CN107703118A - 唾液诊断传感器、制备方法及其在检测丙型肝炎中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及丙型肝炎病毒诊断技术领域,公开了一种唾液诊断传感器、制备方法及其在检测丙型肝炎中的应用,该传感器包括基底、金属膜和复合纳米卷,所述金属膜覆盖在所述基底上,所述复合纳米卷分散在所述金属膜上,所述复合纳米卷为在石墨烯材料表面原位生长金属纳米颗粒后发生卷曲并将所述金属纳米颗粒包裹在内形成的纳米卷结构;该传感器的制备方法包括对包含有石墨烯材料、金属离子和乙醇溶液的液相反应体系进行超声反应制得所述复合纳米卷;将所述复合纳米卷的分散液涂覆于溅射有金属膜的基底上,干燥后制得所述唾液诊断传感器。与现有技术相比,本传感器操作简单、检测速度快,精确度高。
Description
技术领域
本发明涉及丙型肝炎病毒诊断技术领域,特别涉及一种唾液诊断传感器、制备方法及其在检测丙型肝炎中的应用。
背景技术
丙型肝炎呈全球性流行,不同性别、年龄、种族人群均对丙型肝炎病毒(HepatitisC virus, HCV)易感。HCV属于黄病毒科(Flaviviridae)、肝炎病毒属(Hepacivirusgenus),其基因组为单股正链RNA。HCV基因易变异,目前可至少分为6个基因型及多个亚型。据世界卫生组织统计,全球HCV的感染率约为2.8%,约1.85亿人感染HCV,每年因HCV感染导致的死亡病例约35万例。但是,由于HCV感染具有隐匿性,多数感染者并不知道已感染HCV,因此,全球确切的慢性丙型肝炎(CHC)发病率尚不清楚。2006年全国血清流行病学调查显示,我国1~59岁人群抗HCV流行率为0.43%,在全球范围内属HCV低流行地区,由此推算,我国一般人群HCV感染者约560万,如加上高危人群和高发地区的HCV感染者,约1000万例(丙型肝炎防治指南(2015年),中华医学会肝病学分会,中华医学会感染病学分会)。HCV感染的慢性化发生率明显高于乙型肝炎,较乙型肝炎易早期出现肝硬化、肝癌,死亡率较高。因此HCV的检测对丙型肝炎病毒感染的早期(即传统意义上的“窗口期”)诊断和指导临床治疗有重大的意义。
目前临床上用于丙型肝炎病毒检测的技术方法主要有:(1)针对HCV RNA的RT-PCR方法;(2)针对HCV抗体的ELISA检测试剂盒;(3)针对HCV核心抗原的ELISA检测试剂盒。其中,RT-PCR检测法,价格昂贵、操作繁杂,不适于广泛推广。而针对HCV抗体的ELISA检测法是目前最常用的检测方法,但其致命缺点是存在“窗口期”,即HCV感染后至HCV抗体产生中间有40-70天的时间。窗口期的存在是输血感染的主要原因。目前丙型肝炎的输血后感染占肝炎病例的70%,而在丙型肝炎病毒感染者中更有80-90%是属于输血后感染。早在2001年Ortho公司推出了检测HCV核心抗原的ELISA检测试剂盒,通过大量临床样本的评价,证明比检测HCV抗体能更早地检测到HCV,但仍存在一定的漏检率,检测成本相对校高。
拉曼光谱被广泛的应用于分析化学和药物化学中,能无损快速地对物质进行定性和定量检测。表面增强拉曼散射(SERS)是一种可以显著改善传统拉曼分析的一种分析技术。SERS可用于显著降低样品荧光信号的同时大大增强拉曼散射信号,这两种效应能够共同显著改善拉曼分析方法的检测极限。通常,具有纳米结构的金属基底被用来增强被测组分的拉曼信号。金属种类和纳米结构的形貌特征对拉曼信号的增强效益具有重要的影响。目前,表面增强拉曼散射技术至少可将信号放大107倍,甚至实现单分子检测。正是由于这种高灵敏度的检测方法,表面增强拉曼散射技术被广泛应用于各个领域,特别是痕量检测方面。
石墨烯是由碳原子构成的二维纳米材料,具有优良的机械性能、热力学特性和导电能力并在多个领域得到应用。石墨烯被认为是平面多环芳香烃原子晶体,每个碳原子均为sp2杂化,并贡献剩余一个p轨道上的电子形成大π键,可以通过π-π作用吸附一些物质,并具有巨大的比表面积,使其能作为一种优良的载体并选择性吸附固定多种物质。另外,石墨烯对大量的荧光物质具有很强的荧光淬灭效应。因此,石墨烯可用作表面增强拉曼散射的检测平台。
发明内容
发明目的:针对现有技术中存在的问题,本发明提供一种唾液诊断传感器、制备方法及其在检测丙型肝炎中的应用,本传感器操作简单、检测速度快,精确度高。
技术方案:本发明提供了一种唾液诊断传感器,包括基底、金属膜和复合纳米卷,所述金属膜覆盖在所述基底上,所述复合纳米卷分散在所述金属膜上,所述复合纳米卷为在石墨烯材料表面原位生长金属纳米颗粒后发生卷曲并将所述金属纳米颗粒包裹在内形成的纳米卷结构。
优选地,所述石墨烯材料与所述金属纳米颗粒的质量比为10:90~50:50。
优选地,所述金属膜的厚度为200~1000 nm;所述复合纳米卷的长度为0.14~3μm,直径为30~70 nm;所述石墨烯材料的厚度为0.4~3.5 nm;所述金属纳米颗粒的粒径为30~60 nm。
优选地,所述金属膜为金膜、铜膜或镍膜;所述金属纳米颗粒为金纳米颗粒、银纳米颗粒、铜纳米颗粒或铂纳米颗粒;所述基底为ITO玻璃、硅片、普通玻璃、金属或塑料;所述石墨烯材料为氧化石墨烯、还原氧化石墨烯或石墨烯。
本发明还提供了一种唾液诊断传感器的制备方法,包括以下步骤:
S1:对包含有石墨烯材料、金属离子和乙醇溶液的液相反应体系进行超声反应制得所述复合纳米卷,所述复合纳米卷是在石墨烯材料表面原位生长金属纳米颗粒后发生卷曲并将所述金属纳米颗粒包裹在内形成的纳米卷结构;S2:在基底上溅射金属膜;S3:将所述复合纳米卷的分散液涂覆于所述金属膜上,经干燥处理后,制得所述唾液诊断传感器。
优选地,在所述液相反应体系中,所述石墨烯的浓度为0.1~2.0 mg/mL;所述金属离子的浓度为0.1 mol/L~1.5 mol/L。
进一步地,所述乙醇溶液中,所述水与所述乙醇的体积比为8:2~2:8。
优选地,所述超声反应过程中,超声功率为150~500 W;超声时间为60~300 min。
本发明还提供了一种唾液诊断传感器在检测丙型肝炎中的应用。检测方法如下:将唾液样品滴在所述唾液诊断传感器的表面,静置吸附;对唾液中标志物产生的表面增强拉曼图谱中的特征峰进行主成份分析;根据所述标志物落在的区域,判断所述标志物是否为丙型肝炎的标志物。
有益效果:
利用超声还原方法制备得到氧化石墨烯包裹金属纳米颗粒纳米卷结构,并将这种纳米卷结构分散液滴涂在覆有金属膜的基底的金属膜面上制备得到唾液诊断传感器。本发明唾液诊断传感器中,氧化石墨烯不仅包裹金属纳米颗粒以提高稳定性及提供良好的检测灵敏度,又作为吸附层选择性吸附富集唾液中的丙型肝炎病毒标志物,同时氧化石墨烯膜也作为金纳米粒、铂纳米粒、银纳米颗粒提供生长位点和稳定剂,使金纳米粒、铂纳米粒、银纳米颗粒的粒径均一、密集且均匀分散在石墨烯膜上表面,并自身发生卷曲时将这些纳米颗粒包裹,而通过这种纳米卷结构制备的这种唾液诊断传感器具有优异的表明增强拉曼散射效应及在唾液中保持良好的稳定性,又有足够的重复性。不同批次制备的唾液诊断传感器检测同一样品时,结果的相对标准偏差为4.35%。对唾液中丙型肝炎病毒标志物的检测过程简单,费用低,结果可靠。因此本发明提到的唾液诊断传感器及其在检测唾液中丙型肝炎病毒标志物的方法在对大众群体进行丙型肝炎病毒早期筛查与病程监测中的应用前景广阔。
相比与其他的方法,本发明具备如下有益效果:
1、本发明中的唾液诊断传感器的操作简单、费用低廉,并且在检测唾液中标志物时,操作过程简单,速度快,准确性好。而本发明中提及的唾液诊断传感器的制备过程简单,重复性好,可以大规模制备,成品率约80%,也特别适合大规模的检测。
2、本发明中所制备的唾液诊断传感器的拉曼增强效果明显,使用萘作为拉曼信标分子时,传感器可以轻松检测出10-4M的萘,因此,可以用于检测唾液中微量的标志物。唾液中不同标志物的不同组合,可以指示疾病的不同状态,因此,本发明提及的唾液诊断传传感器还可以作为一种新的平台,通过监测唾液中不同的疾病标志物,特别是能够应用于丙型肝炎病毒感染的早期诊断。
附图说明
图1为唾液诊断传感器的扫描电子显微镜图片;
图2为唾液诊断传感器的透射电子显微镜图片;
图3 为唾液诊断传感器的表面层的紫外-可见光吸收谱图,其中,曲线a为在没有GO的条件下通过超声还原方法合成的AuNPs反应液的UV-Vis光谱图,曲线b、c和d分别为超声时间为0.5h、1h和2 h所得到的A/GO NSs反应液的UV-Vis光谱图;
图4 为唾液诊断传感器的表面层的X射线谱图,其中,曲线a和b分别为GO与制备的A/GONSs的XPS谱图;
图5为以萘为拉曼信标分子检测的唾液诊断传感器的拉曼增加效率图谱;其中,a曲线为使用制备的唾液诊断传感器检测10-4M的萘得到的拉曼谱图;b曲线为固体萘在金膜上测得的拉曼谱图;c曲线为唾液诊断传感器的空白拉曼谱图;
图6为基于萘SERS光谱中759 cm-1处峰强得到的拉曼成像结果;
图7为用制备的唾液诊断传感器检测唾液样本中采集到拉曼光谱图谱,其中,从下到上分别为健康对照组、丙型肝炎病毒抗原(或抗体)组和丙型肝炎病毒RNA组;
图8为从健康人、丙型肝炎病毒抗原(或抗体)和丙型肝炎病毒RNA唾液样本的拉曼光谱中19个特征峰峰面积进行主成分分析得到的数据区域;
图9是本发明中唾液诊断传感器的构建及应用示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行详细的介绍。
多种醇类试剂包括,甲醇乙二醇和丙三醇可以用来代替乙醇。实验表明,当使用这两种醇代替乙醇时,超声反应后生成的金纳米颗粒数量明显减少,并且氧化石墨烯材料很难发生卷曲,这都非常不利于传感器在液体中保持稳定,并且明显降低了表面增强拉曼散射效率。因此,上述这些材料不在本发明中使用。本发明中使用乙醇水溶液为超声反应介质,超声过程中,乙醇变成具有还原能力的自由基,可以用于生成金属纳米颗粒并附着于氧化石墨烯表面。
实施例1
本实施例提供了一种唾液诊断传感器包括玻璃基底、金膜以及复合纳米卷,金膜覆盖在玻璃基底上,复合纳米卷分散在所述金膜上,复合纳米卷为在氧化石墨烯材料表面原位生长金纳米颗粒后发生卷曲并将金纳米颗粒包裹在内形成的纳米卷结构。其中,金膜的厚度为300 nm,复合纳米卷的长度为4μm,直径为50 nm;氧化石墨烯材料的厚度为4 nm;金纳米颗粒的粒径为50 nm。
上述唾液诊断传感器的制备方法如下:
步骤一,对包含有浓度为0.5 mg/ml的氧化石墨烯、浓度为0.5 mmol/L的氯金酸离子和乙醇溶液共15ml的液相反应体系进行超声反应,制备得到氧化石墨烯包裹金纳米颗粒的复合纳米卷。其中,乙醇溶液中水与乙醇的比例为8:7,超声反应过程中,超声功率为300W,超声时间为90min。制备得到的复合纳米卷电镜结构如图1和2所示。
步骤二,将制备的复合纳米卷的分散液滴涂在清洗干净、表面溅射有厚度为300nm金膜的玻璃基底上,干燥,即得唾液诊断传感器,成品率约为85%。。
在制备过程中测得氧化石墨烯、石墨烯、唾液诊断传感器的表面层的紫外-可见光吸收谱图(见图3)和X射线谱图(见图4),图谱结果说明氧化石墨烯已成功地被还原成石墨烯,而且有金纳米颗粒固定在石墨烯的表面。
本实施方式以萘(NT)为拉曼信标分子对制备的唾液诊断传感器的拉曼增加效率及均一性进行验证,见图5和6。可知,本实施方式制备的唾液诊断传感器具有良好的拉曼增强效果,完全有能力检测出唾液中的标志物分子。
将上述唾液诊断传感器应用于丙型肝炎病毒诊断时,首先主要对丙型肝炎病毒感染患者和健康人的唾液进行检测,从得到的拉曼光谱中寻找到19个与唾液中丙型肝炎病毒相关的峰如图7所示,可用于区别丙型肝炎病毒标志物组合。在对200例临床样本中进行验证时,选择谱图里的19个与丙型肝炎病毒标志物相关的拉曼峰,取其峰面积进行PCA,结果如图8所示,得到三个不同的区域,可见,健康人、丙型肝炎病毒抗原(或抗体)和丙型肝炎病毒RNA所在的区域能明显区分开。这说明应用本实施方式中的唾液传感器能有效的检测出健康人和丙型肝炎病毒感染者。结果表明,在对200例验证样品中进行验证时的准确率高达90%,可适用于针对大众群体的丙型肝炎病毒早期筛查和病程监测。
具体检测方法如下:
在该唾液诊断传感器的表面滴2μl的唾液样品,室温下静置吸附2min。
吸附完成后直接利用HORIBA LabRAM HR Evolution分光光度计对唾液样品中标志物产生的表面增强拉曼图谱中的特征峰进行主成份分析。检测条件:激光器波长785nm,10%的激光功率,积分时间为1s,循环次数为1次。
在得到的谱图里对19个拉曼峰(具体见图7)进行分析,再进行PCA分析(分析结果见图8)。
PCA结果中可以明显区分出健康对照组、丙型肝炎病毒抗原(或抗体)组和丙型肝炎病毒RNA组。准确率大于90%。不同唾液诊断传感器检测同一样品时,结果的相对标准偏差为4.35%。
图9为本实施方式中唾液诊断传感器的构建及应用示意图。
实施例2
本实施例提供了一种唾液诊断传感器包括玻璃基底、金膜以及复合纳米卷,金膜覆盖在玻璃基底上,复合纳米卷分散在所述金膜上,复合纳米卷为在氧化石墨烯材料表面原位生长金纳米颗粒后发生卷曲并将金纳米颗粒包裹在内形成的纳米卷结构。其中,金膜的厚度为200 nm,,复合纳米卷的长度为3μm,直径为100 nm;氧化石墨烯材料的厚度为6 nm;金纳米颗粒的粒径为60 nm。
上述唾液诊断传感器的制备方法如下:
步骤一,对包含有浓度为0.2 mg/ml的氧化石墨烯、浓度为0.8 mmol/L的氯铂酸离子和乙醇溶液共15ml的液相反应体系进行超声反应,制备得到氧化石墨烯包裹金纳米颗粒的复合纳米卷。其中,乙醇溶液中水与乙醇的比例为10:5,超声反应过程中,超声功率为200W,超声时间为60min。
步骤二,将制备的复合纳米卷的分散液滴涂在清洗干净、表面溅射有200 nm金膜的硅片上,干燥,即得唾液诊断传感器,成品率约为75%。
将上述唾液诊断传感器应用于丙型肝炎病毒诊断时,具体检测方法如下:
在该唾液诊断传感器的表面滴4μl的唾液样品,室温下静置吸附4min。
吸附完成后直接利用HORIBA LabRAM HR Evolution分光光度计对唾液样品中标志物产生的表面增强拉曼图谱中的特征峰进行主成份分析。检测条件:激光器波长为785nm,10%的激光功率,积分时间为3s,循环次数为2次。
在得到的谱图里对19个拉曼峰(具体见图7)进行分析,再进行PCA分析(分析结果见图8)。
PCA结果中可以明显区分出健康对照组、丙型肝炎病毒抗原(或抗体)组和丙型肝炎病毒RNA组。准确率高大于85%。不同唾液诊断传感器检测同一样品时,结果的相对标准偏差为5.98%。
实施例3
本实施例提供了一种唾液诊断传感器包括玻璃基底、铜膜以及复合纳米卷,铜膜覆盖在玻璃基底上,复合纳米卷分散在铜膜上,复合纳米卷为在氧化石墨烯材料表面原位生长金纳米颗粒后发生卷曲并将金纳米颗粒包裹在内形成的纳米卷结构。其中,金膜的厚度为200 nm,复合纳米卷的长度为4μm,直径为75 nm;氧化石墨烯材料的厚度为5 nm;金纳米颗粒的粒径为40 nm。。
上述唾液诊断传感器的制备方法如下:
步骤一,对包含有浓度为0.2 mg/ml的氧化石墨烯、浓度为0.3 mmol/L的金离子和乙醇溶液共15ml的液相反应体系进行超声反应,制备得到氧化石墨烯包裹金纳米颗粒的复合纳米卷。其中,乙醇溶液中水与乙醇的比例为5:10,超声反应过程中,超声功率为400W,超声时间为150min。
步骤二,将制备的复合纳米卷的分散液滴涂在清洗干净、表面溅射有500nm铜膜的铜片上,干燥,即得唾液诊断传感器,成品率约为64%。
将上述唾液诊断传感器应用于丙型肝炎病毒诊断时,具体检测方法如下:
在该唾液诊断传感器表示滴下4μl的唾液样品,室温下静置吸附4min。
吸附完成后直接利用HORIBA LabRAM HR Evolution分光光度计对唾液样品中标志物产生的表面增强拉曼图谱中的特征峰进行主成份分析。检测条件:激光器波长为785nm,10%的激光功率,积分时间为2s,循环次数为1次。
在得到的谱图里对19个拉曼峰(具体见图7)进行分析,再进行PCA分析(分析结果见图8)。
PCA结果中可以明显区分出健康对照组、丙型肝炎病毒抗原(或抗体)组和丙型肝炎病毒RNA组,准确率高大于88%。不同唾液诊断传感器检测同一样品时,结果的相对标准偏差为6.54%。
对比例1
本对比例是实施例1的对比例,对比之处在于,氧化石墨烯的浓度为0.05 mg/ml。
结果:实验表明,制备得到的氧化石墨烯包裹金纳米颗粒的复合纳米卷稳定性差,生成的金颗粒少且易发生团聚,导致唾液诊断传感器的成品率低于40%,且拉曼增强效果降低60%。
对比例2
本对比例是实施例1的对比例,对比之处在于,水与乙醇的比例为10:0或0:10;
结果:实验表明,超声反应后,并无金纳米颗粒成生,不具有拉曼增强效果,无法应用于唾液检测。
对比例3
本对比例是实施例1的对比例,对比之处在于,所述氯金酸离子的浓度为5mol/L;
结果:实验表明,反应产生大量的金纳米颗粒,颗粒明显变大,并发生严重的团聚沉降,拉曼增强效率降低,得到的拉曼光谱峰弱,不利于分析判断。
对比例4
本对比例是实施例1的对比例,对比之处在于,所述超声反应过程中,超声功率为500W,超声时间为400 min。
结果:实验表明,超声反应条件过于剧烈,时间长,使氧化石墨烯片破裂成小片结构,无法发生卷曲并将金纳米颗粒包裹,拉曼增强效率降低,得到的拉曼光谱峰弱,不利于分析判断。
对比例5
本对比例是实施例1的对比例,对比之处在于,金膜的厚度为50nm。
结果:实验表明,太薄的金膜容易产生破裂,不利于氧化石墨烯包裹金纳米颗粒的复合纳米卷的分散,并产生背景信号干扰,不利于唾液检测应用。
上述实施方式只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种唾液诊断传感器,其特征在于,包括基底、金属膜和复合纳米卷,所述金属膜覆盖在所述基底上,所述复合纳米卷分散在所述金属膜上,所述复合纳米卷为在石墨烯材料表面原位生长金属纳米颗粒后发生卷曲并将所述金属纳米颗粒包裹在内形成的纳米卷结构。
2.根据权利要求1所述的唾液诊断传感器,其特征在于,所述石墨烯材料与所述金属纳米颗粒的质量比为10:90~50:50。
3. 根据权利要求1所述的唾液诊断传感器,其特征在于,所述金属膜的厚度为200~1000 nm;所述复合纳米卷的长度为0.14~3μm,直径为30~70 nm;所述石墨烯材料的厚度为0.4~3.5 nm;所述金属纳米颗粒的粒径为30~60 nm。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的唾液诊断传感器,其特征在于,所述金属膜为金膜、铜膜或镍膜;所述金属纳米颗粒为金纳米颗粒、银纳米颗粒、铜纳米颗粒或铂纳米颗粒;所述基底为ITO玻璃、硅片、普通玻璃、金属或塑料;所述石墨烯材料为氧化石墨烯、还原氧化石墨烯或石墨烯。
5.一种如权利要求1至4中任一项所述的唾液诊断传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1:对包含有石墨烯材料、金属离子和乙醇溶液的液相反应体系进行超声反应制得所述复合纳米卷,所述复合纳米卷是在石墨烯材料表面原位生长金属纳米颗粒后发生卷曲并将所述金属纳米颗粒包裹在内形成的纳米卷结构;
S2:在基底上溅射金属膜;
S3:将所述复合纳米卷的分散液涂覆于所述金属膜上,经干燥处理后,制得所述唾液诊断传感器。
6. 根据权利要求5项所述的唾液诊断传感器的制备方法,其特征在于,在所述液相反应体系中,所述石墨烯的浓度为0.1~2.0 mg/mL;所述金属离子的浓度为0.1 mol/L~1.5mol/L。
7.根据权利要求5项所述的唾液诊断传感器的制备方法,其特征在于,所述乙醇溶液中,水与乙醇的体积比为8:2~2:8。
8. 根据权利要求5至7中任一项所述的唾液诊断传感器的制备方法,其特征在于,所述超声反应过程中,超声功率为150~500 W;超声时间为60~300 min。
9.一种如权利要求1至4中任一项所述的唾液诊断传感器在检测丙型肝炎中的应用。
10.根据权利要求9所述的唾液诊断传感器在检测丙型肝炎中的应用,其特征在于,检测方法如下:
将唾液样品滴在所述唾液诊断传感器的表面,静置吸附;
对唾液中标志物产生的表面增强拉曼图谱中的特征峰进行主成份分析;
根据所述标志物落在的区域,判断所述标志物是否为丙型肝炎的标志物。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20180216 |