CN112442362B - 一种高负载一氧化氮的荧光碳点及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高负载一氧化氮的荧光碳点及其制备方法和应用。该制备方法包括以下步骤：将壳聚糖接枝树枝状聚酰胺‑胺溶解于乙酸溶液，进行水热反应，反应结束后冷却，固液分离，得到的液体进行干燥，得到荧光碳点；将荧光碳点和甲醇钠溶于甲醇中，在NO氛围中进行NO负载反应；反应结束后洗涤、干燥，得到高负载一氧化氮的荧光碳点。该高负载一氧化氮的荧光碳点生物相容性好，其超高的一氧化氮负载量和良好的光致发光性质有利于实现细菌感染的诊疗一体化，在生物医学工程特别是抗菌领域应用广泛。

Description

一种高负载一氧化氮的荧光碳点及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医学工程领域，特别涉及一种高负载一氧化氮的荧光碳点及其制备方法和应用。
背景技术
细菌感染相关疾病因其高发病率和高致死率而成为人类关注的主要公共卫生问题之一。抗生素是人类目前治疗细菌感染的最有效手段，但耐药菌、多重耐药菌、超级细菌不断地冲击抗生素所铸造的防线。自 1962 年以来，市场上只出现了两类新的抗生素，而其中一种（达托霉素）已报道产生耐药性。其他新抗生素只是旧药物的类似物，2年内便出现耐药性。中国是世界上抗生素滥用最严重的国家。在中国，细菌整体的耐药率要远远高于欧美国家，大约在 45%左右，每年有超过 8 万人因耐药性死亡。英国研究者 Jim O’Neill 发表的《全球抗菌药物耐药回顾》估计，如果目前的细菌耐药性得不到改善，到 2050 年全球每年将有 1000 万人因此死亡，中国每年将有 100 万人因此死亡。因此，人类迫切需要新的抗菌策略以摆脱细菌耐药性的威胁。
近年来发现 NO可破坏细菌的细胞膜以及基因信息并阻止细菌获得能量，具有高效抑菌且不易产生耐药性等特性，使其在抗菌领域的应用受到越来越多的关注，越来越多的可释放NO的新型抗菌材料出现在人们的视野中。
比如：Aveyard 等利用含有仲胺基团聚-ε-赖氨酸作为载体材料负载 NO 制备隐形眼镜凝胶，该凝胶能够在生理条件下较长时间持续的 NO，对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌有明显的杀菌效果，有望用于治疗眼部感染（如微生物性角膜炎）（ACS AppliedMaterials & Interfaces,2019, 11, 37491-37501）。Sadrearhami 等利用聚多巴胺（PDA）来设计具有一氧化氮（NO）释放能力的抗菌涂层，对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌有较高的杀灭效率，并高效抑制了生物膜的附着，有望用于抑制医疗器械表面（ACS AppliedMaterials & Interfaces, 2019, 11, 7320-7329）。美国生物制药公司 Novan（2016 年于纳斯达克上市）研发了一系列针对皮肤疾病（细菌和真菌感染）的 NO 抗菌凝胶，其 SB204产品已进入临床Ⅲ期实验生物膜的形成（https://www.clinicaltrials.gov.）。然而，尽管目前的研究表明 NO 在抗菌领域有着广阔的应用前景，但除了 NO 与其它抗生素或抗菌剂联用、利用刺激响应型材料实现 NO 的控释、利用多尺度结构材料实现 NO 的缓释等提高其抗菌性能的策略外，如何在提高一氧化氮的负载量增强抗菌效果的同时，赋予材料细菌检测等诊断功能，是NO抗菌材料最终实现临床诊疗一体化的关键。荧光碳点（CDs）由于其优异的光学特性（发射可调和光稳定性高）、尺寸小、水溶性好以及制备方便等优点，在生物医学成像、治疗和传感等方面显示了巨大的应用潜力。迄今为止，利用壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺制备生物相容性良好的荧光碳点作为NO供体，可高效负载NO的同时具备细菌成像功能，及其细菌感染的诊疗一体化的应用尚未见报道。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种高负载一氧化氮的荧光碳点的制备方法。该方法首先利用点击化学合成壳聚糖接枝聚酰胺-胺（CS-PAMAM）聚合物；然后通过一锅水热法制备CS-PAMAM荧光碳点（CS-PAMAMCDs）；最后在高压反应釜中利用PAMAM的仲胺基团负载一氧化氮，最终得到可释放一氧化氮的荧光碳点CS-PAMAMCDs/NONOate。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的高负载一氧化氮的荧光碳点。该荧光碳点制备简单，具有优异的荧光性能，生物相容性良好，在细菌感染的诊疗一体化方面显示出重要应用前景。
本发明的再一目的在于提供上述高负载一氧化氮的荧光碳点在生物医学工程中的应用，特别是在细菌感染诊疗一体化中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种高负载一氧化氮的荧光碳点（CS-PAMAMCDs/NONOate）的制备方法，包括以下步骤：
（1）荧光碳点（CS-PAMAMCDs）的合成：将壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺（CS-PAMAM）溶解于乙酸溶液，得到反应体系A；将反应体系A进行水热反应；反应结束后冷却，固液分离，得到的液体进行干燥，得到荧光碳点；
（2）高负载一氧化氮的荧光碳点（CS-PAMAMCDs/NONOate）的合成：将荧光碳点和甲醇钠溶于甲醇中，得到反应体系B；将反应体系B在NO氛围中进行NO负载反应；反应结束后洗涤、干燥，得到高负载一氧化氮的荧光碳点。
步骤（1）中所述的壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺CS-PAMAM的合成参考中国公开文本“CN201711008528.3-一种树枝状大分子修饰的金纳米粒子及其制备方法和应用”。
步骤（1）中所述的乙酸溶液优选浓度为1～3%v/v的乙酸溶液；更优选浓度为2%v/v的乙酸溶液。
步骤（1）中所述的壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺的用量优选为按其在所述的反应体系A中的质量浓度为20～30%计算。
步骤（1）中所述的水热反应的条件优选为于160～200℃反应12～48小时。
步骤（1）中所述的水热反应中的温度优选为按4～6℃/分钟的速度升温；更优选为按5℃/分钟的速度升温。
步骤（1）中所述的固液分离的方式优选为离心。
所述的离心的条件优选为于10000～12000rpm离心10～20min。
所述的干燥的方式优选为冷冻干燥。
所述的冷冻干燥的条件优选为-60～-80℃冷冻干燥48～72h；更优选为-80℃冷冻干燥48～72h。
步骤（2）中所述的荧光碳点和所述的甲醇钠优选按摩尔比1：（200～500）配比计算。
步骤（2）中所述的甲醇是反应介质，其用量基于能溶解反应成分，有利于反应为宜；优选为以每10mL甲醇配比0.1～0.5g甲醇钠计算。
步骤（2）中所述的反应体系B优选通过搅拌10～30分钟得到。
步骤（2）中所述的NO氛围通过如下步骤得到：排除反应器的空气，然后通入NO气体，得到NO氛围。
所述的排除反应器的空气是通过如下步骤得到：先向反应器中通入5～15min氮气使反应器的压强为10～20psi，排除空气。
步骤（2）中所述的NO负载反应的条件优选为于40～80 psi反应3～7天。
步骤（2）中所述的反应结束的操作步骤优选如下：向反应器中通入10～20psi氮气10～20min以排除未反应的NO气体，取出反应产物。
步骤（2）中所述的洗涤的步骤优选如下：先用无水甲醇洗涤2～3次，再用冰无水乙醚洗涤1～2次。
步骤（2）中所述的干燥的条件优选为于室温下真空干燥12～48h。
一种高负载一氧化氮的荧光碳点，通过上述制备方法得到。
上述高负载一氧化氮的荧光碳点作为新型抗菌材料在制备抗菌药物中的应用。
本发明的相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
（1）本发明选用壳聚糖作为碳源，可在较温和的温度通过简易的一锅水热法制备具有良好荧光性质的荧光碳点；
（2）本发明选用树枝状阳离子含炔基的聚酰胺-胺树枝状分子PAMAM作为NO供体，其独枝状结构以及结构中大量的仲胺基团，使得树枝状分子在NO的负载方面存在优势，其仲胺基团密度高，有利于NO的高效负载。
（3）利用壳聚糖接枝聚酰胺-胺制备荧光碳点可大大提高一氧化氮负载量。一方面，制备荧光碳点时，水热反应导致大量伯胺基团丢失，仲胺基团增多，从而增加一氧化氮的负载量；另一方面，其晶体结构中的晶格间隙可吸附一氧化氮气体。
（4）制备的CS-PAMAMCDs/NONOate同时具有光致发光性质和抗菌性能，可实现细菌感染的诊疗一体化；
（5）制备的CS-PAMAMCDs/NONOate生物相容性良好。
附图说明
图1为实施例1所得CS-PAMAM、实施例1所得CS-PAMAMCDs、实施例4所得CS-PAMAMCDs/NONOate的红外光谱图。
图2为实施例3所得CS-PAMAMCDs和实施例6所得CS-PAMAMCDs/NONOate的抗菌效果。
图3为实施例1所得CS-PAMAMCDs和实施例4所得CS-PAMACDs/NONOate的细菌成像激光共聚焦图。箭头所指为蓝色荧光。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。
以下实施例中所述的壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺CS-PAMAM参考中国公开文本“CN201711008528.3-一种树枝状大分子修饰的金纳米粒子及其制备方法和应用”制备得到。干燥的CS-PAMAM是指将CS-PAMAM置于真空干燥箱中，40～80℃条件下干燥12～48小时。
以下实施例中所使用的无水甲醇的制备方法按照以下操作步骤：将氢化钙加入到甲醇中，搅拌6～24小时，然后常压蒸馏，得到无水甲醇；氢化钙的加入量以每500 mL甲醇中加入1～2克氢化钙计。
实施例1
a、参考中国公开文本“CN201711008528.3-一种树枝状大分子修饰的金纳米粒子及其制备方法和应用”的实施例4制备得到壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺（CS-PAMAM）。
b、将壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺CS-PAMAM溶解于浓度为2%v/v的乙酸溶液中，转移至配备有特氟隆瓶子的不锈钢高压釜，在马弗炉中于160℃反应12小时，其中马弗炉按5℃/分钟的速度升温。反应结束后自然降温，10000rpm离心10min去除沉淀，-80℃冷冻干燥48h得到产物CS-PAMAMCDs。所述CS-PAMAM在2%乙酸溶液中的质量浓度为20%。
实施例2
a、参考中国公开文本“CN201711008528.3-一种树枝状大分子修饰的金纳米粒子及其制备方法和应用”的实施例5制备得到壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺（CS-PAMAM）。
b、将壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺CS-PAMAM溶解于浓度为2%v/v的乙酸溶液中，转移至配备有特氟隆瓶子的不锈钢高压釜，在马弗炉中于180 ℃反应36小时，其中马弗炉按5℃/分钟的速度升温。反应结束后自然降温，11000rpm离心15min去除沉淀，-80℃冷冻干燥60h得到产物CS-PAMAMCDs。所述CS-PAMAM在2%乙酸溶液中的质量浓度为25%。
实施例3
a、参考中国公开文本“CN201711008528.3-一种树枝状大分子修饰的金纳米粒子及其制备方法和应用”的实施例6制备得到壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺（CS-PAMAM）。
b、将壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺CS-PAMAM溶解于浓度为2%v/v的乙酸溶液中，转移至配备有特氟隆瓶子的不锈钢高压釜，在马弗炉中于200 ℃反应48小时，其中马弗炉按5℃/分钟的速度升温。反应结束后自然降温，12000rpm离心20min去除沉淀，-80℃冷冻干燥72h，得到产物CS-PAMAMCDs。所述CS-PAMAM在2%乙酸溶液中的质量浓度为30%。
实施例4
称量一定量实施例1得到的CS-PAMAMCDs，和CH3ONa溶于无水CH3OH中，CS-PAMAMCDs和CH3ONa的摩尔比为1:200；CH3OH的用量以每10mLCH3OH溶解0.1g CH3ONa计，搅拌稳定10min后，放置于高压反应釜中并密封，通入5min高纯氮气并维持反应釜压强为10psi，排除反应釜内的空气，然后通入NO气体（40psi），室温下反应3天。反应结束后，通入10min高纯氮气（10psi）将未反应的NO排出，打开反应釜，取出反应产物；用无水甲醇洗涤2次，然后用冰无水乙醚洗涤1次，室温下真空干燥12h，得到产物CS-PAMAMCDs/NONOate。
实施例5
称量一定量实施例2得到的CS-PAMAMCDs，和CH3ONa溶于CH3OH中，PAMAM和CH3ONa的摩尔比为1:300；CH3OH的用量以每10mLCH3OH溶解0.3g CH3ONa计，搅拌稳定30min，放置于高压反应釜中并密封，通入15min高纯氮气并维持反应釜压强为20psi，排除反应釜内的空气，然后通入NO气体（80psi），室温下反应7天。反应结束后，通入20min 高纯氮气（20psi）将未反应的NO排出，打开反应釜，取出反应产物；用无水甲醇洗涤3次，然后用冰无水乙醚洗涤2次，室温下真空干燥48h，得到产物CS-PAMAMCDs/NONOate。
实施例6
称量一定量实施例3得到的CS-PAMAMCDs，和CH3ONa溶于CH3OH中，PAMAM和CH3ONa的摩尔比为1:500；CH3OH用量以每10mLCH3OH溶解0.5g CH3ONa计，搅拌稳定20min后，放置于高压反应釜中并密封，通入10min高纯氮气并维持反应釜压强为15psi，排除反应釜内的空气，然后通入NO气体（80psi），室温下反应5天。反应结束后，通入15min 高纯氮气（15psi）将未反应的NO排出，打开反应釜，取出反应产物；用无水甲醇洗涤2次，然后用冰无水乙醚洗涤1次，室温真空干燥36h，得到产物CS-PAMAMCDs/NONOate。
实施例7
取实施例1所得CS-PAMAM、实施例1所得CS-PAMAMCDs和实施例4所得CS-PAMAMCDs/NONOate通过溴化钾压片法进行红外光谱表征，结果如图1所示。在CS-PAMAMCDs的红外光谱图中发现，壳聚糖的特征峰吡喃糖环（989 cm-1）和糖苷键（1064 cm-1）消失，并出现新的芳香结构的特征峰（1430 cm-1）；同时，C=C在3085 cm-1处的吸收峰和–CH2–在2945 cm-1处的吸收峰增强，说明成功制备出碳点。而且，N–H在1625 cm-1处的弯曲振动峰增强，解释了一氧化氮的高负载量。在CS-PAMAMCDs/NONOate的谱图中发现明显的NONOate特征峰（1250cm-1），证明了一氧化氮的成功负载。
实施例8
取适量实施例4所得CS-PAMAMCDs/NONOate溶解于pH=4.0的0.1M磷酸盐缓冲液中，在37℃恒温摇床2小时后取100μL释放液与100μL格里斯试剂混合，避光反应15min后测定540nm处的吸光度值，最后根据预先测得的NaNO2浓度-吸光度标准曲线（y = 0.0052x−0.0118，R2 = 0.999，y代表OD540nm，x代表NO2 -浓度）计算得到CS-PAMAMCDs/NONOate的NO负载量为8.72μmol/mg，约为聚合物CS-PAMAM/NONOate的NO负载量4.42μmol/mg的2倍。
聚合物CS-PAMAM/NONOate的制备过程如下：将实施例1制备的CS-PAMAM按实施例4的步骤（即用CS-PAMAM替换CS-PAMAMCDs，其他所用物质和反应条件与实施例4相同），制备得到CS-PAMAM/NONOate。
实施例9
取适量实施例5所得CS-PAMAMCDs/NONOate溶解于pH=4.0的0.1M磷酸盐缓冲液中，在37℃恒温摇床2小时后取100μL释放液与100μL格里斯试剂混合，避光反应15min后测定540nm处的吸光度值，最后根据标准曲线（y = 0.0052x−0.0118，R2 = 0.999，y代表OD540nm，x代表NO2 -浓度）计算得到CS-PAMAMCDs/NONOate的NO负载量为15.76μmol/mg，约为聚合物CS-PAMAM/NONOate的NO负载量4.42μmol/mg的3.5倍。
聚合物CS-PAMAM/NONOate的制备过程如下：将实施例2制备的CS-PAMAM按实施例5的步骤（即用CS-PAMAM替换CS-PAMAMCDs，其他所用物质和反应条件与实施例5相同），制备得到CS-PAMAM/NONOate。
实施例10
取适量实施例6所得CS-PAMAMCDs/NONOate溶解于pH=4.0的0.1M磷酸盐缓冲液中，在37℃恒温摇床2小时后取100μL释放液与100μL格里斯试剂混合，避光反应15min后测定540nm处的吸光度值，最后根据标准曲线（y = 0.0052x−0.0118，R2 = 0.999，y代表OD540nm，x代表NO2 -浓度）计算得到CS-PAMAMCDs/NONOate的NO负载量为10.31μmol/mg，约为聚合物CS-PAMAM/NONOate的NO负载量4.42μmol/mg的2.3倍。
聚合物CS-PAMAM/NONOate的制备过程如下：将实施例3制备的CS-PAMAM按实施例6的步骤（即用CS-PAMAM替换CS-PAMAMCDs，其他所用物质和反应条件与实施例6相同），制备得到CS-PAMAM/NONOate。
实施例11
取实施例3所得CS-PAMAMCDs和实施例6所得CS-PAMAMCDs/NONOate各1 mg溶解于500μL生理盐水，并向其中加入500μL（OD600＝0.1）铜绿假单胞杆菌（ATCC9027）置于试管中在37℃培育4h后，取100μL菌液稀释105倍并涂布于琼脂平板上，继续在37℃培养12h。同时设置不加材料且其他条件均相同的对比空白组，杀菌效果图如图2所示。通过对比空白组和材料组发现，经材料处理后的细菌大量减少，CS-PAMAMCDs和CS-PAMAMCDs/NONOate的杀菌率分别为48%和83%，特别的是，负载了一氧化氮后的荧光碳点菌落数进一步减少，杀菌率提升了35%。证明了一氧化氮可有效改善CS-PAMAMCDs的抗菌效果。
对实施例4和实施例5所得的CS-PAMAMCDs/NONOate按上述步骤进行杀菌能力检测，所得结果表明CS-PAMAMCDs/NONOate的杀菌能力相对于CS-PAMAMCDs分别提升了22%和42%。
实施例12
取实施例1所得CS-PAMAMCDs和实施例4所得CS-PAMAMCDs/NONOate各1 mg溶解于500 μL生理盐水，并向其中加入500μL（OD600＝0.1）铜绿假单胞杆菌（ATCC9027）在37℃培育15min后，5000rpm离心15min收集细菌沉淀、移除上清。用生理盐水洗涤细菌，将细菌重悬于生理盐水后通过激光共聚焦显微镜在405nm激发波下观察，结果如图3所示。结果表明，相比生理盐水处理的blank组，CS-PAMAMCDs和CS-PAMAMCDs/NONOate处理后的细菌都能发出明亮的蓝色荧光，证明负载一氧化氮后的荧光碳点依然具有细菌成像的功能。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种高负载一氧化氮的荧光碳点的制备方法，其特征在于步骤如下：
（1）荧光碳点的合成：将壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺溶解于乙酸溶液，得到反应体系A；将反应体系A进行水热反应；反应结束后冷却，固液分离，得到的液体进行干燥，得到荧光碳点；
（2）高负载一氧化氮的荧光碳点的合成：将荧光碳点和甲醇钠溶于甲醇中，得到反应体系B；将反应体系B在NO氛围中进行NO负载反应；反应结束后洗涤、干燥，得到高负载一氧化氮的荧光碳点；
步骤（1）中所述的乙酸溶液是浓度为1～3%v/v的乙酸溶液；
步骤（1）中所述的壳聚糖接枝树枝状聚酰胺-胺的用量按其在所述的反应体系A中的质量浓度为20～30%计算；
步骤（2）中所述的荧光碳点和所述的甲醇钠按摩尔比1：（200～500）配比计算；
步骤（1）中所述的水热反应的条件为于160～200℃反应12～48小时；
步骤（2）中所述的NO氛围通过如下步骤得到：排除反应器的空气，然后通入NO气体，得到NO氛围；
步骤（2）中所述的NO负载反应的条件为于40～80 psi反应3～7天。
2.根据权利要求1所述的高负载一氧化氮的荧光碳点的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的乙酸溶液是浓度为2%v/v的乙酸溶液；
步骤（2）中所述的甲醇的用量以每10mL甲醇配比0.1～0.5g甲醇钠计算。
3.根据权利要求1所述的高负载一氧化氮的荧光碳点的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的固液分离的方式为离心；
所述的干燥的方式为冷冻干燥。
4.根据权利要求3所述的高负载一氧化氮的荧光碳点的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的水热反应中的温度按4～6℃/分钟的速度升温；
所述的离心的条件为于10000～12000rpm离心10～20min；
所述的冷冻干燥的条件为-60～-80℃冷冻干燥48～72h。
5.根据权利要求1所述的高负载一氧化氮的荧光碳点的制备方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的反应体系B是通过搅拌10～30分钟得到的；
步骤（2）中所述的反应结束的操作步骤如下：向反应器中通入10～20psi氮气10～20min以排除未反应的NO气体，取出反应产物。
6.根据权利要求1所述的高负载一氧化氮的荧光碳点的制备方法，其特征在于：
所述的排除反应器的空气是通过如下步骤得到：先向反应器中通入5～15min氮气使反应器的压强为10～20psi，排除空气。
7.根据权利要求1所述的高负载一氧化氮的荧光碳点的制备方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的洗涤的步骤如下：先用无水甲醇洗涤2～3次，再用冰无水乙醚洗涤1～2次；
步骤（2）中所述的干燥的条件为于室温下真空干燥12～48h。
8.一种高负载一氧化氮的荧光碳点，其特征在于：通过权利要求1～7任一项所述的制备方法得到。
9.权利要求8所述的高负载一氧化氮的荧光碳点在制备抗菌药物中的应用。
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