CN112410344A - 一种对PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN及其应用 - Google Patents

一种对PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种对PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG‑ODN及其应用，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。通过以筛选出11个CpG‑ODN片段，将筛选出的11个CpG‑ODN片段首尾相连形成含有许多以‑CG‑二核苷酸为一个CpG基元的DNA序列，命名为“Multi‑CpG”。将以‑GTCGTT‑作为一个CpG基元的DNA序列：TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT替换上述“Multi‑CpG”中长度相同的一段DNA序列，命名为“Multi‑CpG‑Mix”。将多个“Multi‑CpG‑Mix”首尾连接成为一个CpG基元的DNA序列，再将该CpG基元的DNA序列通过XbaI和EcoRI两个酶切位点插入多拷贝克隆载体Puc19衍生载体FVX中，以基因合成的手段分别构建含有许多个“Multi‑CpG‑Mix”的重组质粒FVX‑CpG，再经试验筛选所得，不仅能诱导猪体内天然免疫功能激活，还能激活猪体内对PRRSV的获得性免疫功能。

Description

一种对PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种对PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN及其应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是猪繁殖与呼吸综合征 (PRRS)的致病因子，是引起母猪繁殖障碍及新生仔猪呼吸道症状和高死亡率的新RNA病毒传染病病毒。PRRSV最早于1987年在美国发现，1991年荷兰人Wensvoot首次从发病仔猪和母猪体内分离到了该病毒，随后德国、美国、英国等也分离到了该病毒。目前，该病毒已遍及北美洲、欧洲，在全球范围内传播，且各地相继发生流行性感染，给养猪行业造成严重的经济损失。虽然，猪繁殖与呼吸综合征灭火病毒疫苗已经得到了广泛使用，但伴随有副作用，且仅有部分免疫保护作用，使得对猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫保护效果不理想。
CpG基序(CpG motifs)是指一类以非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤 (-CG-)二核苷酸为一个CpG基序的DNA序列，即就是免疫激活单元。大量研究表面：CpG基序是一种强有力的非特异性免疫刺激DNA序列，能够直接或间接激活T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞等多种免疫细胞。将含有CpG基序的DNA称为CpG-DNA，将人工合成的含有非甲基化CpG基序的寡聚脱氧核糖核苷酸(ODN)称为 CpG-ODN。经合成CpG-ODN进行试验研究，发现细菌DNA的免疫刺激作用，仅与其中具有特异性侧翼的非甲基化CpG核苷酸有关；与细菌DNA不同，哺乳动物本身的DNA分子不具有免疫刺激作用。哺乳动物和其他脊椎动物DNA分子中CpG基序出现的频率很低，且 60-90％的CG基序中胞嘧啶第五碳原子发生甲基化。
在1995年，Arthur M.Krieg等人通过分析人工合成的不同序列 CpG-ODN的免疫刺激活性，得出：CpG-ODN需有一定的长度，在一个CpG-ODN中可以有一个或多个CpG基序，CpG基序两侧特异的嘌呤和嘧啶以及CpG基序之间相隔碱基的不同，都会影响CpG基序的免疫刺激类型和强度。因此，有研究者就猪先天性及获得性免疫的有效提升，提供了一种CpG-ODN以及含有该CpG-ODN的重组质粒、制剂，例如专利申请号为201910229571.5的对猪具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN及其作用中的报道，该报道中研究了CpG基序个数(含 -CG-基元个数)对CpG-ODN的免疫刺激作用和强度等。在“Zhu,H.F., Li,G.F.,Zhu,J.Z.,Lu,C.,Shao,G.Q.,Zhang,Z.S.,2003.Difference between immunostimulation activity of Kand D types of CpG oligodeoxynucleotides in peripheral blood mononuclearcells of porcine. ActaNanJing Med.Univ.23,542–544.”中报道：具有免疫激活作用的CpG基序还包括以-GTCGTT-作为一个CpG基元的DNA序列： TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT。但是，对于以-GTCGTT-作为CpG基元的DNA序列免疫刺激强度与 -GTCGTT-基元个数有何关系，并未得到研究。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种对 PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN及其应用。
具体是通过以下技术方案得以实现的：
本发明创造的目的之一在于提供对PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，克服了传统 CpG-ODN在体内不稳定性、序列多样性以及个体差异性等特征，对 PRRSV具有特异性免疫刺激作用，能够诱导猪体内对猪繁殖与呼吸综合征的免疫免疫反应作用，降低猪繁殖与呼吸综合征发生率，降低养猪行业经济损失。
本发明创造的目的之二在于提供含有上述CpG-ODN的重组质粒，该重组质粒为FVX-CpG，其中所述FVX为载体，核苷酸序列如 SEQ ID NO：2所示，制备成本低，经XbaI和EcoRI两个酶切位点插入CpG-ODN，以基因合成手段构建而成。
本发明创造的目的之三在于提供上述CpG-ODN、重组质粒在制备治疗和/或预防PRRSV的制剂中的应用。
本发明创造的目的之四在于提供一种治疗和/或预防PRRSV的制剂，所述制剂含有上述重组质粒10-100ug/mL的PBS溶液。
为了实现上述各个目的，本发明创造是经以下操作方案予以实现的：
通过以筛选出11个CpG-ODN片段，将筛选出的11个CpG-ODN片段首尾相连形成含有许多以-CG-二核苷酸为一个CpG基元的DNA序列，命名为“Multi-CpG”。将以-GTCGTT-作为一个CpG基元的DNA 序列：TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT替换上述“Multi-CpG”中长度相同的一段DNA序列，命名为“Multi-CpG-Mix”。
将“Multi-CpG-Mix”通过XbaI和EcoRI两个酶切位点插入多拷贝克隆载体Puc19衍生载体FVX中，以基因合成的手段分别构建含有一个“Multi-CpG-Mix”免疫激活单元的重组质粒FVX-Multi-CpG-Mix。
为了进一步探索以-GTCGTT-作为CpG基元的DNA序列免疫刺激强度与-GTCGTT-基元个数有何关系，重组质粒FVX- Multi-CpG-Mix中“Multi-CpG-Mix”个数进行筛选，将多个“Multi-CpG-Mix”首尾连接成为一个CpG基元的DNA序列，再将该 CpG基元的DNA序列通过XbaI和EcoRI两个酶切位点插入多拷贝克隆载体Puc19衍生载体FVX中，以基因合成的手段分别构建含有许多个“Multi-CpG-Mix”的重组质粒FVX-CpG并通过测序验证，再进行免疫刺激强度试验，得到含有3个“Multi-CpG-Mix”的重组质粒FVX-CpG 免疫刺激强度较优。该制剂不仅能够作为免疫激活剂，有效激活猪体内对PRRSV的天然免疫功能，替代或部分替代PRRSV治疗和/预防用抗生素；还能够有效地激活猪体内对PRRSV的获得性免疫功能，可作为免疫佐剂，提高疫苗保护效果，减少PRRSV的发病率，降低养殖成本。
优选地，所述制剂作为PRRSV免疫激活剂时，注射剂量为 0.3-0.5mL/kg；使用时，是在猪发病高峰期来临前一周，进行皮下注射给药，在一周后再给药一次。
优选地，所述制剂作为PRRSV免疫佐剂时，其注射剂量为 0.2-1mL/kg。直接与每一头猪使用疫苗混匀后给药，在给药一周后，再给药一次。
与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
①本发明创造的CpG-ODN能够对PRRSV具有特异性免疫刺激作用，不仅能诱导猪体内天然免疫功能激活，还能激活猪体内对PRRSV 的获得性免疫功能，提高猪体内对PRRSV的免疫反应诱发作用，降低 PRRSV发病率，降低猪养殖成本。
②本发明创造提供的含有CpG-ODN的制剂对机体毒副作用小，具有巨大潜力，能够广泛应用于生猪养殖业，降低生产成本，减少 PRRSV发病率，提高存活率和养殖效率。
附图说明
图1为CpG-ODN限制性酶切位点图，其中TCTAGA是XbaI限制性酶切位点；GAATTC是EcoRI限制性酶切位点。
图2为FVX载体限制性酶切位点图，其中TCTAGA是XbaI限制性酶切位点；GAATTC是EcoRI限制性酶切位点。
图3为CpG-ODN构建流程图。
图4为重组质粒构建流程图。
图5为双酶切验证结果图。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，则是能够从商业途径直接获得的试剂或材料。
实施例
1、特异性CpG-ODN片段的筛选
筛选方法：按照常规技术，定向筛选CpG-ODN片段，结果如下表1所示。
表1筛选的CpG-ODN片段
Figure RE-GDA0002877205100000051
以上筛选的CpG-ODN片段是根据现有相关人员对相关序列研究基础上作出的筛选，例如：
C274参考文献为“Marshall,J.D.,Higgins,D.,Abbate,C.,et al. (2004).Polymyxin B enhances ISS-mediated immune responses across multiplespecies.Cellular Immunology,229,93–105.”和“Teleshova,N., Kenney,J.,Williams,V.,et al.(2006).CpG-C ISS-ODN activation of blood-derived B cells fromhealthy and chronic immunodeficiency virus-infectedmacaques.JournalofLeukocyte Biology,79,257–267.”。
BCG-A4a参考文献为“Yamamoto,S.,Yamamoto,T.,Nojima,Y.,et al.(2002).Discovery of immunostimulatory CpG-DNA and its application to tuberculosisvaccine development.Japanese Journal of Infectious Disease,55,37–44.”。
ODN1681参考文献为“Jorgensen,J.B.,Johansen,L.H.,Steiro,K., et al.(2003).CpG DNA induces protective antiviral immune responses in Atlanticsalmon(Salmo salar L.).Journal of Virology,77, 11471–11479.”。
ODN K3和ODN2006P*参考文献为“Smith,R.L.,Chong,T.W., Hughes,M.G.,et al.(2004).Impact of immunomodulatory oligodeoxynucleotides on cytokineproduction in the lipopolysaccharide-stimulated human whole bloodmodel.Surgery,136, 464–472.”。
ODN2395参考文献为“Vollmer,J.,Weeratna,R.,Payette,P.,et al. (2004).Characterization ofthree CpG oligodeoxynucleotide classes with distinctimmunostimulatory activities.European Journal of Immunology, 34,251–262.”。
ODN1018P*参考文献为“Marshall,J.D.,Higgins,D.,Abbate,C., et al.(2004).Polymyxin B enhances ISS-mediated immune responses across multiplespecies.Cellular Immunology,229,93–105.”。
AACGTC-30参考文献为“Iho,S.,Yamamoto,T.,Takahashi,T.,et al. (1999).Oligodeoxynucleotides containing palindrome sequences with internal 50CpG-30act directly on human NK and activated T cells to induce IFN-gamma productionin vitro.Journal of Immunology,163, 3642–3652.”。
MB-4531-F14、MB-5519和MB-4531参考文献为“Lee,K.W.,Jung, J.,Lee,Y.,etal.(2006).Immunostimulatory oligodeoxynucleotide isolated from genome widescreening of Mycobacterium bovis chromosomal DNA.MolecularImmunology,43,2107–2118.”。
2、构建重组质粒
2.1替换对比构建
将筛选出来的CpG-ODN片段首尾相连以形成含有许多以-CG-二核苷酸为一个CPG基元的DNA序列为“Multi-CpG”，即免疫激活单元。
将在“Zhu,H.F.,Li,G.F.,Zhu,J.Z.,Lu,C.,Shao,G.Q.,Zhang,Z.S.,2003.Difference between immunostimulation activity of K and D types of CpGoligodeoxynucleotides in peripheral blood mononuclear cells of porcine.ActaNanJing Med.Univ.23,542–544.”中以-GTCGTT-作为一个CpG基元的DNA序列： TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT替换上述“Multi-CpG”中长度相同的一段DNA序列，命名为“Multi-CpG-Mix”。
将“Multi-CpG”和“Multi-CpG-Mix”分别通过XbaI和EcoRI两个酶切位点插入高拷贝克隆载体Puc19衍生载体FVX(序列如SEQ ID NO：2所示)中，以基因工程合成手段分别构建重组质粒FVX- Multi-CpG和FVX-Multi-CpG-Mix。
2.2“Multi-CpG-Mix”个数筛选构建
将多个“Multi-CpG-Mix”首尾连接成为一个CpG基元的DNA序列，再将该CpG基元的DNA序列通过XbaI和EcoRI两个酶切位点插入多拷贝克隆载体Puc19衍生载体FVX中，以基因合成的手段分别构建含有许多个“Multi-CpG-Mix”的重组质粒FVX-CpG并通过测序验证。具体构建如下表2所示：
表2构建FVX-CpG并命名
Figure RE-GDA0002877205100000081
2.3配制制剂
将重组质粒FVX-Multi-CpG和FVX-Multi-CpG-Mix以及 FVX-CpG-1至FVX-CpG-7分别与无菌PBS溶液配制成对应重组质粒编号的制剂，其中重组质粒含量为40ug/mL；所采用的无菌PBS溶液含重量百分比计为0.4％NaCl，0.05％KCl，0.0213％Na2HPO4，0.029％KH2PO4，余量去离子水。无菌PBS溶液制备方法是将向水中加入氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾搅拌至溶解后，加水定量至1L，置于常压灭菌锅内，于120℃下灭菌处理30min，即可。
3、试验研究
3.1毒性研究：
选择10日龄健康小白鼠45只，随机分为9组，每组5只，每只小白鼠注射含重组质粒的制剂0.5mL/kg，并对小白鼠按照常规饲养方法进行饲喂，饲喂50d后，观察小白鼠死亡率和组织病变情况，其结果如下表3所示：
表3
Figure RE-GDA0002877205100000082
Figure RE-GDA0002877205100000091
由表3结果显示：重组质粒：FVX-Multi-CpG-Mix、FVX-Multi-CpG 和FVX-CpG-1至FVX-CpG-7组小白鼠死亡率均为零，且经组织解剖未发现有明显的病变，各组小白鼠活泼好动，可见，各组对小白鼠安全无毒害。
3.2细胞学试验研究：
以10-20日龄长白猪种的淋巴细胞作为试验细胞(PBMC)，采用编号为重组质粒：FVX-Multi-CpG-Mix、FVX-Multi-CpG和FVX-CpG-1 至FVX-CpG-7制剂作为免疫刺激制剂，以猪繁殖与呼吸综合征病毒作为病原菌，分析猪免疫活性因子IP-10和IFN-γ的表达情况，其结果如表4所示：
表4：PRRSV感染猪PBMC后FVX-CpG制剂对IP-10、IFN-γ诱导效果
Figure RE-GDA0002877205100000092
由表4结果显示，FVX-CpG-2组能够显著提升免疫活性因子IFN- γ和IP-10的表达，且该组经测序：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；表明：含核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的重组质粒FVX-CpG-2 具备良好的抗PRRSV感染的作用，具有良好的先天性免疫提升能力。
3.3免疫性保护动物试验研究：
3.3.1先天性免疫试验
取健康，且体重约5kg的长白猪种63头，随机分成9组，每组7头，各组饲养情况均相同，并作为试验对象。采用编号为重组质粒： FVX-Multi-CpG-Mix、FVX-Multi-CpG和FVX-CpG-1至FVX-CpG-7制剂作为免疫刺激，皮下肌肉注射0.3mL/kg，7d后，再采用相同的制剂再次注射。在第二次注射结束后，采用PRRSV给每头仔猪皮下接种病毒，在接种一周后，测定每组特异抗体滴度值log2 (X)值，其结果如下表5所示：
表5 7d后的特异抗体滴度值log2 (X)值
Figure RE-GDA0002877205100000101
3.3.2获得性免疫试验
取健康，且体重约5kg的长白猪种27头，随机分成9组，每组3头，各组饲养情况均相同，并作为试验对象。采用编号为重组质粒：FVX-Multi-CpG-Mix、FVX-Multi-CpG和FVX-CpG-1至FVX-CpG-7制剂作为疫苗佐剂，从市场上购买现有PRRSV活疫苗(VR2332株疫苗) 作为试验用疫苗，注射FVX-CpG+疫苗制剂，皮下肌肉注射0.3mL/kg， 7d后，抽取血样5mL，对阳性血清进行稀释，ELISA反应，测定每组特异抗体滴度值log2 (X)值，其结果如下表6所示：
表6 7d后的特异抗体滴度值log2 (X)值
Figure RE-GDA0002877205100000102
Figure RE-GDA0002877205100000111
3.3.3结论
从表5和表6结果显示可见，含核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的重组质粒FVX-CpG制剂在预防方面和治疗方面效果更好。
最后，需要说明的是，本发明创造是基于现有生物基因工程技术基础上，经人工筛选CpG-ODN片段，将筛选出来的11条CpG-ODN片段经首尾连接形成多个以-CG-二核苷酸为一个CPG基元的DNA序列的免疫激活单元(“Multi-CpG”)；再经现有技术研究所得的以 -GTCGTT-作为一个CpG基元的DNA序列替换上述“Multi-CpG”中长度相同的一段DNA序列的免疫激活单元；并对以-GTCGTT-作为一个 CpG基元的DNA序列替换“Multi-CpG”中长度相同的一段DNA序列不同基元个数形成含有不同数量的以-GTCGTT-作为一个CpG基元的免疫激活单元的DNA序列；分别将所得的各个免疫激活单元通过XbaI 和EcoRI两个酶切位点插入高拷贝克隆载体Puc19衍生载体FVX(序列如SEQ ID NO：2所示)中，以基因工程合成手段构建含有相应免疫激活单元的重组质粒，并经试验研究获得。对于其他未尽事宜，本领域技术人员参照现有技术中所公开的技术手段，或者本领域技术人员所熟知的公知常识或者常规技术手段加以实现即可。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表 sequence listing
<110>中国科学院昆明动物研究所
<120>一种对PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN及其应用
<140>202011156239.X
<141>2020-11-19
<160>2
<170>SIPOSequenceListing 1.0
<210>1
<211>720
<212>DNA
<213>人工合成序列（Synthetic sequence）
<400>1
TCTAGATCGT CGAACGTTCG AGATGATACC GATGACGTCG 40
CCGGTGACGG CACCACGACC GATGTCGTTG CGGTGACGTC 80
GTCGTTTTCG GCGCGCGCCG TGACTGTGAA CGTTCGAGAT 120
CGTTTTGTCG TTACCGATAA CGTCGCCGGT GACGGCACCA 160
CGTCGTCGTT TTGTCGTTTT GTCGTTTTGT CGTTTTGTCG 200
TTCTGGCGTA GCGCCTCGGC CTATCGACTC TCGAGCGTTC 240
TCTCGTCGAA CGTTCGAGAT GATACCGATG ACGTCGCCGG 280
TGACGGCACC ACGACCGATG TCGTTGCGGT GACGTCGTCG 320
TTTTCGGCGC GCGCCGTGAC TGTGAACGTT CGAGATCGTT 360
TTGTCGTTAC CGATAACGTC GCCGGTGACG GCACCACGTC 400
GTCGTTTTGT CGTTTTGTCG TTTTGTCGTT TTGTCGTTCT 440
GGCGTAGCGC CTCGGCCTAT CGACTCTCGA GCGTTCTCTC 480
GTCGAACGTT CGAGATGATA CCGATGACGT CGCCGGTGAC 520
GGCACCACGA CCGATGTCGT TGCGGTGACG TCGTCGTTTT 560
CGGCGCGCGC CGTGACTGTG AACGTTCGAG ATCGTTTTGT 600
CGTTACCGAT AACGTCGCCG GTGACGGCAC CACGTCGTCG 640
TTTTGTCGTT TTGTCGTTTT GTCGTTTTGT CGTTCTGGCG 680
TAGCGCCTCG GCCTATCGAC TCTCGAGCGT TCTCGAATTC 720
<110>中国科学院昆明动物研究所
<120>一种对PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN及其应用
<140>202011156239.X
<141>2020-11-19
<160>2
<170>SIPOSequenceListing 1.0
<210>2
<211>2878
<212>DNA
<213>人工合成序列（Synthetic sequence）
<400>2
AAAAATAAAC AAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA AAAGTGCCAC 50
CTGACGTCTA AGAAACCATT ATTATCATGA CATTAACCTA TAAAAATAGG 100
CGTATCACGA GGCCCTTTCG TTGTAAAACG ACGGCCAGTC GAACCACGCA 150
ATGCGTCTCG ATCCGCAGTG TCTTGCGTCT CTTCTAGATC GTCGAACGTT 200
CGAGATGATA CCGATGACGT CGCCGGTGAC GGCACCACGA CCGATGTCGT 250
TGCGGTGACG TCGTCGTTTT CGGCGCGCGC CGTGACTGTG AACGTTCGAG 300
ATCGTTTTGT CGTTACCGAT AACGTCGCCG GTGACGGCAC CACGTCGTCG 350
TTTTGTCGTT TTGTCGTTTT GTCGTTTTGT CGTTCTGGCG TAGCGCCTCG 400
GCCTATCGAC TCTCGAGCGT TCTCTCGTCG AACGTTCGAG ATGATACCGA 450
TGACGTCGCC GGTGACGGCA CCACGACCGA TGTCGTTGCG GTGACGTCGT 500
CGTTTTCGGC GCGCGCCGTG ACTGTGAACG TTCGAGATCG TTTTGTCGTT 550
ACCGATAACG TCGCCGGTGA CGGCACCACG TCGTCGTTTT GTCGTTTTGT 600
CGTTTTGTCG TTTTGTCGTT CTGGCGTAGC GCCTCGGCCT ATCGACTCTC 650
GAGCGTTCTC TCGTCGAACG TTCGAGATGA TACCGATGAC GTCGCCGGTG 700
ACGGCACCAC GACCGATGTC GTTGCGGTGA CGTCGTCGTT TTCGGCGCGC 750
GCCGTGACTG TGAACGTTCG AGATCGTTTT GTCGTTACCG ATAACGTCGC 800
CGGTGACGGC ACCACGTCGT CGTTTTGTCG TTTTGTCGTT TTGTCGTTTT 850
GTCGTTCTGG CGTAGCGCCT CGGCCTATCG ACTCTCGAGC GTTCTCGAAT 900
TCAGAGACGG AGTCACTGCC AACCGAGACG GTCATAGCTG TTTCCTGTGT 950
GCCGCTTCCT CGCTCACTGA CTCGCTGCGC TCGGTCGTTC GGCTGCGGCG 1000
AGCGGTATCA GCTCACTCAA AGGCGGTAAT ACGGTTACCC ACAGAATCAG 1050
GGGATAACGC AGGAAAGAAC ATGTGAGCAA AAGGCCAGCA AAAGGCCAGG 1100
AACCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGGCGTTT TTCCATAGGC TCCGCCCCCC 1150
TGACGAGCAT CACAAAAATC GACGCTCAAG TCAGAGGTGG CGAAACCCGA 1200
CAGGACTATA AAGATACCAG GCGTTTCCCC CTGGAAGCTC CCTCGTGCGC 1250
TCTCCTGTTC CGACCCTGCC GCTTACCGGA TACCTGTCCG CCTTTCTCCC 1300
TTCGGGAAGC GTGGCGCTTT CTCATAGCTC ACGCTGTAGG TATCTCAGTT 1350
CGGTGTAGGT CGTTCGCTCC AAGCTGGGCT GTGTGCACGA ACCCCCCGTT 1400
CAGCCCGACC GCTGCGCCTT ATCCGGTAAC TATCGTCTTG AGTCCAACCC 1450
GGTAAGACAC GACTTATCGC CACTGGCAGC AGCCACTGGT AACAGGATTA 1500
GCAGAGCGAG GTATGTAGGC GGTGCTACAG AGTTCTTGAA GTGGTGGCCT 1550
AACTACGGCT ACACTAGAAG AACAGTATTT GGTATCTGCG CTCTGCTGAA 1600
GCCAGTTACC TTCGGAAAAA GAGTTGGTAG CTCTTGATCC GGCAAACAAA 1650
CCACCGCTGG TAGCGGTGGT TTTTTTGTTT GCAAGCAGCA GATTACGCGC 1700
AGAAAAAAAG GATCTCAAGA AGATCCTTTG ATCTTTTCTA CGGGGTCTGA 1750
CGCTCAGTGG AACGAAAACT CACGTTAAGG GATTTTGGTC ATGAGATTAT 1800
CAAAAAGGAT CTTCACCTAG ATCCTTTTAA ATTAAAAATG AAGTTTTAAA 1850
TCAATCTAAA GTATATATGA GTAAACTTGG TCTGACAGTT ACCAATGCTT 1900
AATCAGTGAG GCACCTATCT CAGCGATCTG TCTCTTTCGT TCATCCATAG 2000
TTGCCTGACT CCCCGTCGTG TAGATAACTA CGATACGGGA GGGCTTACCA 2050
TCTGGCCCCA GTGCTGCAAT AATACCGCGG GACCCACGCT CACCGGCTCC 2100
AGATTTATCA GCAATAAACC AGCCAGCCGG AAGGGCCGAG CGCAGAAGTG 2150
GTCCTGCAAC TTTATCCGCC TCCATCCAGT CTATTAATTG TTGCCGGGAA 2200
GCTAGAGTAA GTAGTTCGCC AGTTAATAGT TTGCGCAACG TTGTTGCCAT 2250
CGCTACAGGC ATCGTGGTAT CACGCTCGTC GTTTGGTATG GCTTCATTCA 2300
GCTCCGGTTC CCAACGATCA AGGCGAGTTA CATGATCCCC CATGTTGCGC 2350
AAAAAAGCGG TTAGCTCCTT CGGTCCTCCG ATCGTTGTCA GAAGTAAGTT 2400
GGCCGCCGTG TTATCACTCA TGGTTATGGC AGCACTACAT AATTCTCTTA 2450
CTGTCATGCC ATCCGTAAGA TGCTTTTCTG TGACTGGTGA GTACTCAACC 2500
AAGTCATTCT GAGAATAGTG TATGCGGCGA CCGAGTTGCT CTTGCCCGGC 2550
GTCAATACGG GATAATACCG CGCCACATAG CAGAACTTTA AAAGTGCTCA 2600
TCATTGGAAA ACGTTCTTCG GGGCGAAAAC TCTCAAGGAT CTTACCGCTG 2650
TTGAGATCCA GTTCGATGTA ACCCACTCGT GCACCCAACT GATCTTCAGC 2700
ATCTTTTACT TTCACCAGCG TTTCTGGGTG AGCAAAAACA GGAAGGCAAA 2750
ATGCCGCAAA AAAGGGAATA AGGGCGACAC GGAAATGTTG AATACTCATA 2800
CTCTTCCTTT TTCAATATTA TTGAAGCATT TATCAGGGTT ATTGTCTCAT 2850
GAGCGGATAC ATATTTGAAT GTATTTAG 2878

Claims (6)

1.一种对PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN，其特征在于，核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
2.一种重组质粒，其特征在于，含有权利要求1所述的CpG-ODN。
3.如权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为FVX-CpG，其中所述FVX为载体，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.如权利要求1所述CpG-ODN、权利要求2或3所述的重组质粒在制备治疗和/或预防PRRSV的制剂中的应用。
5.一种治疗和/或预防PRRSV的制剂，其特征在于，所述制剂含有如权利要求2或3所述重组质粒20-100ug/mL的PBS溶液。
6.如权利要求5所述制剂，其特征在于，所述制剂作为PRRSV免疫激活剂时，注射剂量为0.3-0.5mL/kg；所述制剂作为PRRSV免疫佐剂时，其注射剂量为0.2-1mL/kg。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101422608A (zh) * 2008-01-23 2009-05-06 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种含有CpG序列的PRRSV ORF5基因核酸疫苗的制备方法
US20100247624A1 (en) * 2009-03-30 2010-09-30 Matthias Giese Vaccine compositions and methods containing an immunogen derived from equine arteritis virus
CN105671064A (zh) * 2014-11-19 2016-06-15 屏东科技大学 抗猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的重组抗原基因、重组抗原蛋白及亚单位疫苗组合物
CN110042103A (zh) * 2019-03-25 2019-07-23 华南农业大学 一种对猪具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101422608A (zh) * 2008-01-23 2009-05-06 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种含有CpG序列的PRRSV ORF5基因核酸疫苗的制备方法
US20100247624A1 (en) * 2009-03-30 2010-09-30 Matthias Giese Vaccine compositions and methods containing an immunogen derived from equine arteritis virus
CN105671064A (zh) * 2014-11-19 2016-06-15 屏东科技大学 抗猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的重组抗原基因、重组抗原蛋白及亚单位疫苗组合物
CN110042103A (zh) * 2019-03-25 2019-07-23 华南农业大学 一种对猪具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STEFANO PETRINI等: "Evaluation of Different DNA Vaccines against Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) in Pigs", 《VACCINES》 *
ZHANGLINGHUA等: "Effects of CpG ODN on CD4+ and CD8+ T subpopulations in the immune response to porcine reproductive and respiratory syndrome killed virus vaccine", 《VACCINE》 *

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