CN112461808B - 用于农产品中多菌灵检测的检测方法以及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于农产品中多菌灵检测的检测方法，包括如下步骤：(1)取预定体积的农产品，加入萃取剂，混合均匀后离心或者静置分层；(2)取上层清液，与去离子水或二次蒸馏水混合均匀，再次离心或者静置分层，取下层清液为待测液；(3)取待测液与具有SERS活性的纳米溶胶混合均匀，加入聚沉剂待测；(4)用拉曼光谱仪在400～2000cm‑1的范围内扫描测试样品，读取或者记录拉曼光谱测试结果。本发明还涉及一种基于上述方法的试剂盒。本发明检测方法和试剂盒，环保易得，成本低，易于操作和携带，有利于快速检测的普及推广。

Description

用于农产品中多菌灵检测的检测方法以及试剂盒
技术领域
本发明涉及食品检测领域，特别是涉及一种用于农产品中多菌灵检测的检测方法以及试剂盒。
背景技术
多菌灵又名棉萎灵、苯并咪唑44号，是上世纪70年代中期由美国杜邦公司开发研制的一种内吸性杀菌剂，低毒，可有效防治由真菌引起的多种作物病害，具有高效、广谱、持效性长，使用成本低等特点，已成为国内产量最大的内吸性杀菌剂品种之一。然而，由于直接从事生产的农民大多文化程度不高，对科学用药常识和病虫害防控技术掌握不够，盲目超范围超剂量用药现象普遍，极易造成农产品中多菌灵残留污染甚至严重超标。多菌灵性质稳定，残效期长，对人、畜均有一定毒性，可引起抽搐、精神恍惚、恶心呕吐、胸闷、头晕等中毒症状，长期慢性暴露很可能引起体内蓄积中毒发生。因此，有关多菌灵的残留限量要求越来越严格，对多菌灵快速、准确、可靠的残留监控技术也提出了迫切需求。
目前，多菌灵的主要检测方法依赖液相色谱-紫外检测法和液相质谱-质谱法。虽然以上方法准确性、灵敏度高，但是需要的仪器设备昂贵，并且操作复杂，对操作人员的要求较高，且限于专业实验室内使用，难以及时、便捷、经济地进行大规模的样品筛检和农产品生产过程中的监控。因此寻求快速、便捷、准确且经济的检测方法已成为多菌灵残留分析研究中亟需解决的问题。
CN104568879B公开了一种基于荧光探针的多菌灵检测方法，但前处理过程复杂，需要经过萃取、净化、浓缩和复溶，耗时较长。CN107144612B公开了一种多菌灵农残的电化学检测方法。该方法虽然能够检测痕量多菌灵农药，但同样方法复杂，周期长，耗时耗力，在实际检测中有一定限制。CN109270263A公开了一种多菌灵半定量胶体金试纸条制备方法并用于中药中多菌灵检测，前处理简单，测试方便，但试纸条上的抗体抗原易失活且易受其他物质干扰(如巯基化合物)，影响了试纸条的稳定性和检测结果的准确性。
因此，本领域的技术人员亟待寻求一种灵敏的技术去快速检测存在于农产品残存的多菌灵农药。
发明内容
基于此，有必要提出一种新的农产品中多菌灵检测的检测方法，以解决目前检测方法前处理复杂、准确度不高以及不经济等问题。
为决解上述问题，本发明提供了一种用于农产品中多菌灵检测的检测方法，包括如下步骤：
(1)取预定质量的农产品，加入萃取剂，混合均匀后离心或者静置分层；
(2)取上层清液，与去离子水或二次蒸馏水混合均匀，再次离心或者静置分层，取下层清液为待测液；
(3)取待测液与具有SERS活性的纳米溶胶混合均匀，加入聚沉剂，得到测试样品；或者将SERS芯片浸泡在所述待测液中预定时间，得到测试样品；
(4)用拉曼光谱仪在400cm-1～2000cm-1的范围内扫描所述测试样品，读取或者记录拉曼光谱测试结果。
在其中一个实施方式中，所述萃取剂的体积与所述农产品的质量比不小于3。
在其中一个实施方式中，所述萃取剂选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、正己烷和石油醚中的一种或多种。
在其中一个实施方式中，步骤(1)或者步骤(2)中，离心转速低于6000转，离心时间不超过2分钟。
在其中一个实施方式中，步骤(1)、步骤(2)或者步骤(3)中，所述混合采用漩涡震荡，时间为5s～20s。
在其中一个实施方式中，步骤(1)和步骤(2)的总时间不超过5分钟。
在其中一个实施方式中，所述聚沉剂为1M氯化钠水溶液。
在其中一个实施方式中，所述拉曼光谱仪为便携式拉曼光谱仪或者微拉曼光谱仪。
在其中一个实施方式中，所述纳米溶胶的浓度范围为30mg/L～100mg/L。
在其中一个实施方式中，所述纳米溶胶为金溶胶或者银溶胶。
基于上述农产品中多菌灵检测的方法，本发明还提出了一种用于农产品中多菌灵检测的试剂盒，包括以下试剂：
(1)检测试剂A：金溶胶或者银溶胶或者SERS芯片；
(2)检测试剂B：萃取剂，所述萃取剂选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、正己烷和石油醚中的一种；
(3)检测试剂C：二次蒸馏水或去离子水；
(4)检测试剂D：1M氯化钠水溶液。
本发明提出的用于农产品中多菌灵检测的方法，所需试剂数量少，无毒绿色环保，且操作简单，易于普及，对农产品中多菌灵的检测限可达0.1ppm，低于国家规定的检测标准，有利于更加精确的实现多菌灵的快速检测。本发明检测方法和试剂盒，成本低，易于操作和携带，有利于快速检测的普及推广。
附图说明
图1为不同浓度下多菌灵标准品的SERS光谱；
图2为本发明实施例1-5的拉曼测试结果图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供了一种用于农产品中多菌灵检测的检测方法，包括如下步骤：
(1)取预定质量的农产品，加入萃取剂，混合均匀后离心或者静置分层；
(2)取上层清液，与去离子水或二次蒸馏水混合均匀，再次离心或者静置分层，取下层清液为待测液；
(3)取待测液与具有SERS活性的纳米溶胶混合均匀，加入聚沉剂后待测；
(4)用拉曼光谱仪在400cm-1～2000cm-1的范围内扫描测试样品，读取或者记录拉曼光谱测试结果。
现有技术的前处理步骤复杂，有的需引入多种化学试剂，操作难度和成本均有所增加，而且易对多菌灵的检测结果产生干扰，有的还需要大型设备，也不便于携带或者成本过高。本发明的检测方法只含有一种环境友好的有机试剂和水，绿色安全且成本低。萃取剂用于直接萃取农产品中的多菌灵分子。优选地，萃取剂为碳原子数小于8的疏水试剂。更优选地，萃取剂为碳原子数小于8的疏水试剂，且包括亲水基团和疏水基团。在一些实施方式中，萃取剂微溶于水。在一些具体实施方式中，萃取剂为碳原子数小于8的乙酸酯类疏水试剂。在一些具体实施方式中，萃取剂选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、正己烷和石油醚中的一种。在一些优选方式中，萃取剂可以选自两种或两种以上上述试剂的组合。萃取剂的体积与所述农产品的质量比不小于3。
本发明步骤(1)、步骤(2)或者步骤(3)中的混合方式采用一般的摇晃震荡即可。优选采用漩涡震荡，时间为5s～20s。混合均匀后采用离心或者静置分层。在一个实施例方式中，分层方式采用离心处理，步骤(1)或者步骤(2)中的离心的转速不超过6000转，离心的时间不超过2分钟。本发明对离心的转速要求不高，可以使用便携式离心机。在另一个实施方式中，分层方式采用静置，静置时间不超过5分钟。
本发明提出的用于农产品中多菌灵现场快速检测的方法，总时间可控制在不超过5分钟，所需仪器要求简单，所需试剂数量少，无毒绿色环保，且操作简单，易于普及。
在其中一个实施方式中，拉曼光谱仪为便携式拉曼光谱仪或者微拉曼光谱仪。
在其中一个实施方式中，纳米溶胶的浓度范围为30mg/L～100mg/L。纳米溶胶可选自金溶胶或者银溶胶。
基于上述农产品中多菌灵检测的方法，本发明还提出了一种用于农产品中多菌灵检测的试剂盒，包括以下试剂：(1)检测试剂A：金溶胶或者银溶胶或者SERS芯片；(2)检测试剂B：萃取剂，所述萃取剂选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、正己烷和石油醚中的一种；(3)检测试剂C：二次蒸馏水或去离子水；(4)检测试剂D：1M氯化钠水溶液。
在一些具体实施方式中，试剂盒还包括包装盒、PVC离心管、检测池。
本发明还提供了一种用于农产品中多菌灵检测的检测方法，包括如下步骤：
(1)取预定质量的农产品，加入萃取剂，混合均匀后离心或者静置分层；
(2)取上层清液，与去离子水或二次蒸馏水混合均匀，再次离心或者静置分层，取下层清液为待测液；
(3)将SERS芯片浸泡在所述待测液中预定时间，得到测试样品；
(4)用拉曼光谱仪在400cm-1～2000cm-1的范围内扫描测试样品，读取或者记录拉曼光谱测试结果。
在一些具体实施方式中，SERS芯片为包括基底以及均匀分布在基底上的多个贵金属纳米簇，每个贵金属纳米簇被限制在基底上的一个对应的纳米凹坑中；纳米凹坑由电化学反应形成；贵金属纳米簇由3～8个的贵金属纳米颗粒自组装形成；贵金属纳米颗粒的平均粒径为30nm～120nm，优选为40-60nm；每个纳米粒子的平均间距为1nm～2nm。
下面结合具体实施例对本发明的用于农产品中多菌灵检测的检测方法以及试剂盒进行进一步地说明。
待测农产品的配置：
购买待测农产品，通过国标GB/T23380-2009方法测定所含多菌灵小于0.1ppm。取不同农产品，分别添加一定量的多菌灵，依次定义为待测农产品1，加标量为3ppm的番茄；待测农产品2，加标量为0.5ppm的草莓；待测农产品3，加标量为0.2ppm的胡萝卜；待测农产品4，加标量为5ppm的苹果；待测农产品5，加标量为0.5ppm的黄瓜。
纳米金溶胶的制备：
于100mL三颈烧瓶中加入质量浓度为1％的氯金酸水溶液10.81mL并稀释到100ml；将此溶液加热至沸，在不断回流和剧烈搅拌下加入浓度为1％的柠檬酸钠溶液，溶液逐渐由淡黄转变为酒红色，变色后开始计时，搅拌条件下保持体系沸腾状态15min，随后自然冷却至室温，得到金溶胶。
实施例1
一种用于农产品中多菌灵检测的检测方法，包括以下步骤：
a.取2g待测农产品1，在待测农产品1中加入10mL乙酸乙酯，漩涡震荡10秒混匀，随后4000转离心2分钟，溶液分层；
b.取1mL上层清液，加入1mL去离子水，漩涡震荡10秒混匀，随后4000转离心2分钟，溶液分层；
c.选用激光光源发射波长为785nm的便携式拉曼仪进行检测，其步骤为：
(1)取步骤b中得到的溶液下层清液300μL于2mL检测池中，加入150μL金溶胶(浓度为50mg/L)，加入100μL检测试剂D，轻微摇晃2s；
(2)仪器参数设置：激光能量选择500mw，积分时间选择1s；
(3)扫描：用拉曼光谱仪在400～2000cm-1的范围内，以8cm-1的分辨率扫描测试样品，读取或者记录拉曼光谱测试结果，并由仪器自动判断给与结果。
实施例2
使用实施例1相同的方法对待测农产品2进行检测。
实施例3
使用实施例1相同的方法对待测农产品3进行检测。
实施例4
使用实施例1相同的方法对待测农产品4进行检测。
实施例5
通过阳极氧化法制备的氧化铝模板，多个纳米凹陷部微观无序而宏观均一地分布在模板的整个表面上，该基材上每平方厘米上的纳米凹陷部的数量约为108～109个，纳米凹陷部的口径为90nm左右，略小于氧化铝层的厚度，相邻二个纳米凹陷部之间的距离为约20nm左右，裁切为长4mm、宽4mm的方形片状。将其表面清洗和/或进行表面处理后浸泡于上述纳米银溶胶中3h，纳米银颗粒自组装到基材的纳米凹陷部内，每个凹陷部内形成一个由3～10个银纳米粒子自组装成的银纳米簇，取出吹干得到SERS芯片。
将SERS芯片置于实施例1步骤b中得到的溶液下层清液300μL中5-10min，然后取出干燥，进行SERS检测。
实施例6
一种用于农产品中多菌灵检测的试剂盒，包括：金溶胶、乙酸乙酯、二次蒸馏水，1M氯化钠水溶液。
实施例7
一种用于农产品中多菌灵检测的试剂盒，包括：金溶胶、正己烷、去离子水，1M氯化钠水溶液。
实施例8
一种用于农产品中多菌灵检测的试剂盒，包括：银溶胶、乙酸乙酯、二次蒸馏水，1M氯化钠水溶液。
实施例9
一种用于农产品中多菌灵检测的试剂盒，包括：SERS芯片、乙酸乙酯、二次蒸馏水，1M氯化钠水溶液。
图1为不同浓度下多菌灵标准品的SERS光谱。从图中可以看出，多菌灵在632、735、1004、1221、1263、1462、1520cm-1位置出现特征峰。
图2为实施例1-5的测试结果，由图2可以看出，在本发明的检测方法下，获得了非常明显的拉曼信号，表明本发明的检测方法可用于多种农产品中多菌灵的快速检测。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种用于农产品中多菌灵检测的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取预定质量的农产品，加入萃取剂，混合均匀后离心分层；
（2）取上层清液，与去离子水或二次蒸馏水混合均匀，再次离心，取下层清液为待测液；
（3）将SERS芯片浸泡在所述待测液中预定时间，得到测试样品；所述SERS芯片为包括基底以及均匀分布在基底上的多个贵金属纳米簇，每个贵金属纳米簇被限制在基底上的一个对应的纳米凹坑中；纳米凹坑由电化学反应形成；贵金属纳米簇由3~8个的贵金属纳米颗粒自组装形成；贵金属纳米颗粒的平均粒径为30nm~120nm；
（4）用拉曼光谱仪在400cm-1~2000cm-1的范围内扫描所述测试样品，读取或者记录拉曼光谱测试结果。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述萃取剂的体积与所述农产品的质量比不小于3。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述萃取剂选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、正己烷和石油醚中的一种。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）或者步骤（2）中，离心转速低于6000转，离心时间不超过2分钟。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）或者步骤（2）中，所述混合采用漩涡震荡，时间为5s~20s。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）的总时间不超过5分钟。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述拉曼光谱仪为便携式拉曼光谱仪或者微拉曼光谱仪。
8.一种用于农产品中多菌灵检测的试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：
（1）检测试剂A： SERS芯片，所述SERS芯片为包括基底以及均匀分布在基底上的多个贵金属纳米簇，每个贵金属纳米簇被限制在基底上的一个对应的纳米凹坑中；纳米凹坑由电化学反应形成；贵金属纳米簇由3~8个的贵金属纳米颗粒自组装形成；贵金属纳米颗粒的平均粒径为30nm~120nm；
（2）检测试剂B：萃取剂，所述萃取剂选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、正己烷和石油醚中的一种；
（3）检测试剂C：二次蒸馏水或去离子水；
（4）检测试剂D：1 M氯化钠水溶液。
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