件中的完全重叠，并且该两部件通过该重叠区域而固定。固定的方式可由本领域技术人员自主选择，例如通过粘合等方式。
在上述检测卡的基础上，本发明还提供一种检测万古霉素的检测试剂盒，其装有：
(a)上述万古霉素荧光免疫层析检测卡；
(b)与所述万古霉素荧光免疫层析检测卡配套的万古霉素检测分析液；和
(c)利用所述万古霉素检测试剂盒检测万古霉素的使用说明书；
其中，所述检测分析液为包含有荧光标记的本发明的单克隆抗体和抗兔IgG抗体的检测分析液。
本领域技术人员可根据需要自主选择荧光标记，包括但不限于FITC(Fluorescein)、Alexa Fluor 647、CFTM647、TRITC(Rhodamine)和CAL Fluor(R)Red 610等。
在优选的实施方式中，所述检测分析液的溶剂部分是含有BSA的磷酸缓冲液。
万古霉素半抗原以及人工抗原的免疫检测应用
本发明的万古霉素半抗原和人工抗原应用于抗体制备，所述抗体应为单克隆抗体或者多克隆抗体；本发明的万古霉素半抗原和人工抗原应用以及利用万古霉素人工抗原制备的相应抗体应用于各种检测万古霉素含量的免疫学检测领域，包括但不限于ELISA、化学发光法、胶体金法和荧光免疫层析法等免疫学检测领域。
上述所述的“万古霉素半抗原和人工抗原应用于抗体制备”是指利用本发明的万古霉素半抗原衍生物制人工抗原，利用人工抗原去免疫实验动物，制备抗万古霉素多克隆抗体和单克隆抗体；所述实验动物不应该理解为具体实施方式中单纯的小鼠，应该包括但不限于：小鼠、大鼠、兔子、山羊、绵羊、马、驴、鸡、狗等实验动物。
上述所述的“万古霉素半抗原和人工抗原应用于测定万古霉素免疫检测领域”是指利用由万古霉素半抗原制备人的工抗原，及由万古霉素人工抗原制备得到的相应抗体作免疫检测原料建立各种检测万古霉素含量的免疫检测方法。所述免疫检测领域包括但不限于ELISA、化学发光法、胶体金法和荧光免疫层析法等免疫学检测方法；所述检测万古霉素免疫检测方法不仅仅指定量检测，还包括半定量以及各中基于免疫学检测的定性检测方法。
在具体实施方式中，本发明以免疫小鼠制备特异性单克隆抗体为例，以及以ELISA和荧光免疫层析法为具体实例阐述了万古霉素半抗原以及人工抗原在万古霉素免疫学检测中的应用。
本发明的优点：
1.本发明首次公开了一种万古霉素完全(人工)抗原的结构以及其制备方法；
2.本发明首次公开了万古霉素人工抗原在万古霉素抗体制备和免疫学检测领域的应用，为推进临床上万古霉素血药浓度检测提供了可靠方法；
3.本发明的单克隆抗体可高灵敏度地检测万古霉素，且不与其它相关小分子药物发生结合；和
4.本发明的万古霉素检测试剂盒可简单、快捷地现场检测万古霉素，从而具有操作简单、检测时间短、成本低、特异性高、重复性好等优点。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或者参考有机合成领域的常规参考书籍或文献，或者按照制造厂商所建议的条件。
实施例
实施例1.万古霉素完全抗原(免疫原和包被原)的制备
将万古霉素(半抗原)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)通过戊二醛法偶联。具体偶联方法如下：
称取20mg万古霉素，溶解于2ml DMF中，形成10mg/ml的终浓度，取其中400μL万古霉素(10mg/ml)与3μL50％戊二醛混合后加入到1ml的10mg/ml BSA溶液中(或加入1ml的7.5mg/ml OVA溶液中)，均匀混合后在室温避光搅拌条件下反应3h。用磷酸缓冲液透析4次，12h换一次液。收集透析液，用美国伯乐(BIO-RAD)公司的Quick Start Bradford ProteinAssay Kit测定免疫原和包被原的浓度分别为6.8mg/ml和5.3mg/ml。得到的万古霉素人工抗原(免疫原和包被原)结构式如下所示，其中“Protein”为BSA(牛血清蛋白)或OVA(卵清蛋白)
Figure BDA0002815112770000111
万古霉素人工抗原(免疫原和包被原)用紫外扫描波峰结果比较如图1所示，偶联物的波峰与BSA以及OVA波峰有区别说明偶联成功。
实施例2.利用万古霉素完全抗原制备单克隆抗体
1.免疫动物
将实施例2得到的万古霉素免疫原稀释成0.2mg/ml，取500ul免疫原与等体积的弗氏完全佐剂混合后，乳化完全，免疫BALB/c小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)，在小鼠背部皮下及足部进行注射免疫。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后用不完全弗氏佐剂。第四次免疫后一周眼眶取血，分离血清，测抗万古霉素抗体的效价。经ELISA检测，小鼠四次免疫后的抗体效价为1:256,000。
2.细胞融合和筛选
四次免疫后的小鼠经腹腔注射约100μg免疫原再次加强免疫，3天后，取该小鼠脾脏用于融合。取SP2/0细胞(南京军事医学科学院)与脾细胞混合，加入无血清培养液(Hyclone SH30022.018 DMEM(High Glucose)，离心(1500rpm，3min)，取沉淀细胞，逐滴加入1ml 50％聚乙二醇4000，静置90秒。然后逐滴加入37℃预温的无血清培养液10ml，静置5min。融合后细胞悬液离心(1000rpm，3min)，用完全培养液，接种于加有饲养层细胞的96孔板内，每孔2×104/ml骨髓瘤细胞。置37℃，5％CO2培养箱内培养两天，加入2×HAT的完全培养液，使孔内终浓度为1×HAT。待杂交瘤细胞集落长至孔底1/10-1/5面积的时候，即用ELISA方法筛选融合细胞抗体阳性孔。
3.腹水制备和抗体纯化
取BALB/c小鼠，于腹腔注射0.5ml石蜡油，7天后，腹腔注射0.5ml 1×106阳性杂交瘤细胞。观察小鼠生长情况，7天左右可见腹部隆起，及时采集腹水。利用亲和层析技术(Protein G Resin亲和纯化)纯化得到高纯度的单克隆抗体，蛋白量为6mg。
实施例3.利用万古霉素完全抗原进行免疫检测
1.荧光免疫层析检测
1)检测分析液制备
a.分别荧光标记实施例2得到的单克隆抗体以及抗兔IgG抗体(杭州启泰生物技术有限公司)；
b.用含有BSA的磷酸缓冲液将荧光标记后的抗体稀释配制成检测分析液。
2)万古霉素荧光免疫层析试纸卡的制备
a.用包被缓冲液(磷酸缓冲液)分别将制备得到的万古霉素包被原(VA-OVA)和兔抗体IgG稀释到适当浓度(0.4-3.0mg/ml)。在25±5℃的温度下，将稀释后的VA-OVA和兔抗体IgG均匀喷于硝酸纤维膜上(分别形成检测线和质控线)，在12％-30％的湿度条件下烘干5～8小时左右，干燥保存备用；
b.在黑色PVC基片上分别依次粘贴步骤a所得到的包被硝酸纤维素膜、玻璃纤维纸和吸水纸形成检测卡(如图2A所示)，视需要切割成适当宽度。
c.将步骤b所得到的检测卡装入卡盒的下盖中，盖上上盖，形成完整的带卡盒检测卡(如图2B所示)。
3)检测
取10μl稀释后的样本与100μl的检测分析液均匀混合，取100μL加入检测卡的加样窗口，反应5～10min后，用FCR荧光免疫分析仪(苏州和迈精密仪器有限公司)检测，根据样本的T线信号值与C线信号比值(T/C值)与内置的标准曲线比对显示检测结果。
4)万古霉素荧光免疫层析检测试纸卡检测原理
采用竞争法检测，样品中的万古霉素抗原和检测线(T线)上的万古霉素抗原(包被原)竞争结合检测分析液中的荧光标记的抗万古霉素抗体。当样本中抗原浓度很低时，检测线上结合的荧光抗体增多，进而检测线上的荧光信号就强，因此，检测线(T线)荧光信号与质控线(C线)上荧光信号的比值(T/C值)就大；反之，样本中万古霉素抗原浓度较高时，T/C值就很小。所以，样本中万古霉素含量越高，T/C值越低。根据T/C值与内置标准曲线比较并显示检测结果。
5)荧光免疫层析法检测万古霉素的灵敏度以及标准曲线
将空白血清中添加万古霉素标准品，配置成49.84、24.92、12.46、6.23、3.12、1.56、0.78、0.39、0.19、0ng/ml10个浓度梯度。将上述系列浓度样品按照上述检测的步骤进行检测，每个样品重复3次，检测的实验结果如表1所示，根据表1数据以浓度为横坐标，T/C值为纵坐标绘制标准曲线(Logit-log直线回归)如图3所示。图3中曲线对应的方程如表2所示，计算得IC50＝3.46ug/ml。
表1.荧光免疫层析法检测不同浓度万古霉素样本
Figure BDA0002815112770000131
表2.抑制曲线所对应的方程(Logit-log直线回归)
Figure BDA0002815112770000141
将0ng/ml样品重复检测10次，分别计算其T/C值的平均值(X)、标准偏差(SD)以及精密度(CV值)。灵敏度的计算方式为，X-2*SD的T/C值在图3的标准曲线里所对应的万古霉素浓度值。
表3.荧光免疫层析法重复检测0ug/ml万古霉素样本结果
Figure BDA0002815112770000142
将表3数据中的X-2*SD的T/C值作为y值代入图3标准曲线对应的方程中的到的浓度值为0.80ng/ml，即灵敏度为0.80ng/ml。
6)荧光免疫层析法检测万古霉素的精密度偏差
分别利用已经建立的万古霉素检测体系检测浓度为5.00ng/ml、15.00ng/ml和30ng/ml的万古霉素标准品，各重复检测20次，计算检测低中高浓度万古霉素的精密度(CV)。表4是检测万古霉素高低浓度的精密度结果。
表4.荧光免疫层析法重复检测25ug/ml万古霉素标准品结果
Figure BDA0002815112770000151
7)荧光免疫层析法检测万古霉素的准确度偏差
用缓存液将标准品(5mg/mL)稀释至400、200、50ng/mL后，各取10μL不同浓度标准品加入100μL低浓度企业内部参参考品中，按照上述检测的步骤进行检测，每个样品重复5次。表5是准确性结果
表5.荧光免疫层析法重复检测万古霉素标准品结果
Figure BDA0002815112770000152
Figure BDA0002815112770000161
8)万古霉素荧光免疫层析检测体系的交叉反应
将8种常见的临床用相关药物分别用空白混合血清配置成不同梯度浓度样本，进行荧光免疫层析检测，计算其IC50与万古霉素的IC50值比较计算交叉反应率。计算公式：交叉反应率＝(IC50万古霉素/IC50临床用相关药物)％，交叉反应率结果如表6所示：
表6.荧光免疫层析检测临床用相关药物的交叉反应结果
临床用相关药物 交叉反应率
氟康唑 ≦0.1％
伏立康唑 ≦0.1％
利福平 ≦0.1％
替考拉宁 ≦0.1％
利奈唑胺 ≦0.1％
庆大霉素 ≦0.1％
链霉素 ≦0.1％
先锋霉素 ≦0.1％
2.ELISA定量检测万古霉素
1)ELISA检测标准曲线建立
将制备好的万古霉素包被原(VA-OVA)用碳酸缓冲液(0.05M，pH9.6)稀释到1μg/ml，包被96孔板，100μl/孔，4℃过夜，5％脱脂奶粉封闭3h，200μl/孔。洗涤3次，5min/次；将空白血浆中添加万古霉素标准品，配置成0ng/ml、0.39ng/ml、0.78ng/ml、1.56ng/ml、3.125ng/ml、6.25ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml系列浓度样品。分别将不同浓度的万古霉素50μl与万古霉素抗体50μl(稀释200倍后)混合加入微孔中，37度孵育1h；洗涤3次后，加入HRP标记的二抗孵育1h(100μl/孔)后，洗涤3次，加入显色液，室温15min，加终止液读数(450nm)。表7显示了ELISA检测的标准曲线吸光值结果。
表7.ELISA法检测不同浓度万古霉素
Figure BDA0002815112770000162
Figure BDA0002815112770000171
以表7中的数据为基础，利用Logit-log直线回归法绘制标准曲线如图4所示。图4中曲线对应的方程如表8所示，R2＝0.99466。
表8.ELISA检测抑制曲线所对应的方程(Logit-log直线回归)
Figure BDA0002815112770000172
2)ELISA检测万古霉素的灵敏度
将阴性血浆样品重复检测10次，分别计算其ELISA吸光值的平均值(X)、标准偏差(SD)以及精密度(CV值)。灵敏度的计算方式为，X-2*SD的T/C值在图4的标准曲线里所对应的万古霉素浓度值。
表9.ELISA法重复检测0ng/ml万古霉素样本结果
Figure BDA0002815112770000173
Figure BDA0002815112770000181
将表9数据中的X-2*SD的吸光值作为y值代入图4标准曲线对应的方程中的到的浓度值为0.63ng/ml，即灵敏度为0.63ng/ml。
3)ELISA法检测万古霉素的精密度以及准确度偏差
分别利用已经建立的ELISA检测体系检测浓度为50ng/ml和5ng/ml的万古霉素标准品，各重复检测15次，计算检测高低浓度万古霉素的精密度(CV)以及检测的准确度偏差。表10和11分别是检测万古霉素高低浓度的精密度以及准确性结果，其结果显示高低浓度精密度均小于8％，准确度偏差均小于5％。
表10.ELISA法重复检测50ug/ml万古霉素标准品的结果
Figure BDA0002815112770000182
表11.ELISA法重复检测5ug/ml万古霉素企业参考品的结果
Figure BDA0002815112770000183
Figure BDA0002815112770000191
4)ELISA法检测万古霉素的交叉反应
交叉反应结果与荧光免疫层析法检测万古霉素的结果一致。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种万古霉素完全抗原，所述完全抗原具有式I所示的结构：
Figure FDA0002815112760000011
式中，R为任选取代的C1-C6烷基；优选任选取代的C2-C4烷基；
Protein为蛋白质载体。
2.如权利要求1所述的万古霉素完全抗原，其特征在于，所述完全抗原具有式II所示的结构：
Figure FDA0002815112760000012
式中，Protein为蛋白质载体。
3.如权利要求2所述的万古霉素完全抗原，其特征在于，所述蛋白质载体是牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)。
4.一种制备权利要求1-3中任一项所述的万古霉素完全抗原的方法，所述方法包括步骤：
将万古霉素通过连接试剂与蛋白质载体连接，以制得权利要求所述的完全抗原。
5.权利要求1-3中任一项所述的万古霉素完全抗原的用途，用于制备万古霉素的特异性单克隆抗体。
6.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合万古霉素。
7.一种产生权利要求6所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述杂交瘤细胞系由中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉，武汉大学)保藏，保藏号为CCTCC NO:C202032；分类命名为：杂交瘤细胞株C214231。
8.权利要求6所述的单克隆抗体的用途，用于制备检测样品中万古霉素的试剂、检测卡或试剂盒。
9.一种检测样品中是否存在万古霉素的方法，所述方法包括步骤：
(a)将所述样品与权利要求6所述的单克隆抗体接触；
(b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在万古霉素。
10.一种检测万古霉素的荧光免疫层析检测卡，所述检测卡包括基片；吸液部件；检测部件；加样部件，其特征在于，检测部件固定在基片上，在检测部件中部设置质控带和检测带，在检测部件的两端以部分重叠的方式固定吸液部件和加样部件，其中，检测带上包被有权利要求1-3中任一项所述的万古霉素完全抗原，质控带上包被有兔抗体IgG。
CN202011413478.9A 2020-12-03 2020-12-03 万古霉素完全抗原及其制备方法和应用 Active CN112500496B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011413478.9A CN112500496B (zh) 2020-12-03 2020-12-03 万古霉素完全抗原及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011413478.9A CN112500496B (zh) 2020-12-03 2020-12-03 万古霉素完全抗原及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112500496A true CN112500496A (zh) 2021-03-16
CN112500496B CN112500496B (zh) 2022-11-22

Family

ID=74970534

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011413478.9A Active CN112500496B (zh) 2020-12-03 2020-12-03 万古霉素完全抗原及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112500496B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114752568A (zh) * 2022-01-25 2022-07-15 无锡迪腾敏生物科技有限公司 呋塞米单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103575889A (zh) * 2012-08-03 2014-02-12 北京勤邦生物技术有限公司 一种检测万古霉素的试纸条及方法
CN105200013A (zh) * 2015-10-16 2015-12-30 江南大学 一株抗万古霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN108717117A (zh) * 2018-05-23 2018-10-30 太原瑞盛生物科技有限公司 一种万古霉素免疫检测试剂及其制备和检测方法
CN108802367A (zh) * 2017-05-04 2018-11-13 南开大学 一种万古霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒
CN109813693A (zh) * 2019-01-09 2019-05-28 北京丹大生物技术有限公司 一种检测万古霉素的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103575889A (zh) * 2012-08-03 2014-02-12 北京勤邦生物技术有限公司 一种检测万古霉素的试纸条及方法
CN105200013A (zh) * 2015-10-16 2015-12-30 江南大学 一株抗万古霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN108802367A (zh) * 2017-05-04 2018-11-13 南开大学 一种万古霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒
CN108717117A (zh) * 2018-05-23 2018-10-30 太原瑞盛生物科技有限公司 一种万古霉素免疫检测试剂及其制备和检测方法
CN109813693A (zh) * 2019-01-09 2019-05-28 北京丹大生物技术有限公司 一种检测万古霉素的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DEZHAO KONG等: "Development of ic ELISA and lateral flow immunochromatographic assay strip for the detection of vancomycin in raw milk and animal feed", 《FOOD AND AGRICULTURAL IMMUNOLOGY》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114752568A (zh) * 2022-01-25 2022-07-15 无锡迪腾敏生物科技有限公司 呋塞米单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用
CN114752568B (zh) * 2022-01-25 2023-11-28 无锡迪腾敏生物科技有限公司 呋塞米单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112500496B (zh) 2022-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112877296B (zh) 一种抗非那西丁单克隆抗体杂交瘤细胞株ad及其制备方法与应用
CN110938072A (zh) 一种利培酮人工抗原及其制备方法
CN112500496B (zh) 万古霉素完全抗原及其制备方法和应用
CN110938082A (zh) 一种奥氮平人工抗原及其制备方法
CN110357886B (zh) 甲氨蝶呤半抗原和完全抗原及其制备方法和应用
WO1986002364A1 (en) Monoclonal antibodies and their use
CN116120430A (zh) 一种叶酸完全抗原和抗体及其制备方法和应用
JP3899260B2 (ja) 三環系抗うつ薬誘導体およびイムノアッセイ
CN107226795B (zh) 利奈唑胺半抗原和完全抗原及其制备方法和应用
CN110713986A (zh) 一株维生素b1单克隆抗体杂交瘤细胞株cbdd及其应用
CN114685648B (zh) 茶碱完全抗原及其制备方法和应用
CN110922357A (zh) 一种阿立哌唑人工抗原及其制备方法
CN114685649B (zh) 霉酚酸完全抗原及其制备方法和应用
CN116444647B (zh) 氯氮平完全抗原和抗体及其制备方法和应用
CN114990072A (zh) 分泌抗喹诺酮类抗生素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN112029731A (zh) 一株他克莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN116375845A (zh) 拉莫三嗪完全抗原和抗体及其制备方法和应用
CN116396401A (zh) 替考拉宁完全抗原和抗体及其制备方法和应用
CN116813745A (zh) 奥氮平完全抗原和抗体及其制备方法和应用
CN117645663A (zh) 卡那霉素完全抗原和抗体及其制备方法和应用
CN117024566A (zh) 阿米卡星完全抗原及其制备方法和应用
CN113005097A (zh) 一株分泌抗卡马西平单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN117645662A (zh) 一种安眠酮完全抗原及其制备方法和应用
CN117603340A (zh) 庆大霉素完全抗原及其制备方法和应用
CN111154000A (zh) 一种抗西马特罗单克隆抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Li Zhongpeng

Inventor after: He Yangjin

Inventor after: Chen Ying

Inventor after: Wu Jie

Inventor after: Zhang Liping

Inventor before: He Yangjin

Inventor before: Chen Ying

Inventor before: Wu Jie

Inventor before: Zhang Liping

CB03 Change of inventor or designer information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant