CN115849347A

CN115849347A - 精氨酸抗菌碳点的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN115849347A
Application number: CN202310081781.0A
Authority: CN
Inventors: 赵强; 张欢; 邓益清
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2023-01-19
Filing date: 2023-01-19
Publication date: 2023-03-28

Abstract

本发明公开了一种精氨酸抗菌碳点的制备方法及其应用，属于碳点制备与应用技术领域。本发明以精氨酸为原料制备得到的碳点表面含有大量的有机官能团，如含氮官能团(‑NH₂，＝NH)和含氧官能团(‑COOH，‑C＝O)，并且表面Zeta电位接近正值，而表面带有正电性的碳点可以通过与细菌发生静电相互作用，锚定在细菌表面某些靶点，使得细菌的表面破裂，细菌内成分外流而引起细菌死亡。进一步通过引入氮源，可以制得表面具有高正电荷的碳点，试验结果显示，表面具有高正电荷的碳点具有更好的抗菌活性，其良好的抗菌效果可望在多个领域得到广泛应用。

Description

精氨酸抗菌碳点的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及碳点制备与应用技术领域，具体而言，涉及一种精氨酸抗菌碳点的制备方法及其应用。

背景技术

细菌感染对人类的生命健康造成了重大威胁，抗生素作为解决细菌感染最常见的手段，却无法应付因其滥用而导致的细菌耐药性问题。为此，许多研究开发出了如银纳米粒子、碳纳米管、石墨烯量子点、阳离子共轭聚合物等抗菌材料，但这些材料因存在成本高、毒性大或制备复杂等问题而使得应用受限。碳点则因其具有成本低廉、生物相容性好、制备简单等优势而在抗菌领域备受瞩目。但利用碳点进行抗菌的研究中存在抗菌活性、抗菌效果难把控等问题。

鉴于上述问题的存在，有必要提供一种高抗菌活性及良好生物相容性碳点的制备方法及其应用。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种精氨酸抗菌碳点的制备方法及其应用。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提供一种精氨酸抗菌碳点的制备方法，其以精氨酸为原料，通过一步水热法制备得到碳点。

本发明还提供一种上述制备方法制备得到的碳点在抑菌、杀菌方面的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的一种精氨酸抗菌碳点的制备方法及其应用，其以精氨酸为原料，通过一步水热法制备得到碳点。选择以精氨酸为原料，通过水热反应可以在碳点表面生成大量的有机官能团，如含氮官能团(-NH₂，＝NH)和含氧官能团(-COOH，-C＝O)，且由于碳点表面含有的大量含氮基团在水中结合水分子电离出的氢离子，而使碳点的表面Zeta电位接近正值，表面带有正电性的碳点可以与细菌发生静电相互作用，锚定在细菌表面某些靶点，使得细菌的表面破裂，细菌内成分外流而引起细菌死亡，试验结果显示，本发明制备得到的碳点具有良好的抗菌性能，并且制得的碳点的细胞毒性小，生物相容性良好，可以用于化妆品、无纺布或涂料等可与接触人体的领域。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为DETA-Arg-CDs和Arg-CDs的UV-Vis吸收光谱(A图)，XRD图谱(B图)，FT-IR光谱(C图)；

图2为Arg-CDs的上转换荧光光谱图(A图)，Arg-CDs的下转换荧光光谱图(B图)；

图3为DETA-Arg-CDs的荧光发射光谱图(A图)、EDA-Arg-CDs的荧光发射光谱图(B图)、PPDA-Arg-CDs的荧光发射光谱图(C图)；

图4为DETA-Arg-CDs的TEM图(A图)，高分辨率TEM图(B图)，粒度分布统计(C图)；Arg-CDs-Op的TEM照片(D图)和高分辨率TEM照片(E图)；

图5为DETA-Arg-CDs、Arg-CDs和Ag NP的A：最低抑菌浓度和B：最低杀菌浓度柱形图；

图6为DETA-Arg-CDs暴露于不同时间后，A:E.coli和B:S.aureus的存活率；C&D：与DETA-Arg-CDs作用不同时间后，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌落计数和抗菌率；

图7为DETA-Arg-CDs用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌处理不同时间后通过PI染色获得的荧光图像；

图8为通过MTT测定获得的DETA-Arg-CDs对4T1细胞的毒性结果(A图)；通过MTT法获得的DETA-Arg-CDs对L929细胞的毒性结果(B图)；DETA-Arg-CDs制备抗菌面膜，顶部：大肠杆菌，底部：金黄色葡萄球菌(C图)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例提供的一种精氨酸抗菌碳点的制备方法及其应用进行具体说明。

第一方面，本发明实施例提供一种精氨酸抗菌碳点的制备方法，其以精氨酸为原料，通过一步水热法制备得到碳点。

本发明实施例提供一种精氨酸抗菌碳点的制备方法，其以精氨酸为原料，通过一步水热法制备得到碳点。选择精氨酸为原料的原因在于：精氨酸表面有大量的含氮基团且主要以氨基的形式存在，采用水热法制备得到的碳点表面含有大量的有机官能团，如含氮官能团(-NH₂，＝NH)和含氧官能团(-COOH，-C＝O)，水溶性更好，并且表面Zeta电位接近正值，表面呈正电性的碳点将有利于提升它们在细菌和生物膜微环境中的抗菌活性和生物相容性。

在可选的实施方式中，水热法制备碳点的反应温度为180-240℃，时间为6-8h，pH为3-12。

在可选的实施方式中，还包括：在水热反应过程中加入氮源，制得表面具有高正电荷的碳点。

在可选的实施方式中，氮源包括二乙烯三胺、乙二胺和对苯二胺中的至少一种。在碳点制备过程中，引入含有丰富氨基的氮源，在形成碳点的过程中可使其表面具有更高密度的正电荷，而高表面正电荷更加有利于发挥抗菌作用。

在可选的实施方式中，表面具有高正电荷的碳点的制备包括以下步骤：将精氨酸分散于水中，超声溶解后，再加入氮源，再次超声混合均匀后，移入反应釜内进行水热反应。

在可选的实施方式中，精氨酸与氮源的摩尔质量比为1:1，水热反应的反应温度为180-240℃，时间为6-8h，pH为3-12。

在可选的实施方式中，还包括：将反应物自然冷却至室温后，取出棕色反应液，用0.22微米滤膜过滤，调节pH至中性，然后将液体转移至截留分子量为500Da的透析袋中，并用超纯水透析24小时，冷冻干燥后，得到棕色碳点粉末。

第二方面，本发明实施例还提供一种上述制备方法制备得到的碳点在抑菌、杀菌方面的应用。

在可选的实施方式中，将碳点用于制备同时抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌剂。

在可选的实施方式中，碳点用于可与人体接触的非耐药抗菌无纺布、化妆品或涂料的制作。

下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

称量1.742g精氨酸(0.01mol)并加入20mL超纯水中。超声溶解后，将其放入聚四氟乙烯高压釜中。反应在210℃下进行6小时，pH为12。反应物与烘箱一起冷却至室温后，取出棕色反应液，用0.22微米滤膜过滤，调节至中性pH值，然后将液体转移至透析袋(MWCO＝500Da)中，并用超纯水透析24小时。冷冻干燥后，得到棕色碳点粉末，命名为Arg-CDs-Op。

实施例2

与实施例1的步骤相似，不同之处在于：反应温度为210℃，时间为8h，pH为8。

实施例3

与实施例1的步骤相似，不同之处在于：反应温度为240℃，时间为8h，pH为10。

实施例4

称量1.742g精氨酸(0.01mol)并加入20mL超纯水中。超声溶解后，加入等摩尔质量的二乙烯三胺(DETA)，然后超声处理使其均匀混合，并将其放入聚四氟乙烯高压釜中。反应在210℃下进行6小时。反应物与烘箱一起冷却至室温后，取出棕色反应液，用0.22微米滤膜过滤，调节至中性pH值，然后将液体转移至透析袋(MWCO＝500Da)中，并用超纯水透析24小时。冷冻干燥后，得到棕色碳点粉末，命名为DETA-Arg-CDs。

实施例5

称量1.742g精氨酸(0.01mol)并加入20mL超纯水中。超声溶解后，加入等摩尔质量的乙二胺(EDA)，然后超声处理使其均匀混合，并将其放入聚四氟乙烯高压釜中。反应在210℃下进行6小时。反应物与烘箱一起冷却至室温后，取出棕色反应液，用0.22微米滤膜过滤，调节至中性pH值，然后将液体转移至透析袋(MWCO＝500Da)中，并用超纯水透析24小时。冷冻干燥后，得到棕色碳点粉末，命名为EDA-Arg-CDs。

实施例6

称量1.742g精氨酸(0.01mol)并加入20mL超纯水中。超声溶解后，加入等摩尔质量的对苯二胺(PPDA)，然后超声处理使其均匀混合，并将其放入聚四氟乙烯高压釜中。反应在210℃下进行6小时。反应物与烘箱一起冷却至室温后，取出棕色反应液，用0.22微米滤膜过滤，调节至中性pH值，然后将液体转移至透析袋(MWCO＝500Da)中，并用超纯水透析24小时。冷冻干燥后，得到棕色碳点粉末，命名为PPDA-Arg-CDs。

对比例1

与实施例1的步骤相似，不同之处仅在于：原料为天门冬氨酸，实验结果显示，以天门冬氨酸为原料制得的碳点其表面电位为负值，将所得碳点用于抗菌实验，抗菌性能较差，这是由于：许多研究均表明带有高正电性的碳点可以通过与细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等)发生静电相互作用，锚定在细菌表面某些靶点，使得细菌的表面破裂，细菌内成分外流而引起细菌死亡，因此表面带有负电的碳点无法与细菌发生静电相互作用，因此其抗菌性能较低。

对比例2

与实施例1的步骤相似，不同之处仅在于：原料为丙氨酸，实验结果显示：以丙氨酸为原料制得的碳点其表面电位为负值，但是高于以天门冬氨酸为原料制备的碳点的表面电位，将所得碳点用于抗菌实验，抗菌性能仍然低于以精氨酸为原料制备的碳点。

性能测试

一、基础性能的测试

对制备得到的碳点进行高分辨率透射电镜、紫外可见光吸收光谱、荧光发射光谱、傅里叶变换红外光谱。

二、碳点抗菌性能的测定

LB液体培养基：称取胰蛋白胨及氯化钠各2克、酵母浸粉1克加入200毫升超纯水中，搅拌至固体全部溶解后，用氢氧化钠(1M)调节溶液pH等于7，再用高压蒸汽灭菌锅对液体培养基进行灭菌(20分钟，120℃)。

LB固体培养基：称取胰蛋白胨及氯化钠各2克、酵母浸粉1克、琼脂粉3-4克加入200毫升超纯水中，搅拌使其固体全部溶解后，用氢氧化钠(1M)调节其pH等于7，用高压蒸汽灭菌锅对配制好的培养基进行灭菌(20分钟，120℃)。灭菌完成后待降至适宜温度时及时进行倒平板操作，并将倒好的平板倒置备用。

细菌的纯化及培养

以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为典型的革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌进行抗菌实验研究。用一次性接种环蘸取购买的斜面保藏菌种，用平板划线的方法把细菌接种于倒好的平板上，并在恒温无菌环境下培养16小时，将平板上的单个菌落挑取至无菌液体培养基中，再置37℃恒温条件下振荡培养12小时，得到的菌液用无菌PBS调节至OD₆₀₀＝0.5左右备用。

对革兰氏阴性菌的抗菌性能测定：

平板计数法:

吸取OD₆₀₀＝0.5的大肠杆菌菌液0.5mL至数个无菌离心管中，再分别加入准备好的系列浓度的碳点溶液，最终碳点的浓度分别为50、25、12.5、6.25mg/mL，在37℃恒温共培养两小时。结束后再将碳点与细菌的混合液体用无菌PBS稀释1000倍后取100uL于准备好的平板上均匀涂布，每组涂三个板，阴性对照组中的碳点溶液以无菌PBS代替。将涂好的平板放入37℃培养箱中培养16-24h，通过计数菌落个数表征抗菌性能。抗菌率的计算采用如下公式：

式中：R-抗菌率，100％；A-阴性对照组平均菌落数；B-实验组平均菌落数。

吸光度法测定抗菌性能：

取培养好的细菌3mL(OD₅₇₈＝0.1左右)，加入三种碳点溶液，调节浓度至50mg/mL。将细菌-碳点混合溶液放于37℃培养箱中培养48个小时，每12小时取100uL放于孔板中，利用酶标仪检测OD₅₇₈的值。阴性对照组中的碳点溶液以无菌PBS代替。本实验设置三个平行实验。

对革兰氏阳性菌的抗菌性能测定同上。

三、荧光染料检查细菌凋亡情况

用PBS稀释原液，使得PI溶液浓度在10-50μM之间。

将菌液与DETA-Arg-CDs溶液、EDA-Arg-CDs溶液、PPDA-Arg-CDs溶液(MBC)分别置于37℃的恒温培养箱中孵育不同时间，取出后立即离心并用PBS溶液清洗2次，防止碳点与细菌继续作用。

将配好的PI溶液加入菌体，在37℃的恒温培养箱中孵育20分钟，离心并用无菌PBS洗涤2次。

取适量菌体置于荧光分光光度计和荧光显微镜中检测。

四、细菌表面形貌的观察

2M磷酸缓冲液(PB)的配制：称取2.6g的NaH₂PO₄·H₂O，29g的Na₂HPO₄·12H₂O加入500mL超纯水溶解后得到浓度为2M的PB。

戊二醛固定液的配制：量取戊二醛(25％)1mL，配制好的PB 4mL，用超纯水定容至10mL，最终pH为7.3-7.4，置于4℃冰箱预冷存放。

碳点对细菌的作用：向培养好后的细菌中加入DETA-Arg-CDs，调整碳点浓度为0.02mg/mL(略大于两种碳点对两种细菌的MBC)，放入恒温培养箱(37℃，2h)。

细菌的收集与固定：将细菌-碳点混合物离心(r＝4000,10min)，倒掉上层澄清的碳点溶液，再加入PBS洗涤三次。最后一次离心后收集豌豆大小的菌体沉淀在试管底部，倒掉上清液，沿管壁慢慢加入在冰箱中预冷过的的戊二醛固定液，再次置于4℃冰箱过夜。

细菌形貌的观察：将固定后的细菌用配置好的PBS洗涤三次，每次15分钟左右；用锇酸溶液(1％)固定菌体1至2小时后，再次用PBS(0.1M，pH＝7.0)洗涤三次；用不同浓度的乙醇溶液(30％-90％)依次对细菌菌体处理15min使其脱水，接着两次用纯乙醇处理20min使其完全脱水。用乙酸异戊酯与乙醇的等体积混合溶液处理细菌菌体0.5h，最后用纯乙酸异戊酯处理细菌菌体1h，将菌体置于临界点干燥后进行镀膜，观察。

测试结果：

图1中的A图是DETA-Arg-CDs和Arg-CDs-Op水溶液的UV-Vis光谱。可以发现，DETA-Arg-CDs在275nm附近具有吸收峰，其对应于n-π*跃迁(C＝O，C＝n)，而在240nm附近的吸收峰对应于π-π*跃迁。图1中的B图是DETA-Arg-CDs和Arg-CDs-Op的XRD图，在2θ＝25°附近出现钝宽峰，这与石墨(002)面的衍射峰一致，表明两个碳点都具有类似石墨的结构。图1中的C图是DETA-Arg-CDs和Arg-CDs-Op的FT-IR光谱，可以得出结论，它们的表面官能团为O-H/N-H(3000-3500cm^-1)、C-N(1330-1400cm^-1)，C＝N(1600-1650cm^-1)和C＝O(1590cm^-1)。这些证明碳点保留了起始物种的氨基和亚氨基。

图2中的A是Arg-CDs的上转换荧光图、B图是Arg-CDs的下转换荧光图，当用波长等于600nm的光激发时，Arg-CDs表现出最佳的上转换荧光，最佳发射波长在350nm左右，处于紫外区域，有应用于上转换紫外杀菌的前景；当用波长等于390nm的光激发时，Arg-CDs在440nm处发出最佳的下转换荧光。对于上转换荧光，发射光随激发光的红移先保持基本不变，随后略微有红移；对于下转换荧光，发射光随激发光波长增大而持续红移。

图3是DETA-Arg-CDs、EDA-Arg-CDs、PPDA-Arg-CDs的荧光发射光谱图，三种碳点均无上转换荧光，最佳激发波长分别是410nm、400nm、380nm，最佳发射波长均在480nm左右，这可能与三种碳点由同一碳源制备，拥有类似的碳核结构有关。

如图4中A图所示，DETA-Arg-CDs类似于球形，在水溶液中具有良好的分散性。B图是高分辨率TEM图像，显示了0.35nm的晶格间距。该值与石墨烯的层间距一致，表明碳点内部具有类似石墨的结构。C图是DETA-Arg-CDs的粒度分布统计数据可得DETA-Arg-CDs的平均粒度约为9.06nm。该值远大于Arg-CDs-Op的平均尺寸(见图4中的E图)，表明DETA掺杂成功。同时，Arg-CDs-Op趋于聚集(见图4中的D图)，这可能与其Zeta电位的绝对值较小有关。

大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC分别为2.37和18.97mg/mL(见图5)。为了更直观地显示DETA-Arg-CDs的抗菌效果，将DETA-Arg-CDs对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC、MBC值与具有良好抗菌性能的Arg-CDs和Ag纳米颗粒的相应值进行了比较。可以看出，没有DETA掺杂的Arg-CDs-Op与其他药物相比抗菌效果最差。DETA-Arg-CDs具有良好的抗菌效果，其对金黄色葡萄球菌的MIC甚至小于银纳米颗粒。与一些最新碳点的MIC相比，DETA-Arg-CDs也具有优势。这证明DETA-Arg-CDs在抗菌领域具有良好的前景。

图6为DETA-Arg-CDs暴露于不同时间后，A：E.coli和B:S.aureus的存活率；C&D：与DETA-Arg-CDs作用不同时间后，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌落计数和抗菌率。如图6中的A图所示，在0-25分钟内，大肠杆菌菌落数量减少，并在5分钟时接近0，表明DETA-Arg-CDs对大肠杆菌具有良好的抑制作用。如图6中的D图所示，对大肠杆菌的抗菌率在5分钟时超过90％，在25分钟时达到100％。类似地，在0-25分钟内，金黄色葡萄球菌的菌落数减少，并在2分钟时接近0，表明DETA-Arg-CDs对金黄色葡萄杆菌具有良好的抑制作用。抗菌率在2分钟时超过90％，在25分钟时达到100％。DETA-Arg-CDs对金黄色葡萄球菌的抗菌效率高于大肠杆菌，这可能归因于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的不同表面结构。

如图7所示，DETA-Arg-CDs用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌处理不同时间，然后用PI染色，并在荧光显微镜下观察。两种细菌的红色荧光都随着与碳点相互作用时间的延长而增加。结果表明，PI-DNA复合物越来越多。

使用4T1细胞和L929细胞探索DETA-Arg-CDs的细胞毒性，结果分别如图8中的A图和B图所示。当DETA-Arg-CDs浓度为5、10、50、100μg/mL时，4T1细胞的存活率超过90％。特别是当浓度为5和10μg/mL时，细胞存活率高于对照组，这可能与DETA-Arg-CDs的前体氨基酸有关。对于L929细胞，当碳点浓度为5μg/mL时，细胞存活率超过90％。当DETA-Arg-CDs的浓度为10ug/mL时，细胞活力受到轻微影响。总之，制备的碳点在抗菌浓度范围内显示出良好的生物相容性。

用DETA-Arg-CDs溶液(MBC)喷洒的无菌掩模块分别固定在涂有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的琼脂平板上，培养16小时后获得的平板如图8中的C图所示。在涂有DETA-Arg-CDs的掩模块周围出现了没有细菌生长的抑菌区，表明DETA-Arg-CDs对这两种细菌都有抗菌作用。用游标卡尺测量抑制区的直径，发现对大肠杆菌的抑制区为3cm，对金黄色葡萄球菌的抑制区是3.5cm，这进一步表明DETA-Arg-CDs对金黄色杆菌的抗菌活性略优于大肠杆菌。

综上，本发明实施例提供了一种精氨酸抗菌碳点的制备方法及其应用。分别以碱性氨基酸精氨酸、中性氨基酸丙氨酸、酸性氨基酸天门冬氨酸三种不同酸碱性的氨基酸为原料，通过一步水热法制备了三种碳点，试验结果显示：三种碳点的抗菌效果为：Arg-CDs>Ala-CDs>Asp-CDs。以精氨酸为原料制得的碳点具有更好的抗菌活性，推测其原因可能是：由于精氨酸表面有大量的含氮基团且主要以氨基的形式存在，经反应后，碳点表面生成了大量的有机官能团，如含氮官能团(-NH₂，＝NH)和含氧官能团(-COOH，-C＝O)，碳点的表面Zeta位接近正值，而表面带有正电性的碳点可以与细胞膜表面带负电的细菌发生静电相互作用，锚定在细菌表面某些靶点，使得细菌的表面破裂，细菌内成分外流而引起细菌死亡，进一步地，发明人在碳点的制备过程中还引用了氮源，获得表面具有更高密度正电荷的碳点，试验结果显示，本发明实施例制备得到的DETA-Arg-CDs对金黄色葡萄球菌的MIC低于银纳米粒子，证明所制得的DETA-Arg-CDs在抗菌方面拥有巨大潜力，将DETA-Arg-CDs应用于制备抗菌口罩，结果显示：喷有DETA-Arg-CDs的口罩无纺布对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌两种细菌均有较大抑菌圈，鉴于所制备得到的碳点具有良好的水溶性、生物相容性和低细胞毒性，本发明实施例制备得到的碳点可望更加广泛用于可与人体接触的非耐药性无纺布、化妆品或涂料等制作。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种精氨酸抗菌碳点的制备方法，其特征在于，其以精氨酸为原料，通过一步水热法制备得到碳点。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，水热法制备碳点的反应温度为180-240℃，时间为6-8h，pH为3-12。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括：在水热反应过程中加入氮源，制得表面具有高正电荷的碳点。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述氮源包括二乙烯三胺、乙二胺和对苯二胺中的至少一种。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，表面具有高正电荷的碳点的制备包括以下步骤：将精氨酸分散于水中，超声溶解后，再加入氮源，再次超声混合均匀后，移入反应釜内进行水热反应。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述精氨酸与所述氮源的摩尔比为1：1，水热反应的反应温度为180-240℃，时间为6-8h，pH为3-12。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，还包括：将反应物自然冷却至室温后，取出棕色反应液，用0.22微米滤膜过滤，调节pH至中性，然后将液体转移至截留分子量为500Da的透析袋中，放入超纯水透析，透析结束后，取出碳点溶液冷冻干燥后，得到棕色碳点粉末。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法制备得到的碳点在抑菌、杀菌方面的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述碳点用于制备同时抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌剂。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述碳点用于可与人体接触的非耐药抗菌无纺布、化妆品或涂料的制作_。