CN112493312A - 一种抗菌肽Cm-CATH2防控谷物中层出镰孢菌的应用及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗菌肽Cm‑CATH2防控谷物中层出镰孢菌的应用及用途，其中抗菌肽Cm‑CATH2针对层出镰孢菌的抑菌应用；一种抗菌肽Cm‑CATH2防控谷物中层出镰孢菌的用途，抗菌肽Cm‑CATH2在层出镰孢菌抑菌过程中的使用。本发明使得抗菌肽Cm‑CATH2对层出镰孢菌的抑菌特性能用于谷物原料储藏和加工中，其制率可高达90％，抑菌明显、试验重复性好，特异性高，操作简单，稳定性和安全性都更高，有效地保证谷物原料安全且不受层出镰孢菌侵染，避免其真菌毒素污染谷物食品，不仅减少农药和真菌毒素等对谷物食品安全的影响，而且为科学防控层出镰孢菌病害提供实验依据和应用价值。

Description

一种抗菌肽Cm-CATH2防控谷物中层出镰孢菌的应用及用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说，涉及抗菌肽Cm-CATH2在防控谷物中层出镰孢菌方面的应用以及用途。

背景技术

在农产品生产过程中，谷物常常会因病原菌的侵染而影响其品质，层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)是其中影响较大的食源性致病霉菌，由于其爆发地区广，感染的谷物种类多，从而引起广泛的关注。层出镰孢菌污染谷物类食品并在其生长代谢过程中能产生多种镰孢菌毒素，常见的毒素有：萎蔫酸(fusaric acid)、伏马菌素(fumonisin)、白僵菌素(beauvericin)、串珠镰孢菌素(moniliformin)、脱氧雪腐镰孢菌烯醇(deoxynivalenol)和玉米烯酮(zearalenone)等，这些镰孢菌毒素会进一步污染作物，人畜食用后轻者中毒，重者将导致死亡。因此，层出镰孢菌产生的真菌毒素对全球粮食安全和人类健康构成严重的威胁。

层出镰孢菌普遍存在于玉米、水稻、小麦等谷物中，它会产生伏马菌素污染谷物，从而使食用这些被污染谷物的哺乳动物发生病理变化。更为重要的是，随着抗真菌药物品种和使用量越来越多，导致耐药真菌数量越来越多，不仅影响了粮食的产量，还产生了交叉耐药性，这已成为当今谷物病菌防控的难题。因此研发安全有效地防控层出镰孢菌的方法和措施，已经是进一步发展我国农业生产的重要前提。

抗菌肽是存在于生物体内的一种天然小分子多肽，在食品安全领域扮演重要的角色，除了拥有广谱抗菌性外，还具有无毒无害代谢负担小等特点。中国发明专利：一种抗微生物肽Cm-CATH2及其基因、制备方法和应用(申请号：2016105857477)提出Cm-CATH2是来源于海龟中的一种小分子肽，对原菌株大肠杆菌、痢疾杆菌、金黄色葡糖球菌、革兰氏阴性细菌有很强的抗菌活性，是一种高效绿色安全的抑菌物质。本发明基于此，研究Cm-CATH2在防控谷物中层出镰孢菌方面的应用，为科学防控层出镰孢菌引起的病害提供充足的实验依据和潜在的应用价值。

发明内容

本发明提供了一种抗菌肽Cm-CATH2防控谷物中层出镰孢菌的应用及用途，以解决层出镰孢菌感染谷物，从而使食用这些被污染谷物的哺乳动物发生病理变化的情况，达到对人体安全有效地防控层出镰孢菌的目的。

为了实现上述目的，本发明提供一种抗菌肽Cm-CATH2防控谷物中层出镰孢菌的应用，抗菌肽Cm-CATH2针对层出镰孢菌的抑菌应用。

优选的，抑菌应用于谷物中所述层出镰孢菌。

一种抗菌肽Cm-CATH2防控谷物中层出镰孢菌的用途，抗菌肽Cm-CATH2在层出镰孢菌抑菌过程中的使用。

优选的，抗菌肽Cm-CATH2在谷物中针对层出镰孢菌抑菌过程中的使用。

本发明的有益效果在于：本发明方案使得抗菌肽Cm-CATH2对层出镰孢菌的抑菌特性能够用于谷物原料储藏和加工过程中，其抑制率可高达90％，抑菌效果明显、试验重复性好，特异性高，并且操作简单，稳定性和安全性都更高。本发明可有效地保证谷物原料安全且不受层出镰孢菌侵染，有效避免层出镰孢菌产生真菌毒素污染谷物食品，不仅减少农药和真菌毒素等对谷物食品产生的安全性影响，而且为科学防控层出镰孢菌引起的病害提供充足的实验依据和应用价值。

附图说明

图1是二倍稀释法测定抗菌肽Cm-CATH2对层出镰孢菌最小抑菌浓度示意图；

图2是层出镰孢菌互作2小时空白对照组电镜图；

图3是终浓度为1/2×MIC的Cm-CATH2与层出镰孢菌互作抑菌2小时电镜图；

图4是终浓度为1×MIC的Cm-CATH2与层出镰孢菌互作抑菌2小时电镜图；

图5是层出镰孢菌互作4小时空白对照组电镜图；

图6是终浓度为1/2×MIC的Cm-CATH2与层出镰孢菌互作抑菌4小时电镜图；

图7是终浓度为1×MIC的Cm-CATH2与层出镰孢菌互作抑菌4小时电镜图；

图8是谷物原料防控模型中的被侵染层出镰孢菌的种子数目示意图。

具体实施方式

下面结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例，但本发明的内容并不局限于此。

本发明包括以下步骤：

S1、层出镰孢菌的培养：将菌株复苏后，接种到培养基上，25℃恒温培养；

S2、层出镰孢菌孢子悬浮液制备：加入无菌水反复振荡冲洗，过滤后得到的分生孢子悬浮液，将分生孢子悬浮液浓度稀释至1×10⁵个/mL，4℃放置备用；

S3、测定Cm-CATH2对层出镰孢菌的抑菌圈：采用牛津杯双层培养基法，下层为灭菌PDA培养基，上层为无菌的1×10⁵个/mL分生孢子悬浮液和50℃的PDA培养基混匀后平铺于已制备好的下层培养基上；将Cm-CATH2在4℃，5000rmp离心后，加无菌水稀释后分别加入不同浓度的Cm-CATH2溶液，并以无菌水作为空白对照，25℃黑暗条件下恒温静置培养，24h、48h和72h后分别取出观察；

S4、测定Cm-CATH2对层出镰孢菌最小抑菌浓度：采用二倍稀释法测定，无菌条件下，将PDB液体培养基加入无菌孔板第1列孔中,再加入浓度为8mg/mL的抗菌肽并混合均匀，第2～8列孔分别加入PDB液体培养基；然后依次分别进行二倍稀释；在1～9孔中分别加入浓度为2×10⁵个/mL的分生孢子悬浮液，即终浓度为1×10⁵个/mL；以空白培养基和菌液作为对照；孔板放于恒温培养箱中25℃培养16h后，波长为600nm在酶标仪中测定；

S5、抑菌模式的观察：向含有浓度为1×10⁸个/mL的分生孢子悬浮液的PDB液体培养基中分别加入终浓度为1/2×MIC和1×MIC浓度的Cm-CATH2，ddH₂O作为空白对照组，在150rpm，25℃条件下，黑暗中恒温振荡培养；培养2h和4h后分别取培养液7500rpm离心5min，倒掉上清，加入2.5％戊二醛溶液1.5mL，并吹打其沉淀呈悬浮状态，4℃过夜固定，进行电镜制样并观察；

S6、构建谷物原料防控应用模型：用70％乙醇漂洗，2％次氯酸纳溶液漂洗对谷物种子消毒，然后用无菌水漂洗；将浓度为1×10⁵个/mL的分生孢子悬浮液和1×MIC的Cm-CATH2均匀的喷洒到种子表面；空白对照组用无菌水进行喷洒；在25℃下避光恒温培养，干燥时及时喷洒无菌水。

实施例1

1、材料与仪器

实验材料为大连工业大学国家海洋食品工程技术研究中心提供的抗菌肽Cm-CATH2和层出镰孢菌(Fusariumproliferatum)。实验所需日本晴水稻和小堰22小麦为西北农林旱区逆境生物学国家实验室许金荣教授实验室提供，所需无公害玉米和健康玉米源自当地市场。实验仪器主要有扫描电子显微镜Quanta450、酶标仪、高速冷冻离心机、恒温培养振荡器(摇床)等。

2、层出镰孢菌培养

实验所需菌株为层出镰孢菌(Fusariumproliferatum K140108)，将﹣80℃保存的菌株复苏后，接种到PDA培养基上，25℃恒温霉菌培养箱中培养7天，观察镰孢菌菌丝量，当菌丝长满平板即可进行后续实验。

3、层出镰孢菌孢子悬浮液制备

在培养7天后培养基中，加入2mL无菌水反复振荡冲洗，过滤后得到的分生孢子悬浮液，使用血球计数板计数后，将分生孢子悬浮液浓度稀释至1×10⁵个/mL，4℃放置备用。

4、抑菌活性的测定

测定Cm-CATH2对层出镰孢菌的抑菌圈，依据抑菌圈的大小初步判定其对层出镰孢菌的抑菌活性。采用牛津杯双层培养基法，下层倾入10mL灭菌的PDA培养基，上层为无菌条件下将浓度为1×10⁵个/mL分生孢子悬浮液和10mL温度为50℃左右的PDA培养基，轻轻混匀后迅速平铺于已制备好的下层培养基上，凝固后进行后续实验。

分别将Cm-CATH2干粉在4℃，5000rmp离心30s后，加入无菌水稀释至4mg/mL、2mg/mL和1mg/mL，将四个无菌牛津杯在上述制备好的培养基上对称放置，分别加入200μL上述浓度的Cm-CATH2溶液，并以无菌水作为空白对照，25℃黑暗条件下恒温静置培养，24h、48h和72h后分别取出观察。本实验做三次生物学重复，每次三个平行。

72h后观察实验结果显示，Cm-CATH2浓度为1mg/mL时抑菌圈直径为1.09cm；浓度为2mg/mL时抑菌圈直径为1.35cm；浓度为4mg/mL时抑菌圈直径为1.92cm。由此可见，随着浓度的增加抑菌圈直径越大表现出抑菌效果越明显，说明抗菌肽Cm-CATH2对层出镰孢菌具有较好的抑菌作用。

5、最小抑菌浓度的测定

采用二倍稀释法测定Cm-CATH2对层出镰孢菌最小抑菌浓度。无菌条件下，将90μL的PDB液体培养基加入无菌96孔板的第1列孔中，第2～8列孔分别加入50μL的PDB液体培养基。在1孔加入10μL浓度为8mg/mL的抗菌肽并混合均匀，然后依次分别进行二倍稀释。在1～9孔中分别加入50μL浓度为2×10⁵个/mL的分生孢子悬浮液，即终浓度为1×10⁵个/mL。上述相同步骤在孔板的第二行和第三行做两次平行。以空白培养基和菌液作为对照。孔板放于恒温培养箱中25℃培养16h后，在酶标仪中测定，波长为600nm，本实验做三次，每次做三个平行。

表1是波长为600nm时最小抑菌浓度的测定

如图1所示，采用二倍稀释法测定Cm-CATH2对层出镰孢菌的最小抑菌浓度，其中第1～7列菌液澄清层出镰孢菌无生长迹象，第8列往后层出镰孢菌开始生长，说明最小抑菌浓度介于7和8列之间，计算其浓度平均值得出MIC为9.375μg/mL。

6、抑菌模式的观察

向50mL含有2mL浓度为1×10⁸个/mL的分生孢子悬浮液的PDB液体培养基中分别加入终浓度为1/2×MIC和1×MIC浓度的的Cm-CATH2，ddH₂O作为空白对照组，在150rpm，25℃条件下，黑暗中置于恒温振荡器培养。培养2h和4h后分别取25mL培养液7500rpm离心5min，倒掉上清，加入2.5％戊二醛溶液1.5mL，并用枪头轻轻吹打其沉淀呈悬浮状态，4℃过夜固定。

收集样品分别用无菌的0.1moL/L磷酸缓冲溶液清洗三次后，进行50％、70％、80％、90％乙醇梯度脱水10到15min，再用100％乙醇脱水三次，每次脱水时间为10min。脱水后，进行叔丁醇置换，每次置换静置15～20min，在-20℃100％叔丁醇中浸泡过夜，最后进行真空冷冻干燥和镀金。

如图2、图5所示，层出镰孢菌刚从PDA培养基洗脱未加入Cm-CATH2时，孢子表面较为光滑，呈椭圆形，细胞完整且发育良好，两端有明显的隔膜。1/2×MIC浓度作用下，如图3、图6所示，孢子表面出现明显的褶皱，并产生大量分泌物，表明孢子受Cm-CATH2的影响有应激反应。随着Cm-CATH2的浓度增加，如图4、图7所示，1×MIC时，孢子的褶皱增加，并且因为有粘性的分泌物增多导致孢子粘连在一起。同时，随着Cm-CATH2作用时间的增加，孢子的受损程度也越来越严重。观察结果表明，Cm-CATH2作用于层出镰孢菌的细胞膜，导致细胞表面皱缩甚至形成孔洞，细胞内容物泄漏从而引起孢子的死亡。

7、构建谷物原料防控应用模型

在无菌超净工作台上对谷物种子进行表面消毒，分别为70％乙醇漂洗30s，2％次氯酸纳溶液漂洗1.5min，然后放在无菌培养皿中用无菌水漂洗3次，移入含有1mL无菌水和滤纸的培养皿中，每皿30粒。

将浓度为1×10⁵个/mL的分生孢子悬浮液装入喷壶中，使液体均匀的喷洒到种子表面。将浓度为1×MIC的Cm-CATH2使用同样方法喷洒均匀。空白对照组谷物种子使用无菌水进行喷洒。将培养皿放置在25℃的恒温培养箱中避光培养并持续观察，当滤纸干燥时及时喷洒无菌水。3d、5d、7d和9d后进行拍照观察并进行结果分析。上述实验做三次，每次三个平行。

如附图8所示，通过记录和比较对照组和实验组谷物原料防控模型中的被侵染层出镰孢菌的种子数目，结果表明加入抗菌肽Cm-CATH2的谷物原料中有明显的抑制层出镰孢菌生长的效果。通过计算，将其应用于谷物原料储藏和加工过程中，其抑制率可高达90％。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种抗菌肽Cm-CATH2防控谷物中层出镰孢菌的应用，其特征在于，抗菌肽Cm-CATH2针对层出镰孢菌的抑菌应用。

2.根据权利要求1所述抗菌肽Cm-CATH2防控谷物中层出镰孢菌的应用，其特征在于，抑菌应用于谷物中所述层出镰孢菌。

3.一种抗菌肽Cm-CATH2防控谷物中层出镰孢菌的用途，其特征在于，抗菌肽Cm-CATH2在层出镰孢菌抑菌过程中的使用。

4.根据权利要求3所述抗菌肽Cm-CATH2防控谷物中层出镰孢菌的用途，其特征在于，抗菌肽Cm-CATH2在谷物中针对层出镰孢菌抑菌过程中的使用。

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