CN106987655A - 一种诺如病毒溯源方法及其引物、试剂盒、应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种诺如病毒溯源方法及其引物、试剂盒、应用，包括如下步骤：(1)富集诺如病毒并提取所述诺如病毒的基因组RNA，反转录为cDNA,备用；(2)取步骤(1)获得的基因组cDNA为模板，设计如下引物，对所述基因组DNA进行PCR扩增；(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳处理，分析所得的凝胶图谱，然后回收凝胶条带，以所述条带的回收产物为模板，设计以下引物，进行PCR扩增；(4)将步骤(3)获得的PCR扩增产物切胶回收、纯化，将PCR产物进行克隆测序，然后登陆Genbank进行测序比对，得到所述诺如病毒的基因类型。所述的方法测定结果准确、稳定可靠，灵敏度高以及检测费用低。

Description

一种诺如病毒溯源方法及其引物、试剂盒、应用

技术领域

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种基于PCR-DGGE的诺如病毒 溯源方法及其引物、试剂盒、应用。

背景技术

食品的质量安全已经成为事关人民切身利益、社会稳定和扩大食品出 口创汇的重要指标，而由食源性病毒所引起的食源性疾病是影响食品安全 的主要因素之一。食源性病毒造成的食品质量问题和生产性萎缩引起经济 损失的同时，也制约了我国食品出口贸易的发展。1996年英国疯牛病引 发的恐慌促进了研究可追溯系统方向，丹麦的猪肉沙门氏菌污染事件和苏 格兰大肠杆菌事件令欧盟消费者对政府食品安全监管缺乏信息，这些都促 进了可追溯系统的建立。因此，借鉴现代科学技术研究成果，研究食品中 食源性病毒的溯源管理体制为消费者提供信息是发展的需求。

诺如病毒是引起人类病毒性肠胃炎暴发的重要病原。诺如病毒无论在 散发病例中还是暴发疫情中都占有重要地位，从国内外近年对食品诺如病 毒的检出情况看，食源性病毒对食品安全的威胁较严重。

目前，由于分子生物学技术的发展，对食源性病毒的检测方法不断改 进，检测技术日趋完善，而对食品中食源性病毒污染来源分析做的却不多。 通过污染物之间的亲缘关系可以判断污染来源，目前用于微生物溯源的分 型方法包括表型分型和基因分型。如血清型、碳源利用及抗生素抗性等， 均可以进行表型分型；利用现代分子生物学方法，如脉冲场凝胶电泳、限 制性片段多态性、重复序列分型等方法进行基因分型。然而，这些都需要 分离培养的方法来进行分型。由于食源性病毒很难分离培养，且很多容易 发生变异，需要直接利用分子生物学方法进行分型鉴定。

变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE) 技术主要利用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶电泳对DNA进行电泳， 其主要是由于聚丙烯酰胺凝胶具有将PCR扩增产物区分。DGGE技术的分辨 率高于琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测的基因序列可以达到 一个碱基的差异。该检测手段灵敏快捷，避免了传统方法的菌种分离，现 已逐步应用于食品微生物研究、食源性致病微生物的快速检测和分型。DGGE 技术可以鉴定出无法利用传统方法分离出来的菌株。因此，采用DGGE进行 基因分型的方法更快速、成本更低，且稳定、准确，可用于食品中致病菌 的快速分型。PCR-DGGE技术的应用越来越广泛，与其他分型方法相比较， PCR-DGGE可以不依赖培养而直接检测和鉴定食品中微生物，可以进行食源 性致病菌快速检测和分型。然而目前，PCR-DGGE技术应用于诺如病毒的溯 源的研究并未见报道。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种基于PCR-DGGE的诺如病 毒溯源方法及其引物、试剂盒和应用。

为此，本发明提供了一种基于PCR-DGGE的诺如病毒溯源方法，包括如 下步骤：

(1)富集诺如病毒并提取所述诺如病毒的基因组RNA，以获得所述基 因组RNA为mRNA进行反转录得到cDNA，备用；

(2)取步骤(1)获得的基因组cDNA为模板，以如下引物，对所述基 因组DNA进行PCR扩增；

上游引物F：5‘-ATGTTCMGMTGGATGMGATTC-3’；

下游引物GC-R：5‘-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGGCGGGGCGGGGGCGCGGGGG

GTMGACGCCATCWTCATTYAC-3’；

(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳处理， 分析所得的凝胶图谱，然后回收凝胶条带，以所述条带的回收产物为模板， 以如下引物，进行PCR扩增；

上游引物F：5‘-ATGTTCMGMTGGATGMGATTC-3’；

下游引物R：5‘-TMGACGCCATCWTCATTYAC-3’；

(4)将步骤(3)获得的PCR扩增产物进行电泳，然后切胶回收、纯 化，将所得PCR扩增产物进行克隆测序，然后登陆Genbank进行测序比对， 得到所述诺如病毒的基因类型。

所述的方法，所述步骤(2)和步骤(3)中的PCR扩增反应体系相同， 包括：

模板，50ng，1.0μL；上游引物，20μM,0.3μL；下游引物，20μM,0.3μL； dNTP，2.5mM，0.8μL；rTaq，5U/μL，0.4μL；10×PCR buffer，4μL； 补ddH₂O至40μL。

所述的方法，所述步骤(2)和步骤(3)中的所述PCR扩增程序相同， 所述PCR扩增程序如下：94℃预变性3min，94℃变性45s，52℃复性45s， 72℃延伸1min，进行35个循环；最终72℃延伸10min，最终降至4℃， 获得的扩增产物4℃或-20℃保存，备用。

所述的方法，所述步骤(3)中，所述变性梯度凝胶为变性梯度范围为 20-70％、丙烯酰胺浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度递增的方向与电 泳方向一致；其中，所述聚丙烯酰胺凝胶含有7mol/L尿素和体积比为40％ 的丙烯酰胺为100％变性剂，不含有尿素和丙烯酰胺为0％变性剂。

所述的方法，所述步骤(3)中，将所述聚丙烯酰胺凝胶在1×TAE缓 冲液中，取步骤(2)中获得的PCR扩增产物10μL加入上样孔中，于电压 为180V，温度为60℃下电泳5小时。

所述的方法，在所述步骤(1)中，所述反转录步骤如下：分别取1μg 的RNA、2μL的Oligo dT以及2μL的2.5mM的dNTP混合，然后加入 RNase-free ddH₂O补齐至14.5μL，然后于70℃水浴5min，随后冰浴2min； 然后向上述混合物中加入4μL的5×M-MLV Buffer、0.5μL的40U/μL的 RNasin以及1μL的200U/μL的M-MLV，然后于42℃孵育50min，于72℃ 加热5min后终止反应，获得cDNA。

所述的方法，在所述步骤(1)中，富集诺如病毒的方法包括如下步骤：

取25g样品放至离心管中，加入40mL TGBE缓冲液，在室温下孵育20min， 60rpm恒定摇晃，按照10000×g离心30min，在4℃下离心澄清，取获得的 上清液转入另一个离心管中，并用1mol/L盐酸溶液将pH调节至7.0，然后 向所述离心管中加入5×PEG和NaCl溶液至所述离心管中PEG最终浓度为 10％PEG，NaCl最终浓度为0.3M NaCl，振荡60s，混匀之后在5℃下以60rpm 孵育60min或者过夜，然后在5℃下按照10000×g离心30min，弃去上清 液，然后在5℃下按照10000×g离心5min，以压实沉淀物，弃上清，加入 500μL PBS重悬沉淀，再加入500μL的氯仿-正丁醇，涡旋混合，然后在 室温下孵育5min，随后于5℃下按照10000×g离心15min，取上层水相转 移到一个新的离心管中，即得病毒富集液。

本发明提供了一种用于诺如病毒溯源的引物，所述引物包括：

上游引物F：5‘-ATGTTCMGMTGGATGMGATTC-3’；

下游引物R：5‘-TMGACGCCATCWTCATTYAC-3’；

下游引物GC-R：5‘-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGGCGGGGCGGGGGCGCGGGGG

GTMGACGCCATCWTCATTYAC-3’。

本发明提供了一种用于诺如病毒溯源的试剂盒，包括上述的引物，每 支所述试剂盒的配方为：

上游引物F，20μM,0.6μL；下游引物R，20μM,0.3μL；下游引物GC-R， 20μM,0.3μL；dNTP，2.5mM，1.6μL；rTaq，5U/μL，0.8μL；10×PCR buffer， 8μL；ddH₂O，80μL。

本发明提供了一种由上述的方法或上述的试剂盒在检测诺如病毒领域 的应用。

本发明技术方案，具有如下优点：

(1)本发明所述的基于PCR-DGGE的诺如病毒溯源方法，包括如下步 骤：(1)富集诺如病毒并提取所述诺如病毒的基因组RNA，反转录cDNA 备用；(2)取步骤(1)获得的基因组cDNA为模板，设计引物，对所述基 因组DNA进行PCR扩增；(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物进行变性梯度 凝胶电泳处理，分析所得的凝胶图谱，然后回收凝胶条带，以所述条带的 回收产物为模板，设计引物，进行PCR扩增；(4)将步骤(3)获得的PCR 扩增产物切胶回收、纯化，将所得PCR扩增产物进行克隆测序，然后登陆 Genbank进行测序比对，得到所述诺如病毒的基因类型；通过对大量诺如病 毒的引物进行筛选研究，设计引物对提取的诺如病毒的DNA进行PCR扩增， 同时结合DGGE方法能分离出不同基因型诺如病毒的PCR扩增片段，再以获得的PCR扩增片段设计引物再次进行PCR扩增，将再次获得的PCR扩增 产物进行克隆测序，登陆Genbank进行测序比对，得到所述诺如病毒的基因 类型，该检测方法方便、快捷，操作步骤简单，不依赖培养而直接检测和 鉴定食品中微生物，能够在短时间内对诺如病毒快速检测和分型，测定结 果准确、稳定可靠，灵敏度高，检测费用低。

(2)本发明所述的用于诺如病毒溯源的试剂盒，所述试剂盒包括上游 引物F、下游引物R以及下游引物GC-R，通过对大量诺如病毒的引物进行筛 选研究，设计出上述引物上游引物F和下游引物GC-R可以对提取的诺如病毒 的基因组DNA进行PCR扩增，保证将不同基因型的诺如病毒进行PCR扩增，设 计的上游引物F和下游引物R可以保证将回收的条带的回收产物进行PCR扩 增，使得对诺如病毒快速检测和分型的测定结果更加准确、稳定可靠，且灵敏度高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下 面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普 通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获 得其他的附图。

图1是本发明一个实施方式中重组质粒的电泳图谱；

图2是本发明一个实施方式中步骤(2)中PCR扩增产物的电泳图谱；

图3是本发明一个实施方式中步骤(3)中DGGE的电泳图谱；

图4是本发明一个实施方式中步骤(4)中所述克隆测序的DGGE的 电泳图谱；

图5是本发明一个实施方式中步骤(1)中去除载体的所述全基因合成 序列使用MEGA软件进行比对结果图；

图6是本发明一个实施方式中步骤(4)中所述测序序列与所述全基因 合成序列比对结果图；

图7为图6的局部放大图。

具体实施方式

本发明所使用的主要试剂如下：

所使用的上游引物F、下游引物R以及下游引物GC-R的生产厂家为 上海生工；rTaq、dNTP和10×PCR buffer生产厂家为Takara(宝生物(工 程)大连有限公司)；oligo dT(上海浩然生物技术有限公司)、RNase-free ddH₂O(北京美亿美生物技术有限公司)、5×M-MLV Buffer、Rnasin和M-MLV 的生产厂家为(Takara(宝生物(工程)大连有限公司)；pMD18-T载体的 生产厂家为Takara(宝生物(工程)大连有限公司)；DH5α感受态细胞生 产厂家为天根生化科技(北京)有限公司；

本发明所使用的主要设备如下：

PCR仪为Biometra公司生产的T-gradient；离心机生产厂家为 eppendorf、型号为Centrifuge 5415D；电泳仪生产厂家为为北京君意东方 电泳设备有限公司、型号为_JY-SPFT；恒温槽生产厂家为宁波新芝生物科 技股份有限公司、型号为SDC-6；凝胶成像仪为Bio-Rad公司的Gel-Doc2000 凝胶成像系统。

具体实施方式

本实施例提供了一种用于诺如病毒溯源的引物，所述引物包括：

上游引物F：5‘-ATGTTCMGMTGGATGMGATTC-3’；

下游引物R：5‘-TMGACGCCATCWTCATTYAC-3’；

下游引物GC-R：5‘-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGGCGGGGCGGGGGCGCGGGGG

GTMGACGCCATCWTCATTYAC-3’。

本实施例还提供了一种用于诺如病毒溯源方法的试剂盒，所述试剂盒 包括上述的引物，每支所述试剂盒的配方为：

上游引物F，20μM,0.6μL；下游引物R，20μM,0.3μL；下游引物GC-R， 20μM,0.3μL；dNTP，2.5mM，1.6μL；rTaq，5U/μL，0.8μL；10×PCR buffer， 8μL；ddH₂O，80μL。

本实施例还提供了一种利用上述试剂盒的基于PCR-DGGE的诺如病毒 溯源方法，包括如下步骤：

(1)富集诺如病毒并提取所述诺如病毒的DNA，其中富集诺如病毒 的方法包括如下步骤：

取25g样品(牡蛎肉，已知牡蛎肉中含有GI型和GII型诺如病毒)放 至离心管中，加入40mL的TGBE缓冲液，在室温下孵育20min，60rpm恒定 摇晃，按照10000×g离心30min，在4℃下离心澄清，取获得的上清液转 入另一个离心管中，并用1mol/L盐酸溶液将pH调节至7.0，然后向所述离 心管中加入5×PEG和NaCl溶液至所述离心管中PEG最终浓度为10％PEG， NaCl最终浓度为0.3M NaCl，振荡60s，混匀之后在5℃下以60rpm孵育 60min或者过夜，然后在5℃下按照10000×g离心30min，弃去上清液，然 后在5℃下按照10000×g离心5min，以压实沉淀物，弃上清，加入500μL PBS重悬沉淀，再加入500μL的氯仿-正丁醇，涡旋混合，然后在室温下孵 育5min，随后于5℃下按照10000×g离心15min，取上层水相转移到一个 新的离心管中，即得病毒富集液；

自富集的病毒富集液中提取所述诺如病毒的RNA，采用RNA纯化试剂 盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取，包括如下步骤：

1)取200μL上述富集的RNA样品液、阴性对照和阳性对照分别加入 不同的1.5ml灭菌eppendorf管；

2)向上述的eppendorf管中加入600μL异硫氰酸胍，然后加入对照 和样品，再加200μL氯仿，颠倒混匀；

3)将步骤2)中的eppendorf管按照13000rpm离心15min；

4)在步骤3)中离心快结束时，另取相同的空的eppendorf管，加入 400μL于-20℃预冷的异丙醇；

5)将步骤3)中离心获得的上清转移到步骤4)中的准备的eppendorf 管中，颠倒混匀；

6)将步骤5)中的eppendorf管按照13000rpm离心15min，轻轻倒去 上清，在吸水纸上尽量沾干液体；

7)向步骤6)中的eppendorf管中加600μL的75％乙醇，颠倒数次 以洗涤残存异丙醇；

8)将步骤7)中的eppendorf管按照13000rpm离心15min，轻轻倒去 上清，在吸水纸上尽量沾干液体；

9)将步骤8)中的eppendorf管按照4000rpm离心10sec(秒)，将 管壁残存液体甩到底部，用微量枪头吸干，室温干燥2－3min(不可过分干 燥，防止下一步RNA不溶解)；

10)向步骤9)中的eppendorf管加入20μL的DEPE水(加入depc的 纯水高压后的水即为DEPE水)，轻轻混匀溶解RNA，于2000rpm离心5sec (秒)，冰上保存备用(最好2小时内使用，以免RNA降解)；

将上述获得的所述基因组RNA为mRNA进行反转录得到cDNA，按照 下表1的mRNA反转录体系进行反转录，所述反转录步骤包括如下：分别 取1μg的RNA、2μL的Oligo dT以及2μL的2.5mM的dNTP混合，然后 加入RNase-free ddH₂O补齐至14.5μL，然后于70℃水浴5min，随后冰浴 2min；然后向上述混合物中加入4μL的5×M-MLV Buffer、0.5μL的40U/μL 的RNasin以及1μL的200U/μL的M-MLV，然后于42℃孵育50min，于72℃ 加热5min后终止反应，获得cDNA。

表1 mRNA反转录体系

将上述制备得到的cDNA通过全基因合成技术得到6个基因的重组质粒 (由北京美亿美生物技术有限公司合成并提供)，所述全基因合成的重组 质粒编号分别为G16E1703、G16E1704、G16E1705、G16E1706、G16E1707和 G16E1708，所述重组质粒采用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图谱参见图 1，然后采用OMEGA公司的DNA Gel Extraction Kit纯化回收所述全基因 合成的重组质粒(全基因合成序列)，将所述重组质粒的载体去除，将去 除载体的全基因合成序列使用MEGA软件进行比对，比对结果见图5(其 中1703、1704、1705、1706、1707、1708分别对应于G16E1703、G16E1704、 G16E1705、G16E1706、G16E1707和G16E1708)，由图5可知，GI型(1703) 病毒和GII型(1704-1708)病毒基因序列之间存在较大差异，同时，GII 型(1704-1708)病毒不同基因之间序列比对也存在个别碱基差异，然后进行原始基因编号(即所述原始基因编号是跑胶分离后进行的编号)、全基 因合成编号，见下表2。所述全基因合成G16E1703、G16E1704、G16E1705、 G16E1706、G16E1707、G16E1708的引物，参见序列表中的SEQ.ID NO：1-24。 样本G16E1703、G16E1704、G16E1705、G16E1706、G16E1707、G16E1708的 全基因合成序列的测序结果，参见序列表中的SEQ.ID NO：25-36(测序结 果由北京美亿美生物技术有限公司提供)。

表2原始基因编号、样本编号以及切胶测序

(2)分别取步骤(1)电泳获得的全基因合成样本G16E1703、G16E1704、 G16E1705、G16E1706、G16E1707和G16E1708作为的DNA模板，以如下引物， 参见序列表中的SEQ.ID NO：37-38，对所述DNA模板进行PCR扩增；

上游引物F：5‘-ATGTTCMGMTGGATGMGATTC-3’；

下游引物GC-R：5‘-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGGCGGGGCGGGGGCGCGGGGG

GTMGACGCCATCWTCATTYAC-3’；

所述PCR扩增反应体系包括：

模板，50ng，1.0μL；上游引物，20μM,0.3μL；下游引物，20μM,0.3μL； dNTP，2.5mM，0.8μL；rTaq，5U/μL，0.4μL；10×PCR buffer，4μL； 补ddH₂O至40μL；

所述PCR扩增程序如下：94℃预变性3min，94℃变性45s，52℃复性 45s，72℃延伸1min，进行35个循环；最终72℃延伸10min，最终降至 4℃，获得的扩增产物4℃或-20℃保存，备用；

(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物采用2％的琼脂糖凝胶电泳检测， 电泳图谱参见图2，然后采用OMEGA公司的DNA Gel Extraction Kit纯化 回收所述PCR扩增产物，然后将纯化后的PCR扩增产物进行变性梯度凝胶 电泳处理，凝胶成像仪采用Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝胶成像系统， 电泳条件为电压180V，60℃下电泳15小时，上样量为10μL，所述变性梯 度凝胶为变性梯度范围为20-70％、丙烯酰胺浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶， 变性梯度递增的方向与电泳方向一致，所述聚丙烯酰胺凝胶含有7mol/L尿 素和体积比为40％的丙烯酰胺为100％变性剂，不含有尿素和丙烯酰胺为0％ 变性剂，将所述聚丙烯酰胺凝胶置于1×TAE缓冲液中，取步骤(2)中获 得的PCR扩增产物10μL加入上样孔中，于180V、60℃下电泳5小时； 凝胶电泳(DGGE)完毕后，采用银染法对上述凝胶进行染色，步骤如下：

a)取固定液(所述固定液为将乙醇50mL和冰醋酸2.5mL混合后定容至 500mL)将所述凝胶固定15min；

b)取Milli-Q纯水对步骤a)中的凝胶分别清洗20s和2min各一次；

c)采用银染液(所述银染液为硝酸银1g和37％甲醛0.75mL混合后定 容至500mL)染色15min；

d)采用Milli-Q纯水对步骤c)中银染后的凝胶分别清洗20s和2min各 一次；

e)取显色液(所述显色液为氢氧化钠7.5g和37％甲醛2.5mL混合后 定容至500mL)对步骤d)中获得的凝胶显色5-7min，最后用终止液 (所述终止液为乙醇50mL和冰醋酸2.5mL混合后定容至500mL) 终止反应，即完成所述凝胶的银染。

将上述步骤获得的凝胶在上述的Gel-Doc2000凝胶成像系统中拍照， 然后分析所得的凝胶图谱如图3所示，回收凝胶条带，用灭菌的手术刀切 下待回收DGGE条带，采用OMEGA公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收 目的条带，分别得到六个样本的回收产物，分别以2μL的上述回收产物作 为PCR模板，以上游引物F：5‘-ATGTTCMGMTGGATGMGATTC-3’；下游引物 R：5‘-TMGACGCCATCWTCATTYAC-3’(参见序列表中的SEQ.ID NO：37、SEQ.ID NO：39)，进行PCR扩增，所述PCR扩增反应体系与所述步骤(2)相同， 包括：

模板，50ng，1.0μL；上游引物，20μM,0.3μL；下游引物，20μM,0.3μL； dNTP，2.5mM，0.8μL；rTaq，5U/μL，0.4μL；10×PCR buffer，4μL； 补ddH₂O至40μL；

所述PCR扩增程序与所述步骤(2)相同，所述PCR扩增程序如下：94℃ 预变性3min，94℃变性45s，52℃复性45s，72℃延伸1min，进行35个 循环；最终72℃延伸10min，最终降至4℃，获得的扩增产物4℃或-20℃ 保存，备用；

(4)将步骤(3)获得的PCR扩增产物切胶回收、纯化，采用2％的琼 脂糖凝胶电泳检测，然后采用OMEGA公司的DNA Gel Extraction Kit纯化 回收所述PCR扩增产物，然后将所述PCR扩增产物连接到pMD18-T载体上， 然后转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，由北京美亿美生物技术 有限公司进行测序，所述阳性克隆按照步骤(3)中进行DGGE电泳，所得 电泳图谱见图4，各样本的切胶测序编号见表2，测序结果参见序列表中的 SEQ.ID NO：40-SEQ.ID NO：55(由北京美亿美生物技术有限公司提供)， 测序结果去除载体序列参见序列表中的SEQ.ID NO：56-SEQ.ID NO：71(由 北京美亿美生物技术有限公司提供)，将所述去载体的测序序列，登陆 Genbank进行测序比对，得到所述诺如病毒的基因类型。所述比对结果见下 表3，

表3比对结果

本实施例还包括通过所述测序序列去载体(北京美亿美生物技术有限 公司提供)后与所述合成基因序列使用MEGA软件进行比对进行验证，比 对结果见图6-7所示，其中编号3-1-3、3-1-4对应图4中的切胶测序编号 3，编号4-1-3、4-1-4对应图4中的切胶测序编号4-1，编号5-2-4、5-2-5 对应图4中的切胶测序编号5-2，编号9-2-6、9-2-7对应图4中的切胶测 序编号9-2，编号5-3-2、5-3-5对应图4中的切胶测序编号5-3，编号6-2、 6-4对应图4中的切胶测序编号6，编号8-1、8-4对应图4中的切胶测序 编号8，编号10-9、10-10对应图4中的切胶测序编号10，由图可知，克 隆测序结果与全基因合成序列有个别的碱基差异，因此，可以认为通过本 发明的方法得到的克隆测序基因序列与全基因合成序列结果基本吻合，进 一步验证说明采用本发明的方法的克隆测序结果与全基因合成序列结果一 致。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方 式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予 以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保 护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 一种诺如病毒溯源方法及其引物、试剂盒、应用

<130> HA201501319

<160> 71

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1703引物1）

<400> 1

ttgagctcta tataccgggt tggcaggcca tgttccgctg gatgcgat 48

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1703引物2）

<400> 2

atctcctgtc cacatactca agtcatggaa tcgcatccag cggaacat 48

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1703引物-3)

<400> 3

gagtatgtgg acaggagatc gcaatctctt gcccgattat gtaaatgatg 50

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1703引物-4）

<400> 4

tttgaggggg cgtccttaga cgccatcatc atttacataa tcgggc 46

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1704引物-1）

<400> 5

tggattttta cgtgcctaga caagaaccaa tgttcagatg gatgagattc 50

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1704引物-2）

<400> 6

atcgccctcc cacgtgctca gatctgagaa tctcatccat ctgaacat 48

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1704引物-3）

<400> 7

gagcacgtgg gagggcgatc gcaatctggc tcccagtttt gtgaatgaag 50

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1704引物-4）

<400> 8

gatgggttgg cgtcactcga cgccatcttc attcacaaaa ctggga 46

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1705引物-1）

<400> 9

tggattttta cgtgcccagg caagagccaa tgttcagatg gatgagattc 50

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1705引物-2）

<400> 10

atcgccctcc cacgtgctca gatctgagaa tctcatccat ctgaacat 48

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1705引物-3）

<400> 11

gagcacgtgg gagggcgatc gcaatctggc tcccagtttt gtgaatgaag 50

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1705引物-4）

<400> 12

gatgggttgg cgtcattcga cgccatcttc attcacaaaa ctggga 46

<210> 13

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1706引物-1）

<400> 13

tggattttta cgtgcccaga caagagccaa tgttcagatg gatgagattc 50

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1706引物-2）

<400> 14

atcgccctcc cacgtgctca gatctgagaa tctcatccat ctgaacat 48

<210> 15

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1706引物-3）

<400> 15

gagcacgtgg gagggcgatc gcaatctggc tcccagtttt gtgaatgaag 50

<210> 16

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1706引物-4）

<400> 16

gatgggttgg cgtcactcga cgccatcttc attcacaaaa ctggga 46

<210> 17

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1707引物-1）

<400> 17

tggattttta cgtacccaga caagagccaa tgttcagatg gatgagattc 50

<210> 18

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1707引物-2）

<400> 18

atcgccctcc cacgtgctca gatctgagaa tctcatccat ctgaacat 48

<210> 19

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1707引物-3）

<400> 19

gagcacgtgg gagggcgatc gcaatctggc tcccagtttt gtgaatgaag 50

<210> 20

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1707引物-4）

<400> 20

gatgggttgg cgtcactcga cgccatcttc attcacaaaa ctggga 46

<210> 21

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1708引物-1）

<400> 21

tggattttta cgtgcccagg caggagccaa tgttcagatg gatgagattc 50

<210> 22

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1708引物-2）

<400> 22

atcgccctcc cacgtgctca gatccgagaa tctcatccat ctgaacat 48

<210> 23

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1708引物-3）

<400> 23

gagcacgtgg gagggcgatc gcaatctggc tcccagtttt gtgaatgaag 50

<210> 24

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列（G16E1708引物-4）

<400> 24

gatgggttgg cgtcattcga cgccatcttc attcacaaaa ctggga 46

<210> 25

<211> 1242

<212> DNA

<213> 质粒载体序列（G16E1703）

<400> 25

taggctttgt cctgatgctt gttatcgtat tcgcgtgtcg cccttttgag ctctatatac 60

cgggttggca ggccatgttc cgctggatgc gattccatga cttgagtatg tggacaggag 120

atcgcaatct cttgcccgat tatgtaaatg atgatggcgt ctaaggacgc cccctcaaaa 180

agggcgacac gcgaagtcga tgtcgcgtct gcctgaagtc aatactgacg atggtcatag 240

ctgtttcctg tccatagcag aaagtcaaaa gcctccgacc ggaggctttc gacttgatcg 300

gcacgtaaga ggttccaact ttcaccataa tgaaataaga tcactaccgg gcgtattttt 360

tgagttatcg agattttcag gagctaagga agctaaaatg agtattcaac atttccgtgt 420

cgcacttatt ccgttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct 480

ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga 540

tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag 600

cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca 660

actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga 720

aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag 780

tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc 840

ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa 900

tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt 960

gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg 1020

gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg ggccttccgg ctggctgggt 1080

tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg 1140

gccaaatggt aagccctccc gtatcggaat tatctacacg acggggagtc aggaactatg 1200

gatgaacgaa ttaaaccgat cgctgaaata ggtgctcact gg 1242

<210> 26

<211> 134

<212> DNA

<213> 质粒去载体序列（G16E1703）

<400> 26

ttgagctcta tataccgggt tggcaggcca tgttccgctg gatgcgattc catgacttga 60

gtatgtggac aggagatcgc aatctcttgc ccgattatgt aaatgatgat ggcgtctaag 120

gacgccccct caaa 134

<210> 27

<211> 1302

<212> DNA

<213> 质粒载体序列（G16E1704）

<400> 27

gccagcgtcc tgatgcttgt tatcgtattc gcgtgtcgcc ctttggattt ttacgtgcct 60

agacaagaac caatgttcag atggatgaga ttctcagatc tgagcacgtg ggagggcgat 120

cgcaatctgg ctcccagttt tgtgaatgaa gatggcgtcg agtgacgcca acccatcaag 180

ggcgacacgc gaagtcgatg tcgcgtctgc ctgaagtcaa tactgacgat ggtcatagct 240

gtttcctgtc catagcagaa agtcaaaagc ctccgaccgg aggctttcga cttgatcggc 300

acgtaagagg ttccaacttt caccataatg aaataagatc actaccgggc gtattttttg 360

agttatcgag attttcagga gctaaggaag ctaaaatgag tattcaacat ttccgtgtcg 420

cacttattcc gttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 480

tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 540

tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 600

cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 660

tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 720

agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 780

ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 840

ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 900

aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 960

gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga 1020

tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta 1080

ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc 1140

cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcagctatgg 1200

atgaacgaat aaaccgatcg ctgaaatagg tgctcactga ttaagcattg gtaatgaggg 1260

cccaaatgga atcacctggc tcaccttcgg gtggggcctt tc 1302

<210> 28

<211> 134

<212> DNA

<213> 质粒去载体序列（G16E1704）

<400> 28

tggattttta cgtgcctaga caagaaccaa tgttcagatg gatgagattc tcagatctga 60

gcacgtggga gggcgatcgc aatctggctc ccagttttgt gaatgaagat ggcgtcgagt 120

gacgccaacc catc 134

<210> 29

<211> 1232

<212> DNA

<213> 质粒载体序列（G16E1705）

<400> 29

gactttgctc tgatgcttgt tatcgtattc gcgtgtcgcc ctttggattt ttacgtgccc 60

aggcaagagc caatgttcag atggatgaga ttctcagatc tgagcacgtg ggagggcgat 120

cgcaatctgg ctcccagttt tgtgaatgaa gatggcgtcg aatgacgcca acccatcaag 180

ggcgacacgc gaagtcgatg tcgcgtctgc ctgaagtcaa tactgacgat ggtcatagct 240

gtttcctgtc catagcagaa agtcaaaagc ctccgaccgg aggctttcga cttgatcggc 300

acgtaagagg ttccaacttt caccataatg aaataagatc actaccgggc gtattttttg 360

agttatcgag attttcagga gctaaggaag ctaaaatgag tattcaacat ttccgtgtcg 420

cacttattcc gttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 480

tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 540

tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 600

cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 660

tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 720

agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 780

ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 840

ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 900

aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 960

gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga 1020

tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctgggtta 1080

ttgctgataa atctgggagc cggtgagcgt gggtctcccg gtatcattgc agcactgggg 1140

gccagatggt aagcccttcc cgtatcggag ttatctaccc gaccggggag tcagggaact 1200

atggatgaac caaataaaac agatccctgg aa 1232

<210> 30

<211> 128

<212> DNA

<213> 质粒去载体序列（G16E1705）

<400> 30

tttacgtgcc caggcaagag ccaatgttca gatggatgag attctcagat ctgagcacgt 60

gggagggcga tcgcaatctg gctcccagtt ttgtgaatga agatggcgtc gaatgacgcc 120

aacccatc 128

<210> 31

<211> 1196

<212> DNA

<213> 质粒载体序列（G16E1706）

<400> 31

gaaggcgctc tcctgatgct tgttatcgta ttcgcgtgtc gccctttgga tttttacgtg 60

cccagacaag agccaatgtt cagatggatg agattctcag atctgagcac gtgggagggc 120

gatcgcaatc tggctcccag ttttgtgaat gaagatggcg tcgagtgacg ccaacccatc 180

aagggcgaca cgcgaagtcg atgtcgcgtc tgcctgaagt caatactgac gatggtcata 240

gctgtttcct gtccatagca gaaagtcaaa agcctccgac cggaggcttt cgacttgatc 300

ggcacgtaag aggttccaac tttcaccata atgaaataag atcactaccg ggcgtatttt 360

ttgagttatc gagattttca ggagctaagg aagctaaaat gagtattcaa catttccgtg 420

tcgcacttat tccgtttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 480

tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 540

atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 600

gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc 660

aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 720

aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 780

gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaaa ggagctaacc 840

gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg 900

aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg 960

ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccgcacatt aatagactgg 1020

atgagcggat aagtgcagac acttctgcgc tcggcctcgc tgctgatatg ctgataatct 1080

gaacgtgagc gtggtctcgc gtatcatgca gcactgggca gaatgtagct tcgtatccgt 1140

gttactacga cgatcagcaa cattgatgac gaattgaccg gattcgcgtg gaaatg 1196

<210> 32

<211> 128

<212> DNA

<213> 质粒去载体序列（G16E1706）

<400> 32

tttacgtgcc cagacaagag ccaatgttca gatggatgag attctcagat ctgagcacgt 60

gggagggcga tcgcaatctg gctcccagtt ttgtgaatga agatggcgtc gagtgacgcc 120

aacccatc 128

<210> 33

<211> 1286

<212> DNA

<213> 质粒载体序列（G16E1707）

<400> 33

ctttgttttc gtattcgcgt gtcgcccttt gatgggttgg cgtcactcga cgccatcttc 60

attcacaaaa ctgggagcca gattgcgatc gccctcccac gtgctcagat ctgagaatct 120

catccatctg aacattggct cttgtctggg tacgtaaaaa tccaaagggc gacacgcgaa 180

gtcgatgtcg cgtctgcctg aagtcaatac tgacgatggt catagctgtt tcctgtccat 240

agcagaaagt caaaagcctc cgaccggagg ctttcgactt gatcggcacg taagaggttc 300

caactttcac cataatgaaa taagatcact accgggcgta ttttttgagt tatcgagatt 360

ttcaggagct aaggaagcta aaatgagtat tcaacatttc cgtgtcgcac ttattccgtt 420

ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga 480

tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa 540

gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct 600

gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat 660

acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga 720

tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc 780

caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat 840

gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa 900

cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac 960

tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa 1020

agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc 1080

tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctgggggcca gatggtaagc 1140

cctcccgtat cgtaattatc tacccgacgg ggagtcaggg aactatggat gaacgaaata 1200

aaccgatcgc tgaaataggt gcctccttga ttaagcattg gtaatgaggg cccaaatgga 1260

tcacctgggt caccttccgg tggggc 1286

<210> 34

<211> 135

<212> DNA

<213> 质粒去载体序列（G16E1707）

<400> 34

tgatgggttg gcgtcactcg acgccatctt cattcacaaa actgggagcc agattgcgat 60

cgccctccca cgtgctcaga tctgagaatc tcatccatct gaacattggc tcttgtctgg 120

gtacgtaaaa atcca 135

<210> 35

<211> 1238

<212> DNA

<213> 质粒载体序列（G16E1708）

<400> 35

gctttgttct cgtatttcgc gtgttcgccc tctgatgggt tggcgtcatt cgacgccatc 60

ttcattcaca aaactgggag ccagattgcg atcgccctcc cacgtgctca gatccgagaa 120

tctcatccat ctgaacattg gctcctgcct gggcacgtaa aaatccaaag ggcgacacgc 180

gaagtcgatg tcgcgtctgc ctgaagtcaa tactgacgat ggtcatagct gtttcctgtc 240

catagcagaa agtcaaaagc ctccgaccgg aggctttcga cttgatcggc acgtaagagg 300

ttccaacttt caccataatg aaataagatc actaccgggc gtattttttg agttatcgag 360

attttcagga gctaaggaag ctaaaatgag tattcaacat ttccgtgtcg cacttattcc 420

gttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 480

agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 540

taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 600

tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 660

catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 720

ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 780

ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 840

catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 900

aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 960

aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 1020

taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 1080

atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 1140

gccctcccgt atcgtagtta tctacccgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 1200

tagacagatc gctgaaatag gtgcctcctt gataaaca 1238

<210> 36

<211> 1238

<212> DNA

<213> 质粒去载体序列（G16E1708）

<400> 36

tggattttta cgtgcccagg caggagccaa tgttcagatg gatgagattc tcggatctga 60

gcacgtggga gggcgatcgc aatctggctc ccagttttgt gaatgaagat ggcgtcgaat 120

gacgccaacc catc 134

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（上游引物F）

<400> 37

atgttcmgmt ggatgmgatt c 21

<210> 38

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列（下游引物GC-R）

<400> 38

cgcccggggc gcgccccggg gcggggcggg ggcgcggggg gtmgacgcca tcwtcattya 60

c 61

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（下游引物R）

<400> 39

tmgacgccat cwtcattyac 20

<210> 40

<211> 1265

<212> DNA

<213> 3-1-3

<400> 40

ggggggggat atgagacggg gcagtgcaag cttgcatgcc tgcaggtcga cggaattatg 60

ttcaagctgg atgagattcc atgacttgag tatgtggaca ggagatcgca atctcttgcc 120

cgattatgta aatgaagatg gcgtctaaat ctctagagga tccccgggta ccgagctcga 180

attcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac 240

acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac 300

tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc 360

tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 420

cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 480

actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 540

gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 600

ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 660

acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aaagctccct cgtgcgctct 720

cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc ggggaagcgt 780

ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 840

gcctgggctg tgtgcacgaa cccccccgtt cagcccgtgt cagtcagtga cgccctttat 900

tcccagtaac tatcgtcttg agtcccaacc tcgggtaaag acacgaactt tatcgcccac 960

ttggcaagct agcccacttg ggttaaccag gaattagcca ggagccgagg gtattgttag 1020

ggccggtgcc taccagagtt tcttttgaaa ggtgggttgg cccttaacct aacgggctta 1080

ccaccttaga aaagaaacca gttaattttt gggtaattct ggcggcctct cttggccttg 1140

aaaagccaga gttaaccttt ccgggaaaaa aaaggaagtt ggttaaggcc tccttttgaa 1200

ttccggcaaa caaagccata ctccgctggt gctatagccg tcgggttggg taggggcttg 1260

cgtat 1265

<210> 41

<211> 1265

<212> DNA

<213> 3-1-4

<400> 41

ggggggggat atgagacggg gcagtgcaag cttgcatgcc tgcaggtcga cggaattatg 60

ttcaagctgg atgagattcc atgacttgag tatgtggaca ggagatcgca atctcttgcc 120

cgattatgta aatgaagatg gcgtctaaat ctctagagga tccccgggta ccgagctcga 180

attcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac 240

acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac 300

tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc 360

tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 420

cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 480

actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 540

gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 600

ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 660

acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aaagctccct cgtgcgctct 720

cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc ggggaagcgt 780

ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 840

gcctgggctg tgtgcacgaa cccccccgtt cagcccgtgt cagtcagtga cgccctttat 900

tcccagtaac tatcgtcttg agtcccaacc tcgggtaaag acacgaactt tatcgcccac 960

ttggcaagct agcccacttg ggttaaccag gaattagcca ggagccgagg gtattgttag 1020

ggccggtgcc taccagagtt tcttttgaaa ggtgggttgg cccttaacct aacgggctta 1080

ccaccttaga aaagaaacca gttaattttt gggtaattct ggcggcctct cttggccttg 1140

aaaagccaga gttaaccttt ccgggaaaaa aaaggaagtt ggttaaggcc tccttttgaa 1200

ttccggcaaa caaagccata ctccgctggt gctatagccg tcgggttggg taggggcttg 1260

cgtat 1265

<210> 42

<211> 1214

<212> DNA

<213> 4-1-3

<400> 42

gggtgttccc gccggccagt tgcaagcttg catgcctgca ggtcgacgat tatgttccga 60

tggatgagat tctcagatct gagcacgtgg gagggcgatc gcaatctggc tcccagtttt 120

gtaaatgaag atggcgtcta aatctctaga ggatccccgg gtaccgagct cgaattcgta 180

atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat 240

acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt 300

aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta 360

atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc 420

gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 480

ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 540

aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 600

ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 660

aggactataa agataccagg cgtttccccc tgggaagctc cctcgttgcg ctctcctgtt 720

ccgaccctgc cgcttaccgg gatacctgtc cgcctttctc cctttcggga agcgtggcgc 780

tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gtttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 840

ggctgtgtgc acgaaccccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg ggtaactatt 900

cgtcttgagt tcccaacccc gggtaagaca cgaacttatc gtccacttgg ccagcagccc 960

actggttaca aggattagca ggagcggagg taatgtaggg cggtgcctac cagaggttcc 1020

tttgaaagtg gttggggcct taaacttact ggcttacaac taacaaagaa aacagttaat 1080

ttgggttatt ccttggcgct ctcttgctgg agccaggctt acccttttcc ggtaacaaag 1140

gagttggtta gacctctttg gatccggcaa tgcctaaccc acaactggcc ttgtggctta 1200

gacccggtgt tcgt 1214

<210> 43

<211> 1205

<212> DNA

<213> 4-1-4

<400> 43

ggggggtatc gaacaggcag gttgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac gattatgttc 60

agatggatga gattctcaga tctgagcacg tgggagggcg atcgcaatct ggctcccagt 120

tttgtaaatg aagatggcgt ctaaatctct agaggatccc cgggtaccga gctcgaattc 180

gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa 240

catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac 300

attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca 360

ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc 420

ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 480

aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 540

aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 600

gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 660

gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 720

tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc cccttcggga agcgtggcgc 780

tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tcccaagctg 840

ggctgtgtgg cacgaaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgcccttatc cggtaactat 900

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ctgggttaac cagggaatta atcaggagcc gagggtaatg tacggccggg tgcctaccag 1020

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ccaggtattt ttggttaact cttcgcgtcc tcttgcctgc aggccagcct tacctttccg 1140

gacaaaaaaa gagagtttgt taggccctct ttggaatccc tggcctaaat atcaaaaact 1200

ctaat 1205

<210> 44

<211> 1199

<212> DNA

<213> 5-2-4

<400> 44

tggggcttta gggaaggcag gttgcaagct tgcatgcctg caggtcgacg attatgttca 60

gctggatgag attctcagat ctgagcacgt gggagggcga tcgcaatctg gctcccagtt 120

ttgtaaatga agatggcgtc taaatctcta gaggatcccc gggtaccgag ctcgaattcg 180

taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 240

atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 300

ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 360

taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 420

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 480

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aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 600

ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 660

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 720

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 780

tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 840

tgtgtgcacg aacccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 900

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ggatttagtc agagtcgaag gttatggtaa ggccggtgcc tacaggagtt ccatgaaagt 1020

gggtgggccc ttaacttacc ggcctacact aaaaaagaaa cagtaattgt tattctgtcg 1080

cctctgcctg aaagccagtt acccttcgga aaaaaagaaa gttgggttag gcctcctttg 1140

gaattccgct aaacaatcca accggctggg taagccgtgg gtggaatttc ttataagta 1199

<210> 45

<211> 1255

<212> DNA

<213> 5-2-5

<400> 45

ggggggtttc gcacgggcag ttgccaaggc tttgcatgcc tgcagggtcg acgattaatg 60

ttcagatgga tgagattctc agatctgagc acgtgggagg gcgatcgcaa tctggctccc 120

agttttgtaa atgaagatgg cgtctaaatc tctagaggat ccccgggtac cgagctcgaa 180

ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca 240

caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact 300

cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct 360

gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc 420

ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 480

ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 540

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acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 720

ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 780

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tgggctgtgt gcacgaaccc ccccgttcag cccgacccgc tgcgccttta tccgggtaaa 900

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agcccacttg gtaaacaggg atttagccag agccggaggg ttatgtaagg ggcgggtggc 1020

cttacagagg tttctttgga agtgtgggtg tgggtcttaa acctttacgg gcttatacaa 1080

cttaagaaag aaaaccagtt attttggggt atttattgtg cagccttcct tgtcttggaa 1140

agcccaggat ttaccccttt ccctgaaaaa gagaaggttt ggggtaaggc ctttcttgga 1200

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<210> 46

<211> 1141

<212> DNA

<213> 5-3-2

<400> 46

tggcccaatt tgcccaaggc cttgcaatgc ctgcaggtcg acgatttaga cgccatcttc 60

atttacaaaa ctgggagcca gattgcgatc gccctcccac gtgctcagat ctgagaatct 120

catccatctg aacataatct ctagaggatc cccgggtacc gagctcgaat tcgtaatcat 180

ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag 240

ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg 300

cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa 360

tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca 420

ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 480

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agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 600

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tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgacga 720

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gcttttctca 780

tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtagggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 840

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tagcagagcg aagggtatgg taggccgggt gctacaggag gttcttggaa agtggttggc 1020

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c 1141

<210> 47

<211> 1141

<212> DNA

<213> 5-3-5

<400> 47

tggcccaatt tgcccaaggc cttgcaatgc ctgcaggtcg acgatttaga cgccatcttc 60

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catccatctg aacataatct ctagaggatc cccgggtacc gagctcgaat tcgtaatcat 180

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ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg 300

cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa 360

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ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 480

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ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gcttttctca 780

tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtagggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 840

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tagcagagcg aagggtatgg taggccgggt gctacaggag gttcttggaa agtggttggc 1020

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c 1141

<210> 48

<211> 1176

<212> DNA

<213> 6-2

<400> 48

ggggggttta aggcaggcca gtgcaagctt gcatgcctgc aggtcgacga ttatgttcca 60

gatggatgcg attctcggat ctgagcacgt gggagggcga tcgcaatctg gctcccagtt 120

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ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 360

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ggctgaaagc cagttaacct tcggcaaaag agttggtagg ctatctggat caggctaacc 1140

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<210> 49

<211> 1176

<212> DNA

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<400> 49

ggggggttta aggcaggcca gtgcaagctt gcatgcctgc aggtcgacga ttatgttcca 60

gatggatgcg attctcggat ctgagcacgt gggagggcga tcgcaatctg gctcccagtt 120

ttgtaaatga agatggcgtc taaatctcta gaggatcccc gggtaccgag ctcgaattcg 180

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atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 300

ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 360

taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 420

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 480

aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 540

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gggggggtac ggagggccag gtgcaagctt gcatgcctgc aggtcgacga tttagacgcc 60

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tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat 300

taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 360

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ctgaggccag gttaaccttt cggaaaaaga gctgttagcc tcctttgatc cggcatgcta 1140

atccccgcct ggttagcgga ttggcata 1168

<210> 51

<211> 1168

<212> DNA

<213> 8-4

<400> 51

gggggggtac ggagggccag gtgcaagctt gcatgcctgc aggtcgacga tttagacgcc 60

atcttcattt acaaaactgg gagccagatt gcgatcgccc tcccacgtgc tcagatccga 120

gaatctcatc catctgaaca taatctctag aggatccccg ggtaccgagc tcgaattcgt 180

aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 240

tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat 300

taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 360

aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 420

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aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 540

aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 600

tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 660

caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 720

cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 780

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ggccttaacc tacggctaca ctagaagaaa ccagttattt tggtattctt gcgctctgcc 1080

ctgaggccag gttaaccttt cggaaaaaga gctgttagcc tcctttgatc cggcatgcta 1140

atccccgcct ggttagcgga ttggcata 1168

<210> 52

<211> 1204

<212> DNA

<213> 9-2-6

<400> 52

aggggggacc gaagggacag gtgccaagct tgcatgcctg caggtcgacg atttagacgc 60

catcttcatt tacaaaactg ggagccagat tgcgatcgcc ctcccacgtg ctcagatctg 120

agaatctcat ccatctgaac ataatctcta gaggatcccc gggtaccgag ctcgaattcg 180

taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 240

atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 300

ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 360

taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 420

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcgagatc agctcactca 480

aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 540

aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 600

ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 660

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct agagtcgtgc gctctcctgt 720

tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 780

ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 840

ctgtgtgcac gaaccccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggg taactatcgt 900

ctttgagtcc aacccgggta aaggacacgg actttatcgc ccactggcca gccaggccca 960

cctgggtaac aggaattagt cagaagcgga agggtaatgt aagggcgggt ggctaacaga 1020

ggttcctttg gaaggtgggt tggtccctaa cttacgggcc taacacttaa gaaaggaaca 1080

ggttattttt gggttattct tggccgctct gccctggcaa ggcccaggct taccattcgg 1140

agaaaagaag tttgggttag gctctttgaa tccggcaaat ctaaacctaa ctccgtcact 1200

ttgt 1204

<210> 53

<211> 1181

<212> DNA

<213> 9-2-7

<400> 53

gggggtttcg aacggcagtg caagcttgca tgcctgcagg tcgacgatta tgttcagatg 60

gatgagattc tcagatctga gcacgtggga gggcgatcgc aatctggctc ccagttttgt 120

aaatgatgat ggcgtctaaa tctctagagg atccccgggt accgagctcg aattcgtaat 180

catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac 240

gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa 300

ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat 360

gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc 420

tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 480

cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 540

gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 600

gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 660

gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 720

ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 780

atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctggggctgt 840

gtgcacgaac ccccccgttc agcccgaccg ctgcgccttt atccggtaac tatcgtcttg 900

gagtccaacc ccgggtaaga cacgacttat cgccactggg cagcagccca ctgggtaaac 960

agggattagc agagccgaag gtaatgtagg cgggtgctac aggagttaca ttgaaagtgg 1020

gtggccctaa acttacggcc taaccaacta aggaaggaaa ccagtaattt gggtatctgg 1080

cggctctgct gaaggccagt taacctttcg ggaaaaagga gcttggtagg ctcctggatt 1140

cggccatcaa agctaaccgg ccgtggtata gatccgcgtt g 1181

<210> 54

<211> 1192

<212> DNA

<213> 10-9

<400> 54

tggggtggtc ccgccggcca ggtgccagct tgcatgcctg caggtcgacg atttagacgc 60

catcttcatt tacaaaactg ggagccagat tgcgatcgcc ctcccacgtg ctcagatccg 120

agaatctcat ccatctgaac ataatctcta gaggatcccc gggtaccgag ctcgaattcg 180

taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 240

atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 300

ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 360

taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 420

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 480

aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 540

aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 600

ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 660

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 720

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 780

tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 840

ctgtgtgcac gaaccccccc gttcagcccg accgctgcgc ccttatccgg gtaactatcg 900

tcttgagtcc aaccccgggt aagacacgac tttatcgcca cttgggcagc agccaacttg 960

gtaaacaggg atttagccag agtcgagggt aatgtagggc cgggtgcctt acagagttct 1020

tggaaaggtg ggttggccta actaccggcc taccaactta gaagaaccag tattttggtt 1080

attctgcgca tctctgctga ggcccaagtt acccctttcc ggcaaaaaga agttggtagg 1140

ctctctttga attcgtcaaa caatccagct cggcgttggg taatacgtcg ct 1192

<210> 55

<211> 1201

<212> DNA

<213> 10-10

<400> 55

tggggggaaa ggacaggcca gttgcaagct tgcatgcctg caggtcgacg attatgttca 60

gatggatgag attctcggat ctgagcacgt gggagggcga tcgcaatctg gctcccagtt 120

ttgtaaatga agatggcgtc taaatctcta gaggatcccc gggtaccgag ctcgaattcg 180

taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 240

atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 300

ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 360

taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 420

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 480

aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 540

aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 600

ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 660

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 720

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcggggaa gcgtggcgct 780

ttctcattgc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgcga ggtcgttcgc tccaagctgg 840

gctgtgtgca cgaaaccccc ccgtttcagc ccgaccgctg cgcccttatc cggtaactat 900

cgtcttggag ttcccaaccc gggtaagaca cgaccttatc ggccaactgg gcagccagcc 960

actggttaac aggaattaag ccagagccga aggttatgta gggccggttg cctatcagaa 1020

ggtttccttg aaagttgggt gggcccctaa acctaccggc taaccacctt agaagaaaca 1080

gttatttttg ggtaattctt ggccgctcct cttgctggaa agcccaaggt tttatccctt 1140

tcccggggaa gaaaagagat gttgggctta gcttctcttt ggaaattccg ggcctaaaat 1200

c 1201

<210> 56

<211> 92

<212> DNA

<213> 3-1-3(去载体）

<400> 56

atgttcaagc tggatgagat tccatgactt gagtatgtgg acaggagatc gcaatctctt 60

gcccgattat gtaaatgaag atggcgtcta aa 92

<210> 57

<211> 92

<212> DNA

<213> 3-1-4(去载体）

<400> 57

atgttcaagc tggatgagat tccatgactt gagtatgtgg acaggagatc gcaatctctt 60

gcccgattat gtaaatgaag atggcgtcta aa 92

<210> 58

<211> 91

<212> DNA

<213> 4-1-3(去载体）

<400> 58

atgttccgat ggatgagatt ctcagatctg agcacgtggg agggcgatcg caatctggct 60

cccagttttg taaatgaaga tggcgtctaa a 91

<210> 59

<211> 91

<212> DNA

<213> 4-1-4(去载体）

<400> 59

atgttcagat ggatgagatt ctcagatctg agcacgtggg agggcgatcg caatctggct 60

cccagttttg taaatgaaga tggcgtctaa a 91

<210> 60

<211> 91

<212> DNA

<213> 5-2-4(去载体）

<400> 60

atgttcagct ggatgagatt ctcagatctg agcacgtggg agggcgatcg caatctggct 60

cccagttttg taaatgaaga tggcgtctaa a 91

<210> 61

<211> 92

<212> DNA

<213> 5-2-5(去载体）

<400> 61

aatgttcaga tggatgagat tctcagatct gagcacgtgg gagggcgatc gcaatctggc 60

tcccagtttt gtaaatgaag atggcgtcta aa 92

<210> 62

<211> 91

<212> DNA

<213> 9-2-6(去载体）

<400> 62

ttatgttcag atggatgaga ttctcagatc tgagcacgtg ggagggcgat cgcaatctgg 60

ctcccagttt tgtaaatgaa gatggcgtct a 91

<210> 63

<211> 91

<212> DNA

<213> 9-2-7(去载体）

<400> 63

atgttcagat ggatgagatt ctcagatctg agcacgtggg agggcgatcg caatctggct 60

cccagttttg taaatgatga tggcgtctaa a 91

<210> 64

<211> 91

<212> DNA

<213> 5-3-2(去载体）

<400> 64

ttatgttcag atggatgaga ttctcagatc tgagcacgtg ggagggcgat cgcaatctgg 60

ctcccagttt tgtaaatgaa gatggcgtct a 91

<210> 65

<211> 91

<212> DNA

<213> 5-3-5(去载体）

<400> 65

ttatgttcag atggatgaga ttctcagatc tgagcacgtg ggagggcgat cgcaatctgg 60

ctcccagttt tgtaaatgaa gatggcgtct a 91

<210> 66

<211> 92

<212> DNA

<213> 6-2(去载体）

<400> 66

atgttccaga tggatgcgat tctcggatct gagcacgtgg gagggcgatc gcaatctggc 60

tcccagtttt gtaaatgaag atggcgtcta aa 92

<210> 67

<211> 92

<212> DNA

<213> 6-4(去载体）

<400> 67

atgttccaga tggatgcgat tctcggatct gagcacgtgg gagggcgatc gcaatctggc 60

tcccagtttt gtaaatgaag atggcgtcta aa 92

<210> 68

<211> 91

<212> DNA

<213> 8-1(去载体）

<400> 68

ttatgttcag atggatgaga ttctcggatc tgagcacgtg ggagggcgat cgcaatctgg 60

ctcccagttt tgtaaatgaa gatggcgtct a 91

<210> 69

<211> 91

<212> DNA

<213> 8-4(去载体）

<400> 69

ttatgttcag atggatgaga ttctcggatc tgagcacgtg ggagggcgat cgcaatctgg 60

ctcccagttt tgtaaatgaa gatggcgtct a 91

<210> 70

<211> 91

<212> DNA

<213> 10-9(去载体）

<400> 70

ttatgttcag atggatgaga ttctcggatc tgagcacgtg ggagggcgat cgcaatctgg 60

ctcccagttt tgtaaatgaa gatggcgtct a 91

<210> 71

<211> 91

<212> DNA

<213> 10-10(去载体）

<400> 71

atgttcagat ggatgagatt ctcggatctg agcacgtggg agggcgatcg caatctggct 60

cccagttttg taaatgaaga tggcgtctaa a 91

Claims (10)

1.一种基于PCR-DGGE的诺如病毒溯源方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)富集诺如病毒并提取所述诺如病毒的基因组RNA，以获得所述基因组RNA为mRNA进行反转录得到cDNA，备用；

(2)取步骤(1)获得的基因组cDNA为模板，以如下引物，对所述基因组DNA进行PCR扩增；

上游引物F：5‘-ATGTTCMGMTGGATGMGATTC-3’；

下游引物GC-R：5‘-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGGCGGGGCGGGGGCGCGGGGG

GTMGACGCCATCWTCATTYAC-3’；

(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳处理，分析所得的凝胶图谱，然后回收凝胶条带，以所述条带的回收产物为模板，以如下引物，进行PCR扩增；

上游引物F：5‘-ATGTTCMGMTGGATGMGATTC-3’；

下游引物R：5‘-TMGACGCCATCWTCATTYAC-3’；

(4)将步骤(3)获得的PCR扩增产物进行电泳，然后切胶回收、纯化，将所得PCR扩增产物进行克隆测序，然后登陆Genbank进行测序比对，得到所述诺如病毒的基因类型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中的PCR扩增反应体系相同，包括：

模板，50ng，1.0μL；

上游引物，20μM,0.3μL；

下游引物，20μM,0.3μL；

dNTP，2.5mM，0.8μL；

rTaq，5U/μL，0.4μL；

10×PCR buffer，4μL；

补ddH₂O至40μL。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中的所述PCR扩增程序相同，所述PCR扩增程序如下：94℃预变性3min，94℃变性45s，52℃复性45s，72℃延伸1min，进行35个循环；最终72℃延伸10min，最终降至4℃，获得的扩增产物4℃或-20℃保存，备用。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述变性梯度凝胶为变性梯度范围为20-70％、丙烯酰胺浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度递增的方向与电泳方向一致；其中，所述聚丙烯酰胺凝胶含有7mol/L尿素和体积比为40％的丙烯酰胺为100％变性剂，不含有尿素和丙烯酰胺为0％变性剂。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将所述聚丙烯酰胺凝胶在1×TAE缓冲液中，取步骤(2)中获得的PCR扩增产物10μL加入上样孔中，于电压为180V，温度为60℃下电泳5小时。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述反转录步骤如下：分别取1μg的RNA、2μL的Oligo dT以及2μL的2.5mM的dNTP混合，然后加入RNase-free ddH₂O补齐至14.5μL，然后于70℃水浴5min，随后冰浴2min；然后向上述混合物中加入4μL的5×M-MLV Buffer、0.5μL的40U/μL的RNasin以及1μL的200U/μL的M-MLV，然后于42℃孵育50min，于72℃加热5min后终止反应，获得cDNA。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，富集诺如病毒的方法包括如下步骤：

取25g样品放至离心管中，加入40mL TGBE缓冲液，在室温下孵育20min，60rpm恒定摇晃，按照10000×g离心30min，在4℃下离心澄清，取获得的上清液转入另一个离心管中，并用1mol/L盐酸溶液将pH调节至7.0，然后向所述离心管中加入5×PEG和NaCl溶液至所述离心管中PEG最终浓度为10％PEG，NaCl最终浓度为0.3M NaCl，振荡60s，混匀之后在5℃下以60rpm孵育60min或者过夜，然后在5℃下按照10000×g离心30min，弃去上清液，然后在5℃下按照10000×g离心5min，以压实沉淀物，弃上清，加入500μL PBS重悬沉淀，再加入500μL的氯仿-正丁醇，涡旋混合，然后在室温下孵育5min，随后于5℃下按照10000×g离心15min，取上层水相转移到一个新的离心管中，即得病毒富集液。

8.一种用于诺如病毒溯源的引物，其特征在于，所述引物包括：

上游引物F：5‘-ATGTTCMGMTGGATGMGATTC-3’；

下游引物R：5‘-TMGACGCCATCWTCATTYAC-3’；

下游引物GC-R：5‘-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGGCGGGGCGGGGGCGCGGGGG

GTMGACGCCATCWTCATTYAC-3’。

9.一种用于诺如病毒溯源的试剂盒，其特征在于，包括权利要求8所述的引物，每支所述试剂盒的配方为：

上游引物F，20μM,0.6μL；

下游引物R，20μM,0.3μL；

下游引物GC-R，20μM,0.3μL；

dNTP，2.5mM，1.6μL；

rTaq，5U/μL，0.8μL；

10×PCR buffer，8μL；

ddH₂O，80μL。

10.一种权利要求1-7任一所述的方法或权利要求8-9任一项所述的试剂盒在检测诺如病毒领域的应用。