CN112481400A - 一种食品病原菌致泻大肠埃希氏菌快速检测试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术、食品检测领域，具体是一种食品病原菌致泻大肠埃希氏菌快速检测试剂盒及方法。为建立一种高效、快速、准确且经济的检测方法，本发明公开了一种基于PCR‑DGGE检测食品病原菌致泻大肠埃希氏菌的试剂盒，包括引物组、DNA片段，PCR缓冲液，STE缓冲液。检测方法具体是以化学合成的食品病原菌致泻大肠埃希氏菌的DNA片段作为待测样品的标准参考，当样品条带与标准条带处于相同位置时，即可确定样品中含有食品病原菌致泻大肠埃希氏菌，本发明方法结果可靠，并且实验速度快、特异性好，灵敏度高，并且可以同时分析多个样品。在实验耗材上，价格低，同时实验技术易普及，操作简单。与一般检测方法相比，为一种高效快速经济便捷的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术、食品检测领域，涉及食品病原菌检测相关的凝胶电泳(DGGE)技术，具体是一种食品病原菌致泻大肠埃希氏菌快速检测试剂盒及方法。
背景技术
致泻性大肠埃希氏菌是引起人体以腹泻症状为主的全球性疾病的常见病原菌，在我国引起感染性腹泻的发病率居所有传染病之首。其抗原结构有3种，即菌体抗原(O抗原)，包膜抗原(K抗原)和鞭毛抗原(H抗原)，O抗原是血清分型的基础，一些特殊的血清型具有病原性，能引起人类腹泻，故称为致泄性大肠杆菌，婴儿腹泻中检出率很高，在成人中亦可成散在或暴发流行。人在感染大肠埃希氏菌后的症状为胃痛、呕吐、腹泻和发热。感染可能是致命性的，尤其是对孩子及老人。
该菌广泛存在于饮用水，受污染牛奶，肉类食品以及水产品中，如何快速的检测食品中的食品病原菌成为了我们目前一个急需解决的问题。但传统的检测技术试验周期比较长、步骤比较繁琐，在突发公共卫生事件中该技术无法做到高通量快速检测，不能起到有效的监测、预防作用。
发明内容
为建立一种实现高效、快速、准确且经济的食品病原菌致泻大肠埃希氏菌的快速检测方法，本发明公开了一种基于PCR-DGGE检测食品病原菌致泻大肠埃希氏菌的试剂盒和检测方法。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
本发明提供一种用于食品病原菌致泻大肠埃希氏菌快速检测的引物组及DNA片段，所述引物组包括SEQ ID NO：1-6所示的引物；所述DNA片段包括SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8所示的片段。
进一步，所述引物组及DNA片段是通过化学合成的核苷酸片段。
本发明还提供一种用于食品病原菌致泻大肠埃希氏菌快速检测的试剂盒，包括上述的引物组和DNA片段，PCR缓冲液，STE缓冲液。
进一步，所述PCR缓冲液包括5μl 10×Easy Taq Buffer，4μl 10mmol/L dNTPs，1μl上游引物，1μl下游引物，1μl Taq酶，1.5μl基因组DNA，36.5μl ddH2O。
进一步，所述STE缓冲液是由0.584g的NaCl、0.12g的Tris和0.37g的EDTA溶解于100ml的双重蒸馏水配制而成的。
本发明还提供一种食品病原菌致泻大肠埃希氏菌快速检测的方法，包括以下步骤：
步骤1，提取样品微生物基因组总DNA；
步骤2，分别以超纯水、化学合成的DNA片段及样品总DNA为模板进行PCR扩增，超纯水扩增产物作为阴性对照，DNA片段扩增产物作为待测样品的标准；样品PCR扩增产物作为DGGE检测的待测样品；
步骤3，对标准和待测样品进行DGGE检测；
步骤4，DGGE检测完毕后，将含有DNA片段及待测样品的凝胶放入2.5×4S RedPlus染液中染色15分钟，拍照进行分析对比，当待测样品条带与标准条带相同并在DGGE凝胶上处于同一水平位置时，说明待测样品为食品病原菌致泻大肠埃希氏菌感染的样品；当待测样品没有条带或条带与标准条带在DGGE凝胶上不处于同一水平位置时，说明测样品没有感染食品病原菌致泻大肠埃希氏菌。
进一步，所述步骤1中样品微生物基因组总DNA提取的步骤如下：
(1)将样品用0.22μm滤膜进行抽滤，将带有微生物的滤膜用STE缓冲液洗涤，再12000rpm离心1min；
(2)沉淀中加入STE缓冲液300μl、溶菌酶30μl，吹洗混匀，在37℃下恒温水浴3.5h；
(3)继续加入SDS35μl、Proteinase K5μl，在55℃下恒温水浴2.5h，完成后取出，冷却至室温，加入NaCl70μl；
(4)加入450μl DNA提取酚试剂，混匀，12000rpm离心10min，取上清液；
(5)加入等体积的体积比为25：24：1的苯酚-氯仿-异戊醇抽提，12000rpm离心10min，取上清液，重复一次；
(6)加入2倍体积的异丙醇使DNA沉淀，静置后弃掉上清液，取沉淀；
(7)用75％乙醇溶液洗涤沉淀，吹洗，静置2分钟后吸出乙醇；
(8)加入40μl ddH2O、2μl RNA酶，在55℃下水浴30min，放入4℃恒温箱内保存过夜，待用。
进一步，所述步骤3中DEGG检测为：选择8％的聚丙烯酰胺凝胶，胶变性范围为40％-60％，梯度混合制胶；电泳液温度上升至55℃时，先220V恒压预电泳5min，用50μL微量进样器快速上样，上样量为30μl；在55℃，85V条件下恒温恒压电泳8h。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
利用DGGE检测食物中的食品病原菌致泻大肠埃希氏菌，结果可靠，当样品条带与标准条带处于同一水平位置时，即可确定为食品病原菌致泻大肠埃希氏菌，并且实验速度快、特异性好，灵敏度高，并且可以同时分析多个样品。在实验耗材上，价格低，同时实验技术易普及，操作简单。与一般检测方法相比，为一种高效快速经济便捷的检测方法。在突发公共卫生事件中可发挥重要的作用。
附图说明
图1为本发明实施例1的检测结果图。
图2为本发明实施例2的检测结果图。
图3为本发明实施例3的检测结果图。
图中M代表化学合成的食品病原菌致泻大肠埃希氏菌DNA标准分子片段。
具体实施方式
下面结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行具体、详细的说明。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
实施例1
1.通过化学合成食品病原菌致泻大肠埃希氏菌快速检测的引物组及DNA片段。
所述引物组包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6所示的引物。其中：
SEQ ID NO：1为：CGAGTGGCGGACGGGTG
SEQ ID NO：2为：CTGCTGCCTCCCGTAGG
SEQ ID NO：3为：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG
SEQ ID NO：4为：ATTACCGCGGCTGCTGG
SEQ ID NO：5为：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCGAGTGGCGGACGGGTG
SEQ ID NO：6所示序列为：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG；
所述DNA片段为食品病原菌致泻大肠埃希氏菌DNA检测片段，包括SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示的片段，其中：
SEQ ID NO：7为：CGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG，
SEQ ID NO：8为：ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT。
2.对化学合成的DNA片段分别利用引物对SEQ ID NO：5/2和SEQ ID NO：6/4进行PCR扩增，扩增产物作为待测样品的标准。
PCR反应体系为：10*EasyTaq Buffer：5μL，dNTPs(2,5mM)：4μL，上游引物(10μmol/L)：1μL，下游引物(10μmol/L)：1μL，EasyTaq DNA Polymerase：1μL，模板DNA(化学合成的DNA片段)：1μL，ddH2O：37μL；
PCR反应程序为：94℃5min；94℃30S，45～50℃30S，72℃30S，30个循环；72℃10min，12℃保存。
3.对作为标准的DNA片段进行DGGE检测及验证：
选择浓度为8％聚丙烯酰胺凝胶，胶变性范围为40％～60％，取40％、60％胶各16ml，分别加入50μL的TEMED及40μL的10％过硫酸铵，梯度混合制胶，凝胶时间至少3h；加样前，将电泳液温度上升至55℃时，后220V预电泳5min，PCR扩增产物上样量为30μL，后于55℃、85V条件下电泳8h；电泳完毕后，将胶放入2.5×4S Red Plus染液中染色15分钟，拍照观察，进行分析，见图1。
实施例2
检测生活饮用水中食品病原菌致泻大肠埃希氏菌的方法，包括以下步骤：
1.提取生活饮用水中微生物基因组总DNA
(1)将生活饮用水用0.22μm滤膜进行抽滤，将带有微生物的滤膜放入EP管中，用STE缓冲液洗涤两次，再在12000rpm下离心1分钟。
(2)加入STE缓冲液300μl、溶菌酶30μl，用移液器吹洗混匀，在37℃下恒温水浴3.5小时。
(3)加入SDS35μl、Proteinase K5μl，在55℃下恒温水浴2.5小时。
(4)完成后取出，冷却至室温，加入NaCl 70μl。
(5)加入450μlDNA提取酚试剂，混匀10分钟，在12000rpm下离心10分钟，取上清液。
(6)加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25：24：1)抽提，在12000rpm下离心10分钟，取上清液。重复一次。
(7)加入2倍体积的异丙醇使DNA沉淀，静置后弃掉上清液，取沉淀。
(8)用75％乙醇溶液洗涤沉淀两次，吹洗，静置2分钟后吸出乙醇。
(9)加入40μl的ddH2O、2μl的RNA酶，在55℃下水浴30分钟。
(10)将(9)所得物质放入4℃恒温箱内保存过夜，用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，检测所提取基因组DNA的大小及完整性，备用。
2.对超纯水，化学合成的DNA片段及生活饮用水微生物总基因组DNA分别进行PCR扩增
2.1 对生活饮用水提取的总基因组待检测片段的一次扩增
以上一步得到的生活饮用水中微生物总基因组DNA为模板，分别用引物对SEQ IDNO：1/2和SEQ ID NO：3/4对细菌16S rRNA的两个不同片段进行PCR扩增。PCR反应体系为50μl反应体系，反应条件参照食物食品病原菌性致泻大肠埃希氏菌16S rRNA基因片段的一次PCR扩增。
2.2 PCR扩增产物的检测和回收
将上述一次扩增得到的PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在紫外灯照射下切取扩增产物检测胶的相应条带，按照胶回收试剂盒对PCR产物进行回收。
2.3 生活饮用水中提取的总基因组待检测片段的二次扩增
以上述胶回收产物为模板，分别用引物对SEQ ID NO：5/2和SEQ ID NO：6/4进行16SrRNA基因两个不同片段的二次扩增，PCR扩增体系及反应条件参照上述一次PCR扩增的条件。同时以超纯水、化学合成的DNA片段作为模板分别进行PCR扩增，分别作为阴性对照和标准。
3.DGGE分析
选择8％聚丙烯酰胺凝胶，胶变性范围为40％-60％，取40％、60％胶各15ml,分别加入50μl的TEMED及40μl的10％APS，梯度混合制胶。灌完后，轻轻插入梳子，室温下凝固3小时。待完全凝固后，拔掉梳子，将整个板子安装在DGGE支架上，将安有板子的DGGE支架放入电泳槽中，待电泳液温度上升至55℃时，先220V恒压预电泳5min，用50μl微量进样器快速上样，上样样品为超纯水、化学合成的DNA片段和生活饮用水的二次PCR扩增产物，上样量为30μl。在55℃，85V条件下恒温恒压电泳8小时。电泳完毕，将胶放入2.5×4S Red Plus染液中染色15分钟，然后用紫色托盘放入紫外分析仪中拍照，。从图2可以看到生活饮用水样品条带的与阳性标准条带不在同一位置，表明生活饮用水样品中不含有食品病原菌致泻大肠埃希氏菌。
实施例3
检测受污染牛奶中食品病原菌致泻大肠埃希氏菌的方法，包括以下步骤：
1.提取受污染牛奶中微生物基因组总DNA
1.1 DNA提取
(1)将污染牛奶用0.22μm滤膜进行抽滤，将带有微生物的滤膜放入EP管中，用STE缓冲液洗涤两次，再在12000rpm下离心1分钟。
(2)加入STE缓冲液300μl、溶菌酶30μl，用移液器吹洗混匀，在37℃下恒温水浴3.5小时。
(3)加入SDS35μl、Proteinase K5μl，在55℃下恒温水浴2.5小时。
(4)完成后取出，冷却至室温，加入NaCl 70μl。
(5)加入450μlDNA提取酚试剂，混匀10分钟，在12000rpm下离心10分钟，取上清液。
(6)加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(体积比25：24：1)抽提，在12000rpm下离心10分钟，取上清液。重复一次。
(7)加入2倍体积的异丙醇使DNA沉淀，静置后弃掉上清液，取沉淀。
(8)用75％乙醇溶液洗涤沉淀两次，吹洗，静置2分钟后吸出乙醇。
(9)加入40μl的ddH2O、2μl的RNA酶，在55℃下水浴30分钟。
(10)将(9)所得物质放入4℃恒温箱内保存过夜，用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，检测所提取基因组DNA的大小及完整性，备用。
2.对超纯水，化学合成DNA片段及污染牛奶微生物总基因组DNA分别进行PCR扩增
2.1 对污染牛奶提取的总基因组待检测片段的一次扩增
以上一步得到的污染牛奶中微生物总基因组DNA为模板，分别用引物对SEQ IDNO：1/2和SEQ ID NO：3/4对细菌16S rRNA的两个不同片段进行PCR扩增。PCR反应体系为50μl反应体系，反应条件参照食物食品病原菌性致泻大肠埃希氏菌16S rRNA基因片段的一次PCR扩增。
2.2 PCR扩增产物的检测和回收
将上述一次扩增得到的PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在紫外灯照射下切取扩增产物检测胶的相应条带，按照胶回收试剂盒对PCR产物进行回收。
2.3 污染牛奶中提取的总基因组待检测片段的二次扩增
以上述胶回收产物为模板，分别用引物对SEQ ID NO：5/2和SEQ ID NO：6/4进行16SrRNA基因两个不同片段的二次扩增，PCR扩增体系及反应条件参照上述一次PCR扩增的条件。同时以超纯水、化学合成的DNA片段作为模板分别进行PCR扩增，分别作为阴性对照和标准。
3.DGGE分析
选择8％聚丙烯酰胺凝胶，胶变性范围为40％-60％，取40％、60％胶各15ml,分别加入50μl的TEMED及40μl的10％APS，梯度混合制胶。灌完后，轻轻插入梳子，室温下凝固3小时。待完全凝固后，拔掉梳子，将整个板子安装在DGGE支架上，将安有板子的DGGE支架放入电泳槽中，待电泳液温度上升至55℃时，先220V恒压预电泳5min，用50μl微量进样器快速上样，上样样品为超纯水、化学合成的DNA片段和污染牛奶的二次PCR扩增产物，上样量为30μl。在55℃，85V条件下恒温恒压电泳8小时。电泳完毕，将胶放入2.5×4S Red Plus染液中染色15分钟，然后用紫色托盘放入紫外分析仪中拍照。从图3可以看到污染牛奶样品条带的与标准条带相同且在同一位置，表明污染牛奶样品中含有食品病原菌致泻大肠埃希氏菌。
序列表
<110> 山西大学
<120> 一种食品病原菌致泻大肠埃希氏菌快速检测试剂盒及方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgagtggcgg acgggtg 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgctgcctc ccgtagg 17
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actcctacgg gaggcagcag 20
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
attaccgcgg ctgctgg 17
<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg cgagtggcgg acgggtg 57
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg actcctacgg gaggcagcag 60
<210> 7
<211> 259
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgagtggcgg acgggtgagt aatgtctggg aaactgcctg atggaggggg ataactactg 60
gaaacggtag ctaataccgc ataacgtcgc aagaccaaag agggggacct tcgggcctct 120
tgccatcgga tgtgcccaga tgggattagc ttgttggtgg ggtaacggct caccaaggcg 180
acgatcccta gctggtctga gaggatgacc agccacactg gaactgagac acggtccaga 240
ctcctacggg aggcagcag 259
<210> 8
<211> 197
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca 60
tgccgcgtgt atgaagaagg ccttcgggtt gtaaagtact ttcagcgggg aggaagggag 120
taaagttaat acctttgctc attgacgtta cccgcagaag aagcaccggc taactccgtg 180
ccagcagccg cggtaat 197
Claims (8)
1.一种用于食品病原菌致泻大肠埃希氏菌快速检测的引物组及DNA片段，其特征在于，所述引物组包括SEQ ID NO：1-6所示的引物；所述DNA片段包括SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示的片段。
2.根据权利要求1所述的一种用于食品病原菌致泻大肠埃希氏菌快速检测的引物组及DNA片段，其特征在于：所述引物组及DNA片段是通过化学合成的核苷酸片段。
3.一种权利要求1所述的用于食品病原菌致泻大肠埃希氏菌快速检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组和DNA片段，PCR缓冲液，STE缓冲液。
4.根据权利要求3所述的一种用于食品病原菌致泻大肠埃希氏菌快速检测的试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液包括5μl 10×Easy Taq Buffer，4μl 10mmol/L dNTPs，1μl上游引物，1μl下游引物，1μl Taq酶，1.5μl基因组DNA，36.5μl ddH2O。
5.根据权利要求3所述的一种用于食品病原菌致泻大肠埃希氏菌快速检测的试剂盒，其特征在于：所述STE缓冲液是由0.584g的NaCl、0.12g的Tris和0.37g的EDTA溶解于100ml的双重蒸馏水配制而成的。
6.一种权利要求1-5任一项所述的食品病原菌致泻大肠埃希氏菌快速检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，提取样品微生物基因组总DNA；
步骤2，分别以超纯水、化学合成的DNA片段及样品总DNA为模板进行PCR扩增，超纯水扩增产物作为阴性对照，DNA片段扩增产物作为待测样品的标准；样品PCR扩增产物作为DGGE检测的待测样品；
步骤3，对标准和待测样品进行DGGE检测；
步骤4，DGGE检测完毕后，将含有DNA片段及待测样品的凝胶放入2.5×4S Red Plus染液中染色15分钟，拍照进行分析对比，当待测样品条带与标准条带相同并在DGGE凝胶上处于同一水平位置时，说明待测样品为食品病原菌致泻大肠埃希氏菌感染的样品；当待测样品没有条带或条带与标准条带在DGGE凝胶上不处于同一水平位置时，说明测样品没有感染食品病原菌致泻大肠埃希氏菌。
7.根据权利要求6所述的一种食品病原菌致泻大肠埃希氏菌的快速检测的方法，其特征在于，所述步骤1中样品微生物基因组总DNA提取的步骤如下：
(1)将样品用0.22μm滤膜进行抽滤，将带有微生物的滤膜用STE缓冲液洗涤，再12000rpm离心1min；
(2)沉淀中加入STE缓冲液300μl、溶菌酶30μl，吹洗混匀，在37℃下恒温水浴3.5h；
(3)继续加入SDS35μl、Proteinase K5μl，在55℃下恒温水浴2.5h，完成后取出，冷却至室温，加入NaCl70μl；
(4)加入450μl DNA提取酚试剂，混匀，12000rpm离心10min，取上清液；
(5)加入等体积的体积比为25：24：1的苯酚-氯仿-异戊醇抽提，12000rpm离心10min，取上清液，重复一次；
(6)加入2倍体积的异丙醇使DNA沉淀，静置后弃掉上清液，取沉淀；
(7)用75％乙醇溶液洗涤沉淀，吹洗，静置2分钟后吸出乙醇；
(8)加入40μl ddH2O、2μl RNA酶，在55℃下水浴30min，放入4℃恒温箱内保存过夜，待用。
8.根据权利要求6所述的一种用于食品病原菌致泻大肠埃希氏菌的快速检测的方法，其特征在于，所述步骤3中DEGG检测为：选择8％的聚丙烯酰胺凝胶，胶变性范围为40％-60％，梯度混合制胶；电泳液温度上升至55℃时，先220V恒压预电泳5min，用50μL微量进样器快速上样，上样量为30μl；在55℃，85V条件下恒温恒压电泳8h。
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