CN112500481A - 一种人源抗新型冠状病毒的中和活性单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新的人源新型冠状病毒中和活性抗体及其应用。本发明从新冠病毒感染的康复病人体内分离筛选出具有中和活性的单克隆抗体，该抗体对新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)具有极优的亲和力和特异性，还能够有效阻断新冠病毒与受体蛋白结合。

Description

一种人源抗新型冠状病毒的中和活性单克隆抗体
技术领域
本发明涉及抗体研究领域，具体涉及一种新的人源新型冠状病毒(SARS-CoV-2)中和抗体。
背景技术
新冠病毒被世界卫生组织(WHO)命名为严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)。新型冠状病毒为β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径为60-140nm。全基因组比对发现新型冠状病毒与严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)同源性达到70％，序列差异主要体现在与宿主细胞作用的关键spike基因(编码S-蛋白)。
通常感染新型冠状病毒后表现出发热、乏力、干咳等肺炎症状，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等上呼吸道和消化道症状。重症病例多在1周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。目前虽然已报道一些治疗药物，但仍需更多的临床实践证明效果，相关疫苗的研发也在开展中，但距离临床应用尚需时间。
中和抗体是一类靶向病原体，并阻断病原体入侵细胞的特异性免疫球蛋白，能够筛选出针对新型冠状病毒的中和抗体是研发新冠病毒治疗药物的基础
有鉴于此，提出本发明。
发明内容
本发明的首要目的是寻求一种能够有效阻断新型冠状病毒(SARS-CoV-2)与受体蛋白结合的中和活性单抗。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种分离的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段特异性结合人新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RBD蛋白，该抗体或其片段包括如SEQ ID NO.1-3 所示的VH CDR1-3，和如SEQ ID NO.4-6所示的VL CDR1-3。
在一些实施方式中，所述抗体或其片段还包含重链恒定区、轻链恒定区、Fc区或其组合。
在一些实施方式中，所述抗体或其片段包含由SEQ ID NO：7-8所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO：7-8至少70％同源性的氨基酸序列，比如70％，80％或90％同源性的氨基酸序列。
在一些优选的实施方式中，所述70％同源性是针对所述抗体或其片段的Fr区。
在一些实施方式中，所述抗体或其片段为IgG、IgM、IgA、IgE或IgD的其中一种同种型，在一些具体的实施方式中，所述抗体或其片段为为IgG4亚型。
在一些实施方式中，所述抗体或其片段为嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体等。
在一些实施方式中，所述抗体或其片段为Fab、Fab’和F(ab’)2、Fvs或单链抗体。
在一些实施方式中，所述抗体或其片段包含氨基酸序列修饰，所述修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。
本发明还提供一种编码上述抗体或其片段的多核苷酸。
在一些实施方式中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO.9-10所示。
本发明还提供一种组合物，所述组合物包含上述的抗体或其片段。
在一些实施方式中，所述组合物为药物组合物；优选的，所述药物组合物还包含药学可接受的载体。
本发明还提供一种复合物，所述复合物连接有上述抗体或其片段；
在一些实施方式中，所述复合物为双抗复合物，复合物可连接另一种抗体序列；优选的，所述复合物还包含药学可接受的载体。
本发明还提供一种分离的细胞，所述细胞包含编码上述的抗体或其片段的一种或多种多核苷酸。
本发明还提供一种筛选方法，所述方法包括使用权利要求上述的抗体或其片段与其他溶液接触，基于接触进行筛选。
本发明还提供一种检测方法，所述方法包括使用权利要求上述的抗体或其片段与其他溶液接触，基于接触进行检测。
在一些优选的实施方式中，所述检测包括但不限于ELISA、WB、IP、IHC、CHIP、 IP或CBA等方法检测。
本发明还提供一种上述的抗体或其片段在制备诊断或治疗新冠病毒引起的疾病中的应用。
本发明的提取分离纯化栓菌酸的方法相对于现有技术，至少具有以下有益效果：
本发明制备的人源单克隆抗体能够特异性结合新型冠状病毒，具有亲和力高；而且所述抗体能够有效阻断新冠病毒与受体蛋白的结合，是有效的中和活性单抗；临床价值高，适于转化应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1抗原Spike蛋白制备的电泳图；
图2抗体筛选的流式细胞分选结果图；
图3重链基因扩增跑胶鉴定的部分结果；
图4轻链基因扩增跑胶鉴定的部分结果；
图5抗体EC50检测值；
图6抗体IC50检测值。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
本发明中关于细胞、核酸所使用的术语“分离的”，例如“分离的抗体或其片段”是指分别与存在于天然来源中的其它抗体或其片段所分离的分子；还可指当通过重组技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或细胞培养基的核酸或肽，或化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。此外，“分离的”意在包括不以天然状态存在的，并且不会以天然状态存在。术语“分离的”在本发明中也用于指从其他细胞蛋白质或组织分离的细胞、多肽或核酸等。分离的抗体意在包括纯化的和重组的多肽。
多核苷酸由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、和当多核苷酸是RNA时胸腺嘧啶置换为尿嘧啶(U)。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。该字母表示可以被输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，例如用于功能基因组学和同源性搜索。术语“多态性”是指多于一种形式的基因或其一部分的共存，具有至少两种不同形式(即两种不同的核苷酸序列)的基因的一部分被称为“基因的多态性区域”。多态性区域可以是单核苷酸，在不同的等位基因中其具有不同的同一性。
术语“编码”应用于多核苷酸时，是指被称为“编码”多肽的多核苷酸，如果在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，其可以被转录和/或翻译以产生多肽和/或其片段的mRNA。反义链是这种核酸的互补序列，其编码序列可以从中推导出来。
在本发明中，“抗体”或“抗原结合多肽”是指特异性识别和结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整的抗体及其任何抗原结合片段或其单链。因此术语“抗体”包括分子中含有具有与抗原结合的生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的含蛋白质或肽。包括但不局限的该实施例包括重链或轻链或其配体结合部分的互补决定区 (CDR)、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架(FR)区或其任何部分、或结合蛋白的至少一部分。
在本发明中，术语“片段”或“抗原结合片段”是抗体的一部分，例如F(ab’)2、 F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFv等。不管其结构如何，片段与被完整抗体识别的同一抗原结合。术语“片段”包括适体、镜像异构体和双价抗体。术语“片段”还包括通过与特定抗原结合形成复合物起抗体作用的任何合成或基因工程蛋白质。
在本发明中，术语“单链可变片段”或“scFv”是指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。在一些方面，这些区域与10个至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可以富含甘氨酸以增加柔韧性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以增加溶解性，并且可以连接VH的N端和VL的C端，反之亦然。尽管该蛋白质被除去了恒定区和引入了接头，但其保留了原始免疫球蛋白的特异性。ScFv分子是本领域中已知的，例如在美国专利5,892,019中有相关描述。
术语“抗体”包括可以在生物化学上区分的各种广泛种类的多肽。本领域技术人员将会理解，重链的类别包括gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质决定了抗体的“种类”分别为IgG、IgM、 IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等，已被充分表征并且赋予的功能特异性也已知。本领域普通技术人员容易想到这些种类和同种型中的每一种改变形式，因此都在本发明公开的保护范围内，所有的免疫球蛋白种类都显然在本发明公开的保护范围内，后面的讨论通常针对免疫球蛋白分子的IgG种类。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含分子量约23,000道尔顿的两条相同的轻链多肽和分子量约为53,000-70,000的两条相同的重链多肽。这四条链典型地通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链从“Y”口开始并延续通过可变区包围重链。
本发明公开的抗体、抗原结合多肽、片段包括但不限于单克隆、全人源、人源化或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段例如Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体，二硫键连接的Fvs(sdFv)，包含VK或VH结构域的片段，由Fab表达文库产生的片段和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如本发明公开的LIGHT抗体的抗Id抗体)。本发明公开的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、 IgD、IgA和IgY)或种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或者亚类。
轻链可以分为kappa或lambda(κ、λ)。每个重链可以与κ或λ轻链结合。一般来说，当由杂交瘤，B细胞或基因工程宿主细胞生产免疫球蛋白时，其轻链和重链通过共价键结合，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键或非共价键结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉状末端的N末端延伸至每条链底部的C末端。
轻链和重链都分成结构和功能同源性的区域。术语“恒定的”和“可变的”根据功能使用。应理解，轻链(Vκ)和重链(VH)链部分的可变区决定了抗原识别和特异性。相反地，轻链(CK)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定区赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。N端部分是可变区，C端部分是恒定区；CH3和CK 结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。
如上所述，可变区使得抗体能够选择性识别和特异性结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VK结构域和VH结构域或互补决定区(CDR)的子集结合形成了限定三维抗原结合位点的可变区。该抗体四级结构形成存在于Y的每个臂末端的抗原结合位点。更具体地说，抗原结合位点由VH和VK链中各自的三个CDR定义(即CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、 CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)。在某些情况下，例如某些来源于骆驼科动物的免疫球蛋白分子或基于骆驼科动物免疫球蛋白改造的免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可以仅由重链组成，没有轻链。例如参见Hamers-Casterman et al.，Nature 363：446- 448(1993)。
在本发明中，术语“重链恒定区”包括来源于免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽包括CH1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域或变体或片段中的至少一种。例如，本发明公开的抗原结合多肽可以包括含有CH1结构域的多肽链、包含CH1结构域以及至少一部分铰链区以及CH2结构域的多肽链、包含CH1结构域和CH3结构域的多肽链、包含CH1结构域、至少一部分铰链区以及CH3结构域的多肽链，或包含CH1结构域、至少一部分铰链区以及CH2结构域和 CH3结构域的多肽链。在另一实施例中，本发明公开的多肽包括包含CH3结构域的多肽链。此外，本发明中使用的抗体可能缺少至少一部分CH2结构域(例如全部或部分CH2 结构域)。如上所述，本领域普通技术人员应当理解，重链恒定区可以被修饰从而使得它们天然存在的免疫球蛋白分子的氨基酸序列发生变化。
在本发明中，术语“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的氨基酸序列。较佳地，轻链恒定区包含恒定κ结构域或恒定λ结构域中的至少一个。
在本发明中，术语“特异性结合”或“对……具有特异性”通常是指抗体通过其抗原结合结构域与表位结合，并且该结合需要抗原结合结构域和表位之间具有互补性。根据这个定义，当抗体通过其抗原结合结构域与该表位结合时，比它结合到随机的、不相关的表位更容易，其被称为“特异性结合”该表位。术语“特异性”在本发明中用于限定某种抗体与某个表位结合的相对亲和力。例如，可以认为抗体“A”比抗体“B”对特定表位具有更高的特异性，或者可以认为抗体“A”以比结合相关表位“D”更高的特异性结合表位“C”。
在本发明中，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防或减缓(减少)不期望发生的生理改变或紊乱，例如自身免疫性疾病的进程。有益的或期望的临床结果包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，包括症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及减轻(无论是部分还是全部)。“治疗”还意指与不接受治疗时预期的生存期限相比所延长的生存期限。需要治疗的包括那些已经患有病症或紊乱的人，以及那些容易患有病症或紊乱的人，或者那些需要预防该病症或紊乱的人。
抗新冠病毒(SARS-CoV-2)抗体
本发明提供了对人新冠病毒(SARS-CoV-2)具有高亲和力的抗人新冠病毒抗体23D52，该抗体来源于康复志愿者。被测抗体表现出有效的结合和抑制活性，并可用于治疗和诊断用途。其结合阻断了新冠病毒RBD蛋白与受体蛋白ACE2的结合。
根据本发明公开的一个实施例，提供了一种抗体，其包括重链和轻链可变结构域，所述重链和轻链可变结构域具有如序列SEQ ID NO.1-6定义的CDR区，如下表所示。
Figure BDA0002805563050000071
如实施例中的实验所示，含有这些CDR区的抗体，具有有效的结合和抑制新冠病毒RBD蛋白的活性。在一些实施例中，本发明公开的抗新冠病毒RBD蛋白抗体包含下表中列出的VH和VL。
Figure BDA0002805563050000072
Figure BDA0002805563050000081
在一些实施例中，所述轻重链可以包括氨基酸修饰，这些修饰可以是氨基酸的添加、删除或取代。所述修饰可以是在各个CDR或FR区进行取代。在一些实施例中，所述修饰是在一个、两个或三个这样的残基进行取代。在一个实施例中，所述修饰是在一个残基进行取代。在一些实施例中，这样的取代是保守取代。
“保守性氨基酸取代”是指其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸家族、包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，优选将免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基置换为来自同一侧链家族的另一种氨基酸残基。在另一个实施例中，一串氨基酸可以用同一个侧链家族成员中顺序和/或组成不同的结构相似的一串氨基酸进行置换。
本领域普通技术人员还应当理解，本发明所公开的抗体是可以被修饰的，修饰后其氨基酸序列不同于衍生出该抗体的天然存在的结合多肽的氨基酸序列。例如，衍生自同一指定蛋白质的多肽或氨基酸序列可以是与起始序列相似的，例如具有一定的百分比同一性，例如它可以与起始序列的百分比同一性是60％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％、98％或99％。
在一些实施例中，本公开的抗体和其片段可以是单特异性或双特异性抗体或片段。对于双特异性抗体，另一个特异性可以针对不同目标表位或可用于特定用途(例如治疗用途)的不同靶蛋白。
在一些实施例中，抗体包含氨基酸序列或一个或多个通常与抗体无关的基团。例如，抗体可以包含有韧性的接头序列，或者可以被修饰以添加功能性部分(例如PEG、药物、毒素或标签)。
在一些实施例中，抗体可包括糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护 /封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰等。
编码抗体的多核苷酸和制备抗体的方法。
本发明还公开了编码本发明所述抗体、变体及其衍生物的分离的多核苷酸或核酸分子。本发明公开的多核苷酸可以编码在同一多核苷酸分子上或在不同的多核苷酸分子上的抗原结合多肽、变体或衍生物的整个重链和轻链可变区。此外，本发明公开的多核苷酸可以编码在相同的多核苷酸分子上或在不同的多聚核苷酸分子上的抗原结合多肽、变体或衍生物的部分重链和轻链可变区。
在一些实施例中，本发明公开的编码抗新冠病毒RBD蛋白抗体包含下表中列出的VH 和VL多核苷酸序列。
Figure BDA0002805563050000091
制备抗体的方法是本领域公知的。在某些实施例中，本发明公开的抗体的可变区和恒定区都是全人源的，可以使用本领域常规的重组DNA技术制备。
诊断治疗方法和用途
在本发明中，本发明的抗体、变体或衍生物可用于某些诊断和治疗方法中。可以预期，本发明的中和活性抗体能够用于预防或治疗新型冠状病毒引起的疾病，具体可通过中和活性抑制新冠病毒和体内受体结合，进而阻止病毒感染，起到疾病预防和改善效果。另外，基于抗原抗体集合反应，本发明的中和活性抗体能够应用于新冠病毒的检测或诊断中，比如通过ELISA、WB、IP、IHC、CHIP、IP或CBA等方法中。
下面为具体的实施例实验。
实施例1抗原制备
克隆、表达和纯化新冠病毒的Spike抗原
从NCBI中获得新冠病毒Spike蛋白的序列，经密码子优化，构建至pcDNA3.1载体中，载体利用Qiagen的EndoFree Plasmid Kit无内毒素质粒提取试剂盒获得可转染质粒，利用lipo3000瞬时转染293T细胞，37度瞬时表达7d，收获细胞表达上清，利用 Ni柱亲和纯化，获得纯度大于80％的新冠病毒Spike蛋白，纯化结果如图1所示。
实施例2抗体分离筛选
将制备的Spike抗原标记FITC荧光染料后纯化得到S-FITC；从康复志愿者的外周血分离获取外周血淋巴细胞，经过磁珠方案对B细胞富集；利用anti-IgG PE、anti- IgMPerCP-Cy5.5和S-FITC对B细胞进行染色，通过流式分选，将IgG+IgM-S+群新冠病毒S抗原特异性的记忆B细胞亚群直接分选至已经加入细胞裂解液的96孔PCR板中，每孔一个细胞。
磁珠富集分选单个细胞到96孔板中：磁珠厂家stemcell
1.细胞复苏：将冻存的康复患者PBMC细胞及健康人PBMC细胞各1支(细胞量 1*107cells)在37度快速融化，将冻存细胞加入提前37度预热的8ml buffer1中 (PBS+2％FBS)，500g离心5min；
2.用10ml buffer1重悬，用40μm的细胞筛过滤，500g离心5min，取样计数；
3.过磁珠的健康人样本和康复人样本分别加buffer2(PBS+2％FBS+1nM EDTA)重悬到5×107/ml的浓度，体积在0.25-2ml之间，转移到流式管中；
4.按照50μL/mL of sample的量加入Cocktail Enhancer；
5.按照50μL/mL of sample的量加入Isolation Cocktail；
6.混匀，室温孵育5min；
7.将Vortex RapidSpheresTM.涡旋混匀30s，按照50μL/mL of sample的量加入RapidSpheresTM，混匀；
8.立即加入buffer至2.5ml体积，上下颠倒混匀2-3次，将管子放入磁力架，室温孵育3min；
9.将上清倒入新的流式管，再放入磁力架，室温孵育1min；
10.上清再倒入新的流式管中，取样计数；
序号 流式抗体
1 blank(不加任何抗体) 健康人样本，不过磁珠，1×10<sup>6</sup>/ml，100μl
2 IgG(PE) 健康人样本，不过磁珠，1×10<sup>6</sup>/ml，100μl
3 S protein(FITC) 健康人样本，不过磁珠，1×10<sup>6</sup>/ml，100μl
4 IgM(PerCP-Cy5.5) 健康人样本，不过磁珠，1×10<sup>6</sup>/ml，100μl
5 IgG+IgM 健康人样本，过磁珠，1×10<sup>6</sup>/ml，100μl
6 IgG+IgM+S protein 健康人样本，过磁珠，1×10<sup>6</sup>/ml，100μl
7 S protein(AF488) 康复者样本，不过磁珠
8 IgG+IgM 康复者样本，过磁珠，1×10<sup>6</sup>/ml，100μl
9 IgG+IgM+S protein 康复者样本，过磁珠，1×10<sup>6</sup>/ml，100μl
11. 500g离心5min，将康复者细胞用buffer1重悬，根据细胞数分别加入IgG、IgM、S蛋白(IgG、IgM：3μl/106cells，S蛋白：1μg/106cells，此时体积增加，但都是等比例的增加)；
12. 4度反应40min，分别加入1ml的buffer，500g，离心5min；
13.重复洗一次；
14.按照步骤12、13中的细胞数将细胞重悬成5×106/ml的密度，上机分选，BDFACSAria III，pure模式，分选到96孔板中(已加入vazyme N711试剂盒中的裂解液成分)，总共分选了3块板。
流式分选结果如图2所示，分别圈出B细胞群，IgG+IgM-S+细胞群，筛选多株目标抗体。
实施例3抗体序列确定
通过单细胞反转录，调取每个孔里的单个B细胞的抗体的轻链和重链的可变区基因。
单细胞反转录按照vazyme N711试剂盒的步骤获得双链cDNA，以此作为模板，进行单个B细胞抗体轻、重链基因的调取，体系：25μl vazyme P515，上下游引物各2μl，模板cDNA1μl，DDW 20μl，PCR反应条件为95℃，3min，95℃，15s，60℃，15s， 72℃，30s，72℃，7min。经过跑胶鉴定，抗体基因PCR的阳性率在85％以上。
图3为重链基因扩增部分结果,图4为轻链基因扩增部分结果。基于此获得多株抗体序列，其中23D52抗体基因可变区序列，如SEQ ID NO.7-8，CDR序列如SEQ ID NO.1- 6所示，编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.9-10所示。
实施例4抗体蛋白制备
以PEE12.4载体为模板，分别获得CMV，polyA片段，再以已经构建的PEE-IgG4-CH载体为模板，获得IgG4-CH-polyA片段，通过overlap PCR的方法，分别获得含有CMV，抗体基因，polyA片段的可转染片段，深孔板瞬转CHO细胞，32℃表达8d，离心获得抗体表达上清，proteinA纯化获得纯度>90％的抗体蛋白。
实施例5抗体亲和力实验
如实施例4，通过基因工程的方法，将康复志愿者来源的每个单B细胞的可变区序列构建为IgG4亚型，再通过ELISA结合实验，确认该抗体23D52、23D145和23D142对新冠病毒RBD抗原的结合能力。
ELISA结合实验：
1.试剂配制
2.碳酸盐缓冲液的配制：
Figure BDA0002805563050000121
1×PBST洗液的配制：
Figure BDA0002805563050000122
PBS缓冲液的配制：
Figure BDA0002805563050000123
封闭液/抗体稀释液(含1％BSA的PBST缓冲液)
BSA 1g
PBST 100ml
3.包被特异性抗原
1)用碳酸盐缓冲液将抗原蛋白(表达的RBD蛋白)稀释至0.1ug/ml-10ug/ml(一般包被浓度1ug/ml，最优包被条件需进行试验选择)，将稀释好的抗原加入96孔酶标板(100ul/孔)，4℃过夜后用1×PBST洗板2次，2min/次，甩干。
2)封闭液的配制：用PBS缓冲液配制1％BSA(w/v)。
3)封闭：每孔加入200ul封闭液，37℃孵育2h-3h，1×PBST洗板2次，2min/次，甩干备用。
3.稀释待测抗体
用抗体稀释液(封闭液)将待测抗体稀释至5000ng/ml，充分混匀；
按照2倍梯度进行11个浓度梯度的稀释，最后一孔加入稀释液；
100μl每孔加样，加完样后将酶标板置于37℃孵育，1h后用PBST洗液洗板4 次，2min/次，甩干。
4.稀释酶标二抗
用抗体稀释液将酶标二抗稀释10000倍，100ul/孔加入步骤2.2.4中的酶标板中，37℃孵育40min，用PBST洗液洗板4次，2min/次，甩干。
5.显色，每孔加入TMB显色液100ul，37℃反应5-20min。
6.终止，每孔加入50ul 2M硫酸终止。
7.测定，用酶标仪测定450nm处的各孔吸光值。
23D52 23D145 23D142 阴性1 阴性2
EC50(ng/ml) 29.87 14.32 14.65 6380 3870
所述阴性1和2分别为筛选到的其他新冠抗体，与RBD虽有一定的结合活性，但对RBD和ACE2的结合不起抑制作用。
结果如图5所示，23D52、23D145和23D142抗体相比于其他而言EC50值最优，表明其抗原结合活性最好。
实施例6抗体竞争性实验
如实施例4，通过基因工程的方法，将康复志愿者来源的每个单B细胞的可变区序列构建为IgG4亚型，通过HTRF竞争实验，确认抗体23D145对新冠病毒阻断能力。
HTRF竞争实验
1.用Diluent buffer(50mM Hepes，0.1％Tween20，0.2％BSA，0.5‰P300，PH7.0)稀释RBD-tag1抗原，使其浓度为100nM。
2.用Diluent buffer稀释ACE2-tag2抗原，使其浓度为80nM。
3.用Detection buffer(50mM Hepes，250mM KF，0.1％Tween20，0.2％BSA， 0.5‰P300，PH7.0)稀释anti-tag1-Eu，使其浓度为20nM。
4.用Detection buffer稀释anti-tag2-A2，使其浓度为50nM。
5.将稀释后的anti-tag1-Eu和anti-tag2-A2，1:1混合均匀。
6.用Diluent梯度稀释抗体(首浓度5.3*10-7M)，2倍梯度稀释。
7.向384孔板中加入4μl抗体，再加入4μl ACE2-tag2，再加入4μl RBD- tag1，最后加入8μl第5步混合均匀的供受体。
8.室温孵育2h。
9.酶标仪检测。
23D52 23D145 23D142 阴性1 阴性2
IC50(ug/ml) 0.111 0.1033 0.1019 无抑制 无抑制
结果如图6所示，利用HTRF(均相时间分辨荧光)方法学测定抗体23D52、23D145 和23D142阻断新冠病毒RBD蛋白与受体蛋白ACE2结合的活性，结果表明23D52、23D145 和23D142抗体都具有及其显著的阻断活性。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 山西省人民医院
<120> 一种人源抗新型冠状病毒的中和活性单克隆抗体
<130> 2020
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 1
Gly Ile Thr Val Ser Ser Asn Tyr
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 2
Leu Tyr Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 3
Ala Arg Asp Leu Val Val Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 4
Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 5
Ala Ala Ser
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 6
Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Leu Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Leu Val Val Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 8
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val His Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 351
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 9
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggaat caccgtcagt agcaactaca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg ggctggagtg ggtctcagtt ctttatagcg gtggtagcac agactacgca 180
gactccgtga agggcagatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctt 240
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatctagtg 300
gtctacggga tggacgtctg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc a 351
<210> 10
<211> 321
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 10
gacatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca gggcattagc agttatttag cctggtatca gcaaacacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag cttaatagtt acccattcac tttcggccct 300
gggaccaaag tgcatatcaa a 321

Claims (10)

1.一种分离的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段特异性结合人新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RBD蛋白，该抗体或其片段包括如SEQ ID NO.1-3所示的VH CDR1-3，和如SEQ ID NO.4-6所示的VL CDR1-3。
2.如权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段还包含重链恒定区、轻链恒定区、Fc区或其组合。
3.如权利要求1-2任一所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含由SEQ ID NO：7-8所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO：7-8至少70％同源性的氨基酸序列。
4.如权利要求1-3任一所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段为IgG、IgM、IgA、IgE或IgD的其中一种同种型；优选的，所述抗体或其片段为嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体；更优选的，所述抗体或其片段为Fab、Fab’和F(ab’)2、Fvs或单链抗体。
5.如权利要求1-4任一所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段还包含氨基酸序列修饰，所述修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。
6.编码权利要求1-5任一项所述的抗体或其片段的多核苷酸；优选的，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO.9-10所示。
7.一种组合物/复合物，其特征在于，所述组合物/复合物包含或连接权利要求1-5任一项所述的抗体或其片段；优选的，所述组合物/复合物还包含药学可接受的载体。
8.一种分离的细胞，其特征在于，所述细胞包含编码如权利要求1-5任一项所述的抗体或其片段的一种或多种多核苷酸。
9.一种筛选、鉴定或检测方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1-5任一项所述的抗体或其片段与其他溶液接触的步骤，基于接触步骤进行筛选、鉴定或检测。
10.权利要求1-5任一项所述的抗体或其片段在制备诊断或治疗新型冠状病毒引起的疾病中的应用。
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