CN112450355A - 一种抗菌肽Cm-CATH2抑制海产品中副溶血性弧菌的应用及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗菌肽Cm‑CATH2抑制海产品中副溶血性弧菌的应用，其中抗菌肽Cm‑CATH2针对副溶血性弧菌的抑菌应用；一种抗菌肽Cm‑CATH2抑制海产品中副溶血性弧菌的用途，其中抗菌肽Cm‑CATH2在副溶血性弧菌抑菌过程中的使用。本发明抗菌肽Cm‑CATH2对副溶血性弧菌的抑菌特性使抑菌效果高达85％、试验重复性好、特异性高，操作简单，稳定性和安全性较高，可有效地保证海产品原料安全且不受副溶血性弧菌污染，避免副溶血性弧菌引发的食物中毒事件，解决副溶血性弧菌耐药性问题，而且确保海产品食用的安全性，同时为研发新型抑菌包装材料或消杀剂以确保海产品食用安全性提供理论基础和技术指导。

Description

一种抗菌肽Cm-CATH2抑制海产品中副溶血性弧菌的应用及 用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说，涉及抗菌肽Cm-CATH2在防控海产品中副溶血性弧菌方面的应用以及用途。

背景技术

副溶血性弧菌所引起的食源性疾病多为食物中毒，自1998年以来，在病原微生物所引起的疾病暴发事件中，副溶血性弧菌引起食物中毒的发生规模及人群暴露规模明显上升，均超过沙门氏菌所引起的食物中毒事件，已跃居食源性致病菌首位。并且因其耐盐嗜盐性广泛地的分布在世界各地的海水环境中，在多种鱼类、虾类和贝壳类的海洋生物中均可分离得到，尤其是在海产品中检出率较高，其中在海虾中检出率达90％，海产鱼类为70％，贝类为60％，蟹类为40％，平均检出率为65％。此外，副溶血性弧菌对海洋生物的感染检出率在第三第四季度较高，具有明显的季节性特点。

目前为消杀副溶血性弧菌带来的食品原料污染，主要是使用抗生素进行防治，但大规模使用抗生素的同时，自然界中的副溶血性弧菌相应产生一定耐药性，为克服这一缺点，研究发现天然抗菌肽具有广谱杀菌作用有望替代抗生素在海产品中的应用。

抗菌肽是存在于生物体内的一种天然小分子多肽，在食品安全领域扮演重要的角色，除了拥有广谱抗菌性外，还具有无毒无害代谢负担小等特点。中国发明专利：一种抗微生物肽Cm-CATH2及其基因、制备方法和应用(申请号：2016105857477)提出Cm-CATH2是来源于海龟中的一种小分子肽，对原菌株大肠杆菌、痢疾杆菌、金黄色葡糖球菌、革兰氏阴性细菌有很强的抗菌活性，是一种高效绿色安全的抑菌物质。本发明基于此，对Cm-CATH2在副溶血性弧菌上的抑菌作用展开进一步研究，为研发新型抑菌包装材料或消杀剂以确保海产品食用安全性提供理论基础和技术指导。

发明内容

本发明提供了一种抗菌肽Cm-CATH2抑制海产品中副溶血性弧菌的应用及用途，以解决副溶血性弧菌感染海产品，从而引起食物中毒的情况，达到对人体安全有效地防控副溶血性弧菌的目的。

为了实现上述目的，本发明提供一种抗菌肽Cm-CATH2抑制海产品中副溶血性弧菌的应用，抗菌肽Cm-CATH2针对副溶血性弧菌的抑菌应用。

优选的，抑菌应用于海产品中所述副溶血性弧菌的抑菌。

一种抗菌肽Cm-CATH2抑制海产品中副溶血性弧菌的用途，抗菌肽Cm-CATH2在副溶血性弧菌抑菌过程中的使用。

优选的，抗菌肽Cm-CATH2在海产品中针对副溶血性弧菌抑菌过程中的使用。

本发明的有益效果在于：本发明抗菌肽Cm-CATH2对副溶血性弧菌的抑菌特性使抑菌效果高达85％，抑菌效果明显、试验重复性好、特异性高，并且操作简单，稳定性和安全性较高。使用本发明可有效地保证海产品原料安全且不受副溶血性弧菌污染，有效避免副溶血性弧菌引发的食物中毒事件，不仅切实解决副溶血性弧菌产生耐药性的问题，而且确保海产品食用的安全性，同时为研发新型抑菌包装材料或消杀剂以确保海产品食用安全性提供理论基础和技术指导。

附图说明

图1是二倍稀释法测定抗菌肽Cm-CATH2对副溶血性弧菌最小抑菌浓度示意图；

图2是副溶血性弧菌互作抑菌10min空白对照组电镜图；

图3是终浓度为1X MIC的抗菌肽Cm-CATH2与副溶血性弧菌互作抑菌10min电镜图；

图4是终浓度为1X MIC的抗菌肽Cm-CATH2与副溶血性弧菌互作抑菌20min电镜图；

图5是终浓度为1X MIC的抗菌肽Cm-CATH2与副溶血性弧菌互作抑菌30min电镜图。

具体实施方式

下面结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例，但本发明的内容并不局限于此。

本发明包括以下步骤：

S1、副溶血性弧菌培养：菌株复苏后，转接到装无菌TSB培养基中，于37℃恒温中150rpm/min震荡培养，挑取单菌落转入装有TSB培养基摇瓶中，150rpm/min震荡培养，稀释到1×10⁶CFU/mL，4℃备用；

S2、测定抗菌肽Cm-CATH2对副溶血性弧菌的抑菌活性：将Cm-CATH2干粉在4℃，5000rmp离心30s后，分别稀释至1mg/mL和0.5mg/mL；牛津杯双层培养基中下层倾入10mL灭菌的TSA培养基，上层为无菌1×10⁶CFU/mL的副溶血性弧菌悬浮液加入50℃TSA培养基中混合均匀后，平铺于下层装培养基上，在牛津杯中分别注入不同浓度Cm-CATH2溶液，ddH₂O作为对照，37℃恒温静置培养；

S3、测定抗菌肽Cm-CATH2对副溶血性弧菌最小抑菌浓度：用二倍稀释法测定Cm-CATH2对副溶血性弧菌最小抑菌浓度；96孔板中LTSB培养基中副溶血性弧菌悬浮液终浓度为2×10⁵CFU/mL，每列设置不同浓度的抗菌肽Cm-CATH2，不加抗菌肽Cm-CATH2和TSB培养基分别作对照，于37℃恒温静置培养，16h后在酶标仪中测定，波长为OD600nm；

S4、抑菌模式的观察：将浓度为1×10⁶CFU/mL的副溶血性弧菌悬浮液与抗菌肽Cm-CATH2混合，菌液终浓度为2×10⁵CFU/mL，抗菌肽Cm-CATH2终浓度为9.375μg/mL(1×MIC)，以ddH2O作为空白对照组，于37℃恒温180rpm震荡培养；培养每间隔一段相同时间后分别取培养液8000rpm离心后，倒掉上清，加入2.5％戊二醛溶液，并吹打其沉淀呈悬浮状态，4℃过夜固定，进行电镜制样并观察；

S5、构建海虾抑菌应用模型：设置对照组为接种副溶血性弧菌、实验组为加入1×MIC的Cm-CATH2、空白组为ddH₂O；将1×MIC的Cm-CATH2均匀涂抹在海虾表面，接入2×10⁵CFU/mL的副溶血性弧菌悬浮液接种海对虾表面，在37℃的中培养；每间隔一段相同时间分别加入0.01M，pH为7.2-7.4的无菌PBS缓冲溶液混匀，再用无菌PBS缓冲溶液对混匀的样品进行10倍稀释，吸取无菌TSB在平板中涂布，于37℃恒温培养16h后，进行菌落计数。

实施例1

1、材料与仪器

实验材料为大连工业大学国家海洋食品工程技术研究中心提供的抗菌肽Cm-CATH2和副溶血性弧菌菌株(Vibrioparahaemolyticus，ATCC17802)。实验仪器主要有扫描电子显微镜Quanta450、酶标仪、高速冷冻离心机、恒温培养振荡器(摇床)等。

2、副溶血性弧菌培养

实验所需菌株为副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus，ATCC17802)，购于中国微生物菌种中心。将﹣80℃保存的菌株复苏后，在超净工作台中吸取5μL转接到装有50mL的无菌TSB培养基中，于37℃恒温摇床中150rpm/min震荡培养16h。在TSA培养基上划线，于37℃恒温培养箱中培养16h后，挑取单菌落后，转入装有50mLTSB培养基摇瓶中，150rpm/min震荡培养16h，将其稀释到1×10⁶CFU/mL，4℃备用。

3、抑菌活性的测定

采用牛津杯双层培养基法测定抗菌肽Cm-CATH2对副溶血性弧菌的抑菌活性，依据抑菌圈的大小初步判定其对副溶血性弧菌的抑菌活性。将2mg的Cm-CATH2干粉在4℃，5000rmp离心30s后，用无菌水分别稀释至1mg/mL和0.5mg/mL。牛津杯双层培养基中下层倾入10mL灭菌的TSA培养基，上层为无菌条件下将500μL的1×10⁶CFU/mL的副溶血性弧菌悬浮液加入9.5mL的50℃左右的TSA培养基中混合均匀后，平铺于下层装培养基上，凝固后进行后续实验。将四个无菌牛津杯在上述制备的培养基上对称放置，在牛津杯中分别注入200μL上述浓度的Cm-CATH2溶液(2mg/mL、1mg/mL和0.5mg/mL)，ddH₂O作为对照，37℃恒温培养静置培养16h后取出观察，该实验做三次生物学重复试验，每次三个平行。

实验结果显示，Cm-CATH2浓度为0.5mg/mL时抑菌圈直径为1.28cm；浓度为1mg/mL时抑菌圈直径为1.67cm；浓度为2mg/mL时抑菌圈直径为1.83cm。由此可见，随着浓度的增加抑菌圈直径越大表现出抑菌效果越好，说明抗菌肽Cm-CATH2对副溶血性弧菌具有较好的抑菌作用。

4、最小抑菌浓度的测定

采用二倍稀释法测定Cm-CATH2对副溶血性弧菌最小抑菌浓度。96孔板中100μLTSB培养基中副溶血性弧菌悬浮液终浓度为2×10⁵CFU/mL，每列抗菌肽Cm-CATH2浓度分别为：100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.5625μg/mL、0.78μg/mL、0.39μg/mL、0.19μg/mL，不加抗菌肽Cm-CATH2和TSB培养基分别作对照，于37℃恒温培养箱中静置培养，16h后在酶标仪中测定，波长为OD600nm，该实验做三次，每次三个平行。

表1是波长为600nm时最小抑菌浓度的测定

采用二倍稀释法测定Cm-CATH2对副溶血性弧菌的最小抑菌浓度，如图1所示，第1～4列培养液澄清无该菌生长，第5列后显示该菌已生长，则最小抑菌浓度通过计算为9.375μg/mL。

5、抑菌模式的观察

将浓度为1×10⁶CFU/mL的副溶血性弧菌悬浮液与抗菌肽Cm-CATH2混合，菌液终浓度为2×10⁵CFU/mL，抗菌肽Cm-CATH2终浓度为9.375μg/mL(1×MIC)，以ddH2O作为空白对照组，于37℃恒温摇床180rpm震荡培养。培养10min、20min和30min后分别取2mL培养液8000rpm离心5min，倒掉上清，加入2.5％戊二醛溶液1.5mL，并用枪头轻轻吹打其沉淀呈悬浮状态，4℃过夜固定。

收集样品分别用无菌的0.1moL/L磷酸缓冲溶液清洗三次后，进行50％、70％、80％、90％乙醇梯度脱水10到15min，再用100％乙醇脱水三次，每次脱水时间为10min。脱水后，进行叔丁醇置换，每次置换静置15～20min，100％叔丁醇中浸泡-20℃过夜，最后进行真空冷冻干燥和镀金。

将样品置于扫描电子显微镜下进行观察，如图2-5所示，副溶血性弧菌在无抗菌肽Cm-CATH2作用下该菌表面光滑呈完整的棒状结构，1X MIC作用10min时副溶血性弧菌细胞膜表面向内凹陷，细胞膜结构发生变化，20min时菌表面明显出现褶皱，细胞通透性发生改变，外泌物质将部分菌体粘在一起，30min时菌体通透性完全改变，内物质流出，细胞膜完全被破坏使抗菌肽Cm-CATH2达到有效杀菌目的。

6、构建海虾抑菌应用模型

本实验参照广东海洋大学王润东博士学位论文(王润东.副溶血性弧菌在六种食品中致病力的差异及与肠道菌群的关联性研究[D].广东：广东海洋大学，2019.)，在其基础上改进了构建海虾抑菌应用模型，每次实验海虾样品共计50只，对照组为接种副溶血性弧菌10只，加入1×MIC的Cm-CATH2为实验组30只，空白组加入ddH2O 10只。将1×MIC的Cm-CATH2均匀涂抹在海虾表明，接入2×10⁵CFU/mL的副溶血性弧菌悬浮液接种海对虾表面，放置在37℃的恒温培养箱中培养。

接菌后的样品在0h、3h、6h、9h和12h时分别加入90mL的0.01M，pH为7.2-7.4的无菌PBS缓冲溶液，用旋涡震荡仪混匀，再用无菌的PBS缓冲溶液对混匀的样品进行10倍稀释，吸取100μL加入无菌的TSB平板中进行涂布，于37℃恒温培养16h后，进行菌落计数。上述实验做三次，每次三个平行。

表2海虾模型中副溶血性弧菌的菌落数

通过记录和比较对照组和实验组海虾模型中的菌落数，结果表明加入抗菌肽Cm-CATH2的海虾模型中副溶血性弧菌数量明显降低，具有明显的抑菌效果，通过计算，将其应用于海虾保鲜中，3h其抑制率可高达77.88％。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种抗菌肽Cm-CATH2抑制海产品中副溶血性弧菌的应用，其特征在于，抗菌肽Cm-CATH2针对副溶血性弧菌的抑菌应用。

2.根据权利要求1所述抗菌肽Cm-CATH2抑制海产品中副溶血性弧菌的应用，其特征在于，抑菌应用于海产品中所述副溶血性弧菌的抑菌。

3.一种抗菌肽Cm-CATH2抑制海产品中副溶血性弧菌的用途，其特征在于，抗菌肽Cm-CATH2在副溶血性弧菌抑菌过程中的使用。

4.根据权利要求3所述抗菌肽Cm-CATH2抑制海产品中副溶血性弧菌的用途，其特征在于，抗菌肽Cm-CATH2在海产品中针对副溶血性弧菌抑菌过程中的使用。

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