CN112390751A - Toll样受体-7小分子抑制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于化学小分子领域，尤其涉及一种Toll样受体‑7的小分子抑制剂。提供一种Toll样受体‑7小分子抑制剂，本发明以筛选得到的TLR7和TLR8的共抑制剂为研究对象，通过对母体化合物的结构优化和构效关系(SAR)的研究，实现了对TLR7和TLR8的选择性调控，进而开发出了对TLR7有一定选择性的高效、无毒、特异性的小分子抑制剂。该类TLR7小分子抑制剂在自身免疫疾病(系统性红斑狼疮)中有一定的效果和潜在的药用价值。

Description

Toll样受体-7小分子抑制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于化学小分子领域，尤其涉及一种Toll样受体-7的小分子抑制剂。

背景技术

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一种I型跨膜蛋白，它在先天性免疫和获得性免疫中均扮演了重要的角色。TLR信号通路功能失调尤其是TLR被过量表达并激活往往会导致严重的炎症疾病和自身免疫疾病，如类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮等。因此，TLR作为一个新的药物靶点，医药公司和研究人员都对开发其新型有效的抑制剂分子充满了热情。而其中，TLR7的特异性小分子抑制剂，文献报道较少。这是由于TLR7和TLR8蛋白同属一个亚族，其结构有高度相似性，因此开发选择性调控这两个蛋白的抑制剂具有一定的挑战。

发明内容

发明要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种结构新颖、高效、无毒、特异性的TLR7的小分子抑制剂。

用于解决技术问题的方法

针对上述问题，本发明提出了一类Toll样受体-7的小分子抑制剂及其制备方法。

根据本发明的一个实施方案，提供一类Toll样受体-7小分子抑制剂，其具有以下结构：

其中，A选自NO₂，NH₂，H；

X选自

n为0-3；

Y选自酰基，亚烷基，磺酰基；

Z选自取代或未取代的芳基，杂芳基，稠环芳基，降冰片烯基，环烷基，烷基等；取代基选自氟代烷基，烷基取代胺基，烷氧基，羟基，羟烷基，硝基，卤素等。

一种实施方式为，

其中，A选自NO₂，NH₂，H；

X选自

单键；

Y选自酰基，亚甲基，磺酰基；

Z选自取代或未取代的苯基，取代或未取代的环己基，取代或未取代的噻吩基，取代或未取代的吡啶基，取代或未取代的喹啉基，取代或未取代的金刚烷基，取代或未取代的烷基，取代基选自氟代烷基，烷基取代胺基，烷氧基，羟基，羟烷基，硝基，卤素等。

一种实施方式为，抑制剂具体为下述结构：

根据本发明的第二方面，提供一种制备上述化合物的方法，包括以下步骤：

硝基取代的溴代喹啉通过硝化反应由溴代喹啉制备，反应条件为浓硝酸、浓硫酸，室温下反应。

通过亲核取代反应，由溴代喹啉或硝基取代的溴代喹啉与1位保护的哌嗪反应制备哌嗪1位氮原子被保护的哌嗪-喹啉结构化合物，反应条件为碳酸钾、DMF，加热回流；

将哌嗪1位氮原子被保护的哌嗪-喹啉结构化合物脱除保护基；

通过酰基化反应将“Z”部分引入至哌嗪环的另一侧；

根据本发明的第三方面，上述化合物Toll样受体-7小分子抑制剂在医药领域的潜在应用。

本发明的有益效果

以筛选得到的TLR7和TLR8的共抑制剂为研究对象，通过对母体化合物的结构优化和构效关系(SAR)的研究，实现对TLR7和TLR8的选择性调控，进而开发出对TLR7有一定选择性的高效、无毒、特异性的小分子抑制剂。后续通过一系列生物学测试方法验证了其对TLR7下游信号通路中的相关因子的生物学效果和生物活性评价。最后我们还通过对病人血液样本的测试，初步证明了该类TLR7小分子抑制剂在自身免疫疾病(系统性红斑狼疮)中有一定的效果和潜在的药用价值。

从以下示例性实施方案的描述中，本发明的进一步特征将变得显而易见。

附图说明

其中，S-1为筛选出的苗头化合物，S-38又被命名为TH-407a，S-42又被命名为TH-407b(该小分子为生物活性评价的重点研究对象)。

图1是母体化合物S-1分子在浓度为5μM条件下的特异性测试结果(对不同TLR的选择性)；

图2是TH-407b分子(即S-42分子)的生物活性测试结果(对TLR7的抑制效果)。表示：TH-407b能以剂量依赖性的方式抑制R848诱导的TLR7激活，其IC₅₀为0.23±0.03μM，而其类似物S-28的效力要低得多。

图3表示TH-407b分子(即S-42分子)的细胞毒性；

图4表示以S-28为对照，在HEK-Blue TLR7细胞中，不同浓度的TH-407b可以抑制R848(2μg/mL)激活的白细胞介素8(IL-8)-mRNA表达量。

图5a和图5b表示经ELISA检测，TH-407b可剂量依赖性地抑制2μg/mL R848处理的RAW 264.7细胞的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的表达量。

图6表示TH-407b可抑制TLR7下游信号通路中TRAF3和p-IKBα的表达。

图7a、图7b和图7c表示TH-407b的药学潜力。TH-407b可剂量依赖性地抑制来自SLE患者的PBMCs中的TNF-α、IL-6和IL-1β表达量。每个数据点代表一个独立的样本。中心线表示均值，胡须线表示±s.e.m。(P值采用单因素方差分析；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。

具体实施方式

以下对本公开的一个实施方式具体地说明，但本公开并非限定于此。

通过实施例更详细地描述本发明，但本发明不限于下述实施例。

实施例1

初始筛选得到的苗头化合物S-1的合成

第一步：以5-溴喹啉(1g,4.8mmol)为原料，在冰浴条件下缓慢滴加3mL 98％的浓硫酸，再缓慢滴加1.5倍当量的浓硝酸，在冰浴条件下搅拌30min，体系由淡黄色浓稠液体变成深棕褐色液体。3h后，取100ul体系中的样品，加入2M的NaOH溶液中和至pH等于8左右，立即有大量淡黄色固体析出。加入100ul乙酸乙酯溶解、萃取，以石油醚：乙酸乙酯＝4：1的极性进行TLC爬板，发现只在R_f约为0.5处有一个新点。随后，在反应体系中滴加入2M的NaOH溶液(中和至pH等于8左右)，直到有大量的淡黄色固体析出，抽滤，用纯水洗涤三次，抽滤至较干，将固体转移至圆底烧瓶中，在液氮中冻成固体，于冻干机上冻干，得到1.15g淡黄色固体，产率为95％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.09(dd,J＝4.2,1.5Hz,1H),8.63(dd,J＝8.6,1.6Hz,1H),7.91(d,J＝1.7Hz,2H),7.67(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ153.16,147.87,140.04,135.87,129.08,128.44,126.22,123.89,123.77。

第二步：称取5-溴-8-硝基喹啉(0.50g,1.98mmol),1-叔丁氧羰基哌嗪(0.44g,2.38mmol)和碳酸钾(0.82g，5.96mmol)放入50mL的圆底烧瓶中，加入转子，加入10mL DMF,加热至60℃过夜。取100ul体系中的样品，加入1mL纯水和200uL的乙酸乙酯萃取，以石油醚：乙酸乙酯＝2：1的极性进行TLC爬板，发现只在R_f约为0.3处有一个新点，原料已经反应完全。停止加热，待体系冷却至室温后，加入100mL的纯净水，随后加入100mL乙酸乙酯进行萃取，收集有机相，合并后旋转蒸发，浓缩后，加入硅胶旋干，以石油醚：乙酸乙酯＝3：1的极性过硅胶柱，得到0.57g澄色固体，产率81％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.09–8.92(m,1H),8.47(q,J＝7.1,5.7Hz,1H),8.04(dt,J＝8.4,5.5Hz,1H),7.50(tt,J＝8.1,3.9Hz,1H),7.03(dt,J＝8.5,5.5Hz,1H),3.70(s,4H),3.10(q,J＝6.2,5.7Hz,4H),1.47(dd,J＝8.3,4.8Hz,12H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ154.66,153.80,152.34,143.49,141.32,132.54,125.51,123.90,121.67,113.05,80.29,52.93,28.42。

第三步：称取上一步产物4-(8-硝基喹啉-5-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(0.50g,1.39mmol)溶解于10mL的四氢呋喃中，加入2mL的三氟乙酸，室温搅拌4h,点板，原料已经反应完全。加入饱和碳酸氢钠溶液，将三氟乙酸中和至微碱性。接着在旋转蒸发仪上将THF旋干。剩余的水相用乙酸乙酯萃取(50mL×3)，合并有机相，旋干，以二氯甲烷：氨的甲醇溶液＝100：1过硅胶柱，得到0.35g黄色固体,产率：99％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.01(dd,J＝4.2,1.6Hz,1H),8.55(dd,J＝8.6,1.7Hz,1H),8.21(d,J＝8.3Hz,1H),7.68(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H),7.17(d,J＝8.3Hz,1H),3.10–3.03(m,4H),3.02–2.96(m,4H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ154.52,152.64,142.80,140.84,133.55,125.65,123.20,122.41,113.17,54.39,46.03。

第四步：称取上步反应所得的8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(50mg，0.19mmol)溶解于5mL干燥的二氯甲烷中，加入三乙胺(24mg,0.24mmol)，再加入4-氯苯乙酰氯(34mg,0.20mmol)，于室温下搅拌过夜。TLC板检测后，发现原料已反应完全，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取。以二氯甲烷：氨的甲醇溶液＝200：1过硅胶柱，得到67mg黄色固体，产率：89％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.04(dd,J＝4.2,1.6Hz,1H),8.65(dd,J＝8.6,1.7Hz,1H),8.25(d,J＝8.3Hz,1H),7.72(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H),7.60–7.50(m,4H),7.26(d,J＝8.4Hz,1H),3.20(s,4H),2.52(p,J＝1.8Hz,4H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ168.58,153.26,152.78,143.56,140.63,135.01,133.41,131.60,129.54,129.04,125.26,123.42,122.74,114.06,52.93。HRMS(ESI)计算C₂₀H₁₇ClN₄O₃,[M+H]⁺＝397.1067,测得[M+H]⁺:397.1057。

实施例2

称取上述第三步中反应所得的8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(30mg，0.12mmol)溶解于5mL干燥的二氯甲烷中，加入三乙胺(24mg,0.24mmol)，再加入4-甲基苯乙酰氯(21.6mg,0.14mmol)，于室温下搅拌过夜。TLC板检测后，发现原料已反应完全，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取。以二氯甲烷：氨的甲醇溶液＝200：1过硅胶柱，得到35mg黄色固体，产率：80％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.07(dd,J＝4.2,1.7Hz,1H),8.52(dd,J＝8.6,1.7Hz,1H),8.08(d,J＝8.3Hz,1H),7.54(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H),7.37(d,J＝8.1Hz,2H),7.24(d,J＝7.8Hz,2H),7.08(d,J＝8.3Hz,1H),3.88(s,4H),3.18(s,4H),2.39(s,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.85,153.26,152.43,143.86,141.31,140.35,132.34,132.30,129.23,127.29,125.33,123.95,121.80,113.32,53.17,21.41。HRMS(ESI)计算C₂₁H₂₀N₄O₃,[M+H]⁺＝377.1614,测得[M+H]⁺:377.1603。

实施例3

称取第三步中反应所得的8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(30mg，0.12mmol)溶解于5mL干燥的二氯甲烷中，加入三乙胺(24mg,0.24mmol)，再加入4-三氟甲基苯乙酰氯(29.0mg,0.14mmol)，于室温下搅拌过夜。TLC板检测后，发现原料已反应完全，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取。以二氯甲烷：氨的甲醇溶液＝200：1过硅胶柱，得到43mg黄色固体，产率：86％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.15–9.07(m,1H),8.54(d,J＝9.6Hz,1H),8.10(d,J＝8.2Hz,1H),7.75(d,J＝8.2Hz,2H),7.62(d,J＝8.1Hz,2H),7.57(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H),7.12(d,J＝8.3Hz,1H),3.94(d,J＝149.8Hz,4H),3.22(d,J＝33.6Hz,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ169.19,152.94,152.48,144.13,141.25,138.79,132.23,130.50,127.53,125.85,125.25,123.96,121.91,113.46,53.05,29.25.HRMS(ESI)计算C₂₁H₁₇F₃N₄O₃,[M+H]⁺＝431.1331,测得[M+H]⁺:431.1323。

实施例4

称取第三步中反应所得的8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(30mg，0.12mmol)溶解于5mL干燥的二氯甲烷中，加入三乙胺(24mg,0.24mmol)，再加入4-甲氧基苯乙酰氯(23.8mg,0.14mmol)，于室温下搅拌过夜。TLC板检测后，发现原料已反应完全，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取。以二氯甲烷：氨的甲醇溶液＝200：1过硅胶柱，得到32mg黄色固体，产率：70％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.07(dd,J＝4.2,1.7Hz,1H),8.52(dd,J＝8.6,1.7Hz,1H),8.08(d,J＝8.2Hz,1H),7.54(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H),7.47–7.42(m,2H),7.08(d,J＝8.3Hz,1H),6.97–6.91(m,2H),4.08–3.86(m,4H),3.84(s,3H),3.19(d,J＝5.3Hz,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.63,161.10,153.29,152.42,143.82,141.31,132.36,129.29,127.26,125.36,123.94,121.80,113.89,113.30,55.41,53.17.HRMS(ESI)计算,[M+H]⁺＝393.1563,测得[M+H]⁺:393.1560。

实施例5

称取第三步中反应所得的8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(30mg，0.12mmol)溶解于5mL干燥的二氯甲烷中，加入三乙胺(24mg,0.24mmol)，再加入4-硝基苯乙酰氯(25.9mg,0.14mmol)，于室温下搅拌过夜。TLC板检测后，发现原料已反应完全，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取。以二氯甲烷：氨的甲醇溶液＝200：1过硅胶柱，得到27mg黄色固体，产率：57％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.07(dd,J＝4.2,1.7Hz,1H),8.51(dd,J＝8.6,1.8Hz,1H),8.38–8.23(m,2H),8.07(d,J＝8.2Hz,1H),7.72–7.61(m,2H),7.55(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H),7.10(d,J＝8.2Hz,1H),3.91(d,J＝159.3Hz,4H),3.21(d,J＝37.4Hz,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ168.25,152.78,152.50,148.63,144.17,141.36,141.26,132.13,128.20,125.13,124.04,123.96,121.96,113.52,53.01.HRMS(ESI)计算C₂₀H₁₇N₅O₅,[M+H]⁺＝408.1308,测得[M+H]⁺:408.1309。

实施例6

称取第三步中反应所得的8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(30mg，0.12mmol)溶解于5mL干燥的二氯甲烷中，加入三乙胺(24mg,0.24mmol)，再加入苯乙酰氯(19.5mg,0.14mmol)，于室温下搅拌过夜。TLC板检测后，发现原料已反应完全，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取。以二氯甲烷：氨的甲醇溶液＝200：1过硅胶柱，得到31mg黄色固体，产率：74％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.08(d,J＝4.2Hz,1H),8.52(d,J＝8.6Hz,1H),8.09(d,J＝8.3Hz,1H),7.55(dd,J＝8.5,4.2Hz,1H),7.46(s,5H),7.09(d,J＝8.3Hz,1H),3.92(m,4H),3.20(s,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ168.25,152.78,152.49,148.63,144.17,141.36,141.26,132.13,128.20,125.13,124.04,123.96,121.96,113.52,53.01.HRMS(ESI)计算C₂₀H₁₈N₄O₃,[M+H]⁺＝363.1457,测得[M+H]⁺:363.1453。

实施例7

称取第三步中反应所得的8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(30mg，0.12mmol)溶解于5mL干燥的二氯甲烷中，加入三乙胺(24mg,0.24mmol)，再加入4-氟苯乙酰氯(22.0mg,0.14mmol)，于室温下搅拌过夜。TLC板检测后，发现原料已反应完全，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取。以石油醚：乙酸乙酯＝2：1过硅胶柱，得到35mg黄色固体，产率：80％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.07(dt,J＝4.1,2.0Hz,1H),8.52(dt,J＝8.6,2.0Hz,1H),8.07(dd,J＝8.2,2.0Hz,1H),7.54(ddd,J＝8.6,4.2,2.0Hz,1H),7.49(ddd,J＝8.8,5.2,2.1Hz,2H),7.17–7.03(m,3H),3.89(s,4H),3.19(s,4H).¹³C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ169.75,163.64(d,¹J＝250.9Hz),153.13,152.45,143.84,141.21,132.40,131.21,129.54(d,³J＝8.5Hz),125.38,123.96,121.88,115.81(d,²J＝21.9Hz),113.40,53.13.HRMS(ESI)计算C₂₀H₁₇FN₄O₃,[M+H]⁺＝381.1363,测得[M+H]⁺:381.1350。

实施例8

详见实施例1的第二步反应。

实施例9

称取第三步中反应所得的8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(30mg，0.12mmol)溶解于5mL干燥的二氯甲烷中，加入三乙胺(24mg,0.24mmol)，再加入4-溴苯乙酰氯(28.0mg,0.13mmol)，于室温下搅拌过夜。TLC板检测后，发现原料已反应完全，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取。以二氯甲烷：甲醇＝50：1过硅胶柱，得到36mg黄色固体，产率：70％。¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.07(dd,J＝4.2,1.7Hz,1H),8.51(dd,J＝8.6,1.7Hz,1H),8.07(d,J＝8.2Hz,1H),7.64–7.57(m,2H),7.54(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H),7.40–7.30(m,2H),7.09(d,J＝8.3Hz,1H),3.85(s,4H),3.18(s,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ169.62,153.02,152.46,144.04,141.29,134.05,132.23,131.93,128.88,125.23,124.51,123.96,121.87,113.41,53.08.HRMS(ESI)计算C₂₀H₁₇BrN₄O₃,[M+H]⁺＝441.0562,测得[M+H]⁺:441.0551。

实施例10

取第三步中反应所得的8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(30mg，0.12mmol)溶解于5mL干燥的二氯甲烷中，加入三乙胺(24mg,0.24mmol)，再加入3-甲氧基苯乙酰氯(21.8mg,0.13mmol)，于室温下搅拌过夜。TLC板检测后，发现原料已反应完全，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取。以二氯甲烷：甲醇＝60：1过硅胶柱，得到36mg黄色固体，产率：79％。¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.07(dd,J＝4.2,1.7Hz,1H),8.52(dd,J＝8.6,1.8Hz,1H),8.08(d,J＝8.2Hz,1H),7.54(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H),7.35(td,J＝7.6,1.0Hz,1H),7.09(d,J＝8.3Hz,1H),7.05–6.94(m,3H),4.31–3.89(m,2H),3.85(s,3H),3.66(s,2H),3.19(s,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.20,159.62,153.01,152.25,143.72,141.12,136.39,132.13,129.60,125.12,123.77,121.64,118.93,115.56,113.17,112.54,55.24,52.97.HRMS(ESI)计算C₂₁H₂₀N₄O₄,[M+H]⁺＝393.1563,测得[M+H]⁺:393.1552。

实施例11

取第三步中反应所得的8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(30mg，0.12mmol)溶解于5mL干燥的二氯甲烷中，加入三乙胺(24mg,0.24mmol)，再加入2-甲氧基苯乙酰氯(21.8mg,0.13mmol)，于室温下搅拌过夜。TLC板检测后，发现原料已反应完全，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取。以二氯甲烷：甲醇＝60：1过硅胶柱，得到35mg黄色固体，产率：77％。¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.09(d,J＝3.8Hz,1H),8.53(d,J＝8.3Hz,1H),8.10(d,J＝8.2Hz,1H),7.54(dd,J＝8.5,4.0Hz,1H),7.39(ddd,J＝8.3,7.4,1.7Hz,1H),7.30(dd,J＝7.5,1.7Hz,1H),7.08(d,J＝8.2Hz,1H),7.03(td,J＝7.5,0.9Hz,1H),6.95(dd,J＝8.4,0.9Hz,1H),4.11(s,2H),3.87(s,3H),3.57(d,J＝15.9Hz,2H),3.35–3.00(m,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ167.92,155.15,153.33,152.19,143.26,140.95,132.51,130.65,127.99,125.45,125.05,123.74,121.59,120.99,113.07,110.87,55.50,53.25,46.76.HRMS(ESI)计算C₂₁H₂₀N₄O₄,[M+H]⁺＝393.1563,测得[M+H]⁺:393.1548。

实施例12

称取5-(哌嗪-1-基)喹啉(50mg，0.23mmol)，加入4-氯苯甲酰氯(44mg，0.25mmol)，加入8mL无水二氯甲烷，加入三乙胺(40mg,0.40mmol)，室温下搅拌过夜反应。检测反应完全后，加入30mL纯净水和二氯甲烷(30mL×3)萃取,收集有机相。之后采用色谱柱法在二氯甲烷：甲醇＝60:1的洗脱剂条件下分离得到产物，旋干抽滤，得到淡黄色固体72mg，产率89％。¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.90(s,1H),8.51(d,J＝10.0Hz,1H),7.86(d,J＝8.4Hz,1H),7.63(d,J＝9.8Hz,1H),7.42(s,5H),7.15–7.11(m,1H),3.70(s,4H),3.11(s,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ169.66,150.53,149.65,149.05,136.17,134.12,131.82,129.44,129.03,128.84,125.83,124.15,120.71,115.82,53.45.HRMS(ESI)计算C₂₀H₁₈ClN₃O,[M+H]⁺＝352.1217,测得[M+H]⁺:352.1215。

实施例13

称取第三步反应产物8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(50mg，0.19mmol)，加入5mL二氯甲烷，加入喹啉-8-磺酰氯(115mg，0.50mmol)和三乙胺(40mg,0.40mmol)，室温下搅拌过夜反应。检测反应完全后，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取,收集乙酸乙酯相。之后采用色谱柱法在DCM：MeOH＝50:1的洗脱剂条件下分离得到产物，旋干抽滤，得到黄色固体57mg，产率65％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.07(dd,J＝4.2,1.7Hz,1H),8.53(dd,J＝8.6,1.7Hz,1H),8.07(d,J＝8.3Hz,1H),7.58(d,J＝4.8Hz,1H),7.55(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H),7.49(dd,J＝5.0,1.1Hz,1H),7.37(dd,J＝3.6,1.1Hz,1H),7.08(dd,J＝8.4,3.1Hz,2H),4.06(s,4H),3.22(t,J＝5.0Hz,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ163.92,153.18,152.43,143.81,141.25,136.49,132.42,129.23,129.10,126.88,125.40,123.95,121.86,113.39,53.12.HRMS(ESI)计算C₁₈H₁₆N₄O₃S,[M+H]⁺＝369.1021,测得[M+H]⁺:369.1014。

实施例14

称取第三步反应产物50.0mg，加入1.5mL二氯甲烷中，加入乙酰氯50uL，三乙胺40uL，室温搅拌过夜反应20h。检测反应基本完成后，水/EA中萃取3次，收集EA相。然后在DCM:MEOH＝50:1的洗脱条件下，通过硅胶柱法对产物进行分离纯化，然后通过旋干得到固体产物，产率为62.0％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.10(dd,J＝4.0,1.2Hz,1H),8.54(dd,J＝8.6,1.2Hz,1H),8.11(d,J＝8.2Hz,1H),7.58(dd,J＝8.5,4.2Hz,1H),7.10(d,J＝8.3Hz,1H),4.07–3.68(m,4H),3.26–3.11(m,4H),2.21(s,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ169.24,153.26,152.46,143.82,141.29,132.37,125.40,123.94,121.85,113.28,53.04,52.93,46.37,41.49,21.44.

实施例15

称取第三步反应产物8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(50mg，0.19mmol)，加入5mL二氯甲烷，加入呋喃甲酰氯(30mg，0.23mmol)和三乙胺(40mg,0.40mmol)，室温下搅拌过夜反应。检测反应完全后，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(20mL×3)萃取,收集乙酸乙酯相。之后采用色谱柱法在DCM：MeOH＝60:1的洗脱剂条件下分离得到产物，旋干抽滤，得到黄色固体52mg，产率74％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.11(dd,J＝4.2,1.7Hz,1H),8.58(dd,J＝8.6,1.7Hz,1H),8.11(d,J＝8.3Hz,1H),7.58(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H),7.54(d,J＝1.7Hz,1H),7.15–7.09(m,2H),6.55(dd,J＝3.5,1.8Hz,1H),4.31–3.97(m,4H),3.27(t,J＝5.0Hz,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ159.25,153.24,152.44,147.78,143.92,143.88,141.34,132.37,125.35,123.96,121.81,117.20,113.30,111.55,53.22.HRMS(ESI)计算C₁₈H₁₆N₄O₄,[M+H]⁺＝353.1250,测得[M+H]⁺:353.1255。

实施例16

称取第三步反应产物8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(80mg，0.31mmol)，加入8mL二氯甲烷，加入氯化吡啶-4-羰基(66mg，0.37mmol)和三乙胺(80mg,0.80mmol)，室温下搅拌过夜反应。检测反应完全后，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取,收集乙酸乙酯相。之后采用色谱柱法在DCM：MeOH＝60:1的洗脱剂条件下分离得到产物，旋干抽滤，得到黄色固体57mg，产率51％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.10(dd,J＝4.2,1.7Hz,1H),8.82–8.74(m,2H),8.53(dd,J＝8.6,1.7Hz,1H),8.10(d,J＝8.2Hz,1H),7.58(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H),7.43–7.37(m,2H),7.12(d,J＝8.3Hz,1H),3.92(m,4H),3.23(m,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ167.97,152.82,152.50,150.44,144.13,142.94,141.26,132.16,125.19,123.95,121.95,121.25,113.49,52.90.HRMS(ESI)计算C₁₉H₁₇N₅O₃,[M+H]⁺＝364.1410,测得[M+H]⁺:364.1412。

实施例17

称取化合物S-4约50mg，加入铁粉和盐酸搅拌反应。TLC监测，待反应检测完全后调整pH值，水/EA中萃取3次，收集EA相。然后在DCM:MEOH＝50:1的洗脱条件下，通过硅胶柱法对产物进行分离纯，然后干燥旋干，得到31.8mg左右的黄色固体，收率68％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.71(dd,J＝4.1,1.6Hz,1H),8.46(dd,J＝8.5,1.6Hz,1H),7.43–7.29(m,3H),6.96(d,J＝8.0Hz,1H),6.86(d,J＝8.7Hz,2H),6.79(d,J＝8.0Hz,1H),5.02-4.62(m,2H),3.77(s,3H),3.71-3.63(m,4H),2.92(s,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.50,160.82,147.56,140.89,139.14,138.98,131.73,129.23,127.86,124.83,120.96,117.30,113.77,109.42,72.79,55.38,53.62,29.70.HRMS(ESI)calculated C₂₁H₂₂N₄O₂,[M+H]⁺＝363.1821,and measured[M+H]⁺:363.1814.

实施例18

称取第三步反应产物8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(50mg，0.19mmol)，加入5mL二氯甲烷，加入100μL环己基甲酰氯和三乙胺(40mg,0.40mmol)，室温下搅拌过夜反应。TLC板检测后，发现原料已反应完全，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取,收集乙酸乙酯相。以二氯甲烷：甲醇＝60：1过硅胶柱，旋转蒸发，得到52mg黄色固体，产率：73％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.10(dd,J＝4.1,1.5Hz,1H),8.54(dd,J＝8.6,1.5Hz,1H),8.10(d,J＝8.2Hz,1H),7.57(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H),7.09(d,J＝8.3Hz,1H),3.79–3.61(m,4H),3.29–3.05(m,4H),2.38–2.25(m,1H),1.70–1.21(m,10H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ174.80,154.60,152.45,145.43,139.65,135.72,128.53,125.43,119.98,113.19,53.44,45.20,41.38,29.40,28.90,28.39,26.38,25.83,25.39.HRMS(ESI)计算C₂₂H₂₃N₅O₃,[M+H]⁺＝369.1927,测得[M+H]⁺:369.1926。

实施例19

称取第三步反应产物8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(50mg，0.19mmol)，加入5mL二氯甲烷，加入3,4-二甲氧基苯甲酰氯(80mg，0.40mmol)和三乙胺(40mg,0.40mmol)，室温下搅拌过夜反应。检测反应完全后，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取,收集乙酸乙酯相。之后采用色谱柱法在DCM：MeOH＝50:1的洗脱剂条件下分离得到产物，旋转蒸发，得到黄色固体66mg，产率81％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.25(dd,J＝8.9,1.6Hz,1H),9.08(dd,J＝4.1,1.6Hz,1H),8.91(dd,J＝4.0,1.6Hz,1H),8.54(dd,J＝8.6,1.6Hz,1H),8.44(d,J＝8.8Hz,1H),8.09(d,J＝8.2Hz,1H),7.60(ddd,J＝32.6,8.7,4.1Hz,2H),3.76–3.67(m,4H),3.48–3.40(m,4H),3.08(d,J＝96.9Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.56,152.43,149.14,149.09,148.21,132.96,132.37,127.43,127.19,125.38,123.96,123.91,121.82,120.26,113.29,112.53,111.01,110.54,56.04,53.16,50.76.HRMS(ESI)计算C₂₂H₂₂N₄O₅,[M+H]⁺＝423.1668,测得[M+H]⁺:423.1664。

实施例20

称取第三步反应产物8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(50mg，0.19mmol)，加入5mL二氯甲烷中，加入3,4,5-三甲氧基苯甲酰氯(110mg，0.43mmol)和三乙胺(40mg,0.40mmol)，室温下搅拌过夜反应。检测反应完全后，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取,收集乙酸乙酯相。之后采用色谱柱法在DCM：MEOH＝50:1的洗脱剂条件下分离得到产物，旋干抽滤，得到黄色固体73.0mg，产率83.4％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.23(dd,J＝8.8,1.4Hz,1H),8.90(dd,J＝4.0,1.4Hz,1H),8.42(d,J＝8.8Hz,1H),8.07(d,J＝8.2Hz,1H),7.54(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H),7.07(dd,J＝21.1,8.6Hz,2H),3.95–3.87(m,8H),3.72(s,3H),3.20(s,6H).¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ170.39,153.44,152.41,148.22,143.81,141.25,139.53,137.88,132.94,130.78,125.31,121.83,104.50,60.91,56.33,56.19,53.13.HRMS(ESI)计算C₂₃H₂₄N₄O₆,[M+H]⁺＝453.1774,测得[M+H]⁺:453.1768。

实施例21

称取第三步反应产物8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(50mg，0.19mmol)，加入5mL二氯甲烷，加入100mg的2,4-二甲氧基苯甲酰氯和三乙胺(40mg,0.40mmol)，室温下搅拌过夜反应。检测反应完全后，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取,收集乙酸乙酯相。之后采用色谱柱法在DCM：MEOH＝50:1的洗脱剂条件下分离得到产物，旋干抽滤，得到黄色固体64.9mg，产率79.5％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.11(dd,J＝4.1,1.5Hz,1H),8.55(dd,J＝8.6,1.5Hz,1H),8.12(d,J＝8.3Hz,1H),7.56(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H),7.35–7.25(m,1H),7.10(d,J＝8.3Hz,1H),6.58(dd,J＝8.4,2.1Hz,1H),6.51(d,J＝2.1Hz,1H),4.11(s,2H),3.87(d,J＝5.4Hz,6H),3.62(s,2H),3.27(s,2H),3.13(s,2H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ168.06,161.92,156.77,152.39,148.12,140.82,132.94,132.45,129.45,127.26,125.45,123.93,121.74,112.46,105.09,98.60,55.64,55.52,46.91,41.68.HRMS(ESI)计算C₂₂H₂₂N₄O₅,[M+H]⁺＝423.1668,测得[M+H]⁺:423.1654。

实施例22

称取第三步反应产物50.0mg，加入2mL的二氯甲烷,4-二甲氨基苯甲酰氯150mg，三乙胺200uL，室温搅拌过夜反应18h。检测反应完成后，H₂O/EA萃取3次，收集EA相。然后在DCM:MEOH＝50:1的洗脱条件下，对产物进行过硅胶柱纯化，然后干燥，得到黄色固体66.7mg，收率84.9％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.27(dd,J＝8.9,1.6Hz,1H),8.93(dd,J＝4.1,1.6Hz,1H),8.47(d,J＝8.8Hz,1H),7.65(dd,J＝8.9,4.1Hz,1H),7.45(dd,J＝9.0,2.4Hz,2H),7.05(d,J＝8.9Hz,1H),6.72(d,J＝8.8Hz,2H),4.01(s,4H),3.75–3.66(m,4H),3.04(s,6H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ160.91,153.00,152.48,132.19,129.47,129.24,125.18,123.97,121.95,113.57,111.19,111.10,53.52,52.64,45.66,40.10.HRMS(ESI)计算C₂₉H₄₄N₄O₃,[M+H]⁺＝497.3492,测得[M+H]⁺:497.3486。

实施例23

称取第三步反应产物50.0mg，加入1.5mL二氯甲烷中。加入棕榈酰氯150uL和三乙胺40uL，室温搅拌过夜。检测反应完成后，H₂O/EA萃取3次，收集EA相。然后在DCM:MEOH＝50:1的洗脱条件下，经硅胶柱对产物进行分离纯化，干燥后得到黄色固体66.5mg，产率69.3％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ9.10(dd,J＝4.1,1.5Hz,1H),8.54(dd,J＝8.6,1.5Hz,1H),8.10(d,J＝8.2Hz,1H),7.57(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H),7.09(d,J＝8.3Hz,1H),3.56–3.45(m,4H),3.29–3.05(m,4H),2.28-2.20(m,2H),1.30–1.25(m,26H),0.90(t,J＝6.7Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ172.06,153.28,152.41,143.91,141.26,132.37,125.35,123.94,121.79,113.23,53.15,45.70,33.38,31.92,30.53,29.45,29.12,28.38,22.69,14.11.

实施例24

详细见实施例1的第三步反应。

实施例25

称取5-溴喹啉(500mg，2.40mmol)，加入哌嗪-1-羧酸叔丁酯(500mg，2.68mmol)，1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦(224mg，0.36mmol)，加入叔丁醇钠(462mg，4.80mmol)，三(二亚苄基丙酮)二钯(110mg，0.12mmol)，加入10mL无水甲苯，加入干燥后的转子。利用水泵和氮气球，将瓶内气体进行3次抽气和充气。加热至100℃过夜，反应约12小时。取样检测，发现5-溴喹啉已经完全转化，因此停止加热，待体系冷却后，将甲苯旋转蒸发，加入30mL纯净水，加入乙酸乙酯萃取(30mL×3)，收集有机相，加入50mL饱和氯化钠溶液，混匀后分液，接着加入无水硫酸钠粉末干燥，抽滤，旋转蒸发浓缩，以石油醚：乙酸乙酯＝8：1过硅胶柱，得到525mg淡黄色固体，产率：70％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.90(d,J＝5.7Hz,1H),8.52(d,J＝8.5Hz,1H),7.87–7.82(m,1H),7.63(t,J＝8.0Hz,1H),7.40(dd,J＝8.5,4.2Hz,1H),7.12(d,J＝7.5Hz,1H),3.69(s,4H),3.04(s,4H),1.50(s,9H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ154.85,150.20,149.52,149.41,132.00,129.37,125.12,124.07,120.41,115.44,79.98,53.15,28.46.

称取上一步反应所得的4-(喹啉-5-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(500mg,1.60mmol),加入5mL无水二氯甲烷，加入1mL三氟乙酸，室温下搅拌3小时，检测确认原料都反应完了，边搅拌边缓慢加入饱和碳酸氢钠溶液，直至没有气泡产生。加入10mL二氯甲烷萃取(×3)，合并有机相，加入无水硫酸钠粉末干燥，抽滤，旋转蒸发浓缩，以二氯甲烷：氨的甲醇溶液＝20：1的极性过硅胶柱，得到324mg，产率：93％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.86(dd,J＝4.1,1.7Hz,1H),8.48(dd,J＝8.5,1.3Hz,1H),7.70–7.62(m,2H),7.50(dd,J＝8.5,4.1Hz,1H),7.14(dd,J＝6.8,1.7Hz,1H),2.95(s,8H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ150.43,150.22,149.08,132.01,129.60,123.82,123.29,120.60,114.91,54.37,46.00.

实施例26

称取4-氯喹啉(491mg，3.0mmol)，在冰浴下缓慢加入2mL浓硝酸，加入8mL浓硫酸，随后在室温下搅拌，反应2h。反应结束后，在冰浴条件下缓慢加入浓氨水中和，缓慢加入20mL水稀释后，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，并用饱和食盐水(30mL)洗涤有机相，分液，有机相用无水硫酸钠粉末干燥，旋转蒸发浓缩，用石油醚：乙酸乙酯＝4：1的极性过硅胶柱，最终得到209mg黄色粉末，产率：33％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.94(d,J＝4.7Hz,1H),8.48(dd,J＝8.6,1.4Hz,1H),8.08(dd,J＝7.5,1.3Hz,1H),7.74(dd,J＝8.5,7.5Hz,1H),7.66(d,J＝4.7Hz,1H).

称取4-氯-8-硝基喹啉(400mg，2.10mmol)，加入1-Boc哌嗪(430mg，2.30mmol)，加入碳酸钾(580mg，4.20mmol)，加入15mL的DMF作溶剂，加热至90℃，反应24小时。检测到原料完全转化后，停止加热，冷却至室温，向反应体系中加入40mL水，用乙酸乙酯(30mL×4)萃取，再用饱和食盐水(20mL)洗涤有机相，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，抽滤后旋转蒸发浓缩后，以石油醚：乙酸乙酯＝8：1过硅胶柱，得到465mg黄色固体，产率：62.4％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.85(d,J＝5.0Hz,1H),8.21(dd,J＝8.5,1.4Hz,1H),7.95(dd,J＝7.5,1.4Hz,1H),7.54(t,J＝8.0Hz,1H),6.96(d,J＝5.0Hz,1H),3.73(t,J＝4.9Hz,4H),3.19(t,J＝4.8Hz,4H),1.50(s,9H).

称取8-硝基-4-(哌嗪-1-基)喹啉(50mg,0.19mmol)，加入三乙胺(40mg,0.40mmol)，加入5mL的无水THF作溶剂，在冰浴下，加入4-甲氧基甲酰氯(64mg，0.38mmol)，反应过夜后，检测8-硝基-4-(哌嗪-1-基)喹啉已完全转化，加入20mL纯净水，用二氯甲烷萃取3次(20mL×3)，收集有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸发浓缩有机相，以二氯甲烷：甲醇＝30：1的极性过硅胶柱，得到61mg橙色固体，产率：76％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.82(d,J＝5.1Hz,1H),8.22(d,J＝8.5Hz,1H),7.93(d,J＝7.4Hz,1H),7.55(t,J＝8.0Hz,1H),7.45(d,J＝8.4Hz,2H),6.95(dd,J＝9.4,6.6Hz,3H),4.11(q,J＝7.1Hz,2H),3.93(s,2H),3.84(s,3H),3.25(s,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.67,161.16,156.79,152.51,148.53,140.62,129.33,127.72,127.12,124.38,124.23,123.80,113.92,110.36,55.42,52.48.HRMS(ESI)计算C₂₁H₂₀N₄O₄,[M+H]⁺＝393.1563,测得[M+H]⁺:393.1548。

实施例27

称取1-氟萘(1.5g,3.42mmol)，缓慢加入4mL冰醋酸，加入1mL浓硝酸(75％)，加热至70℃，反应2小时。随后用TLC板检测，发现反应原料1-氟萘已完全转化，停止加热，加入用2M氢氧化钠溶液中和至微碱性，再用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，并用饱和食盐水30mL萃取有机相，分液后，有机相用无水硫酸钠粉末干燥，抽滤，旋转蒸发浓缩，用四氯化碳：甲苯＝1：4的极性过硅胶柱，得到1.41g黄色粉末，产率约：71.8％。未经过纯化，直接投入下一步。

称取1-氟-4-硝基萘(191mg，1.00mmol)，称取1-叔丁氧基哌嗪(223.5mg，1.20mmol)，加入碳酸钾(276mg，2.00mmol)，加入8mL DMF，加热搅拌至70℃，反应过夜。待原料1-氟-4-硝基萘反应完全，加入30mL纯净水，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取,收集乙酸乙酯相，用无水硫酸钠干燥，抽滤旋转蒸发至固体。直接加入5mL二氯甲烷，1mL三氟乙酸，室温搅拌3小时，反应完全后，加入饱和碳酸氢钠中和至弱碱性，加入二氯甲烷萃取(30mL×3)，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，抽滤，蒸发浓缩成固体后，继续加入5mL二氯甲烷，加入4-甲氧基苯甲酰氯(170mg，1.00mmol),室温搅拌过夜。检测反应完全后，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取,收集乙酸乙酯相。之后采用色谱柱法在石油醚：乙酸乙酯＝4:1的洗脱剂条件下分离得到产物，旋干抽滤，得到黄色固体109mg，总产率28％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.74(d,J＝8.6Hz,1H),8.31(d,J＝8.4Hz,1H),8.28(d,J＝8.4Hz,1H),7.75(ddd,J＝8.6,6.9,1.4Hz,1H),7.64(t,J＝8.1Hz,1H),7.49(d,J＝8.7Hz,2H),7.07(d,J＝8.4Hz,1H),6.98(d,J＝8.7Hz,2H),3.97(s,4H),3.88(s,3H),3.25(s,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.63,161.04,155.13,141.97,129.50,129.29,128.55,127.41,127.06,126.82,125.61,124.19,124.13,113.87,112.65,55.41,53.03.HRMS(ESI)计算C₂₂H₂₁N₃O₄,[M+H]⁺＝392.1610,测得[M+H]⁺:392.1625。

实施例28

称取8-溴-5-硝基喹啉(253mg，1mmol)，称取1-叔丁氧基哌嗪(223.5mg，1.20mmol)，加入碳酸钾(276mg，2.00mmol)，加入8mL DMF，加热搅拌至70℃，反应过夜。待原料8-溴-5-硝基喹啉反应完全，加入30mL纯净水，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取,收集乙酸乙酯相，用无水硫酸钠干燥，抽滤。之后采用色谱柱法在石油醚：乙酸乙酯＝3:1的洗脱剂条件下分离得到产物，旋干抽滤，得到252mg黄色固体，产率70％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.30–9.22(m,1H),8.96–8.86(m,1H),8.44(d,J＝8.8Hz,1H),7.62(dd,J＝8.9,4.1Hz,1H),7.01(d,J＝8.8Hz,1H),3.75(t,J＝4.9Hz,4H),3.63(t,J＝5.0Hz,4H),1.52–1.41(m,9H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ155.27,154.87,148.21,140.97,137.66,133.07,127.45,124.03,123.74,112.49,80.24,51.65,28.58.

称取上述反应所得的1-BOC-4-(5-硝基喹啉-8-基)哌嗪(230mg，0.64mmol),加入10mL二氯甲烷，加入1mL三氟乙酸，室温下搅拌2小时，反应完全后，加入饱和碳酸氢钠中和至弱碱性，加入二氯甲烷萃取(30mL×3)，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，抽滤，蒸发浓缩后，以二氯甲烷：氨的甲醇溶液＝20：1过硅胶柱，得到151mg黄色固体，产率：83％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.26(d,J＝8.8Hz,1H),8.89(d,J＝4.1Hz,1H),8.45(d,J＝9.0Hz,1H),7.60(dd,J＝8.9,4.1Hz,1H),7.02(d,J＝8.8Hz,1H),3.66(t,J＝4.8Hz,4H),3.20(t,J＝4.8Hz,4H),2.09(s,1H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ155.85,147.97,140.92,137.19,133.05,127.65,123.94,123.83,112.32,53.08,46.19.

称取5-硝基-8-(哌嗪-1-基)喹啉(150mg，0.57mmol)，加入5mL二氯甲烷，加入4-甲氧基苯甲酰氯(120mg，0.69mmol)和三乙胺(120mg,1.20mmol)，室温下搅拌过夜反应。检测反应完全后，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取,收集乙酸乙酯相。之后采用色谱柱法在石油醚：乙酸乙酯＝2:1的洗脱剂条件下分离得到产物，旋干抽滤，得到黄色固体80mg，产率35％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.26(dd,J＝8.9,1.7Hz,1H),8.92(dd,J＝4.1,1.7Hz,1H),8.46(d,J＝8.8Hz,1H),7.65(dd,J＝8.9,4.1Hz,1H),7.51–7.45(m,2H),7.05(d,J＝8.8Hz,1H),6.99–6.94(m,2H),3.99(m,4H),3.87(s,3H),3.71(d,J＝5.3Hz,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.50,160.99,154.79,148.23,140.87,137.88,132.99,129.31,127.47,127.21,123.95,123.56,113.83,112.55,55.41,51.87.HRMS(ESI)计算C₂₁H₂₀N₄O₄,[M+H]⁺＝393.1563,测得[M+H]⁺:393.1549。

实施例29

称取4-甲氧基苯甲酰氯(2.04g,12mmol)，加入10mL无水二氯甲烷作溶剂，加入三乙胺(2.4g,24mmol)，加入哌嗪-1-羧酸叔丁酯(1.86g，10mmol)，在室温下反应过夜。第二天观察到体系由无色透明液体变成了棕色液体，经点板确认，哌嗪-1-羧酸叔丁酯已经完全转化。无需纯化，直接往体系中加入3mL三氟乙酸，室温反应3小时后，体系由黄色变成深褐色，经TLC板检测原料已转化完全，停止反应。边搅拌边缓慢加入饱和碳酸氢钠溶液，直至体系没有气泡产生。用二氯甲烷萃取(30mL×3)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，抽滤，旋转浓缩后，以二氯甲烷：甲醇＝200:1的极性过硅胶柱，最终分离得到1.9g黄色固体，产率：86％。¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.37(d,J＝8.8Hz,2H),6.90(d,J＝8.8Hz,2H),3.82(s,3H),3.58(s,4H),2.87(s,4H),1.99(s,1H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.41,160.73,129.10,127.91,113.73,55.35,46.18.

称取4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(42mg，0.21mmol),加入1-(4-甲氧苯甲酰基)哌嗪(70mg,0.32mmol),加入三乙胺(40mg,0.40mmol)，加入8mL的甲苯作溶剂，100℃加热，搅拌过夜。经检测4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑已经完全反应，停止加热，体系冷却后，加入30mL纯净水，用二氯甲烷萃取3次(30mL×3)，收集有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸发浓缩有机相，以二氯甲烷：甲醇＝30：1的极性过硅胶柱，得到61mg橙色固体，产率：76％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.44(d,J＝8.8Hz,1H),7.47(d,J＝8.8Hz,2H),6.96(d,J＝8.8Hz,2H),6.33(d,J＝8.9Hz,1H),4.17–4.11(m,4H),3.95(s,4H),3.86(s,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.75,161.43,144.86,144.62,134.77,129.44,126.54,123.68,114.00,102.92,76.70,55.45,49.09.HRMS(ESI)计算C₁₈H₁₇N₅O₅,[M+H]⁺＝384.1308,测得[M+H]⁺:384.1302。

实施例30

称取4-氟硝基苯(519mg，3.68mmol)，加入1-Boc-哌嗪(651.8mg，3.50mmol),加入碳酸钾(866mg，7.0mmol),加入8mL DMF作溶剂，55℃加热，反应10个小时，吸取100μL样品于1.5mL离心管中，加入0.5mL纯净水，加入100μL乙酸乙酯萃取，TLC点板，原料1-Boc-哌嗪已经完全反应，终止反应。加入50mL纯净水，加入乙酸乙酯萃取(30mL×3)，收集有机相，用无水硫酸钠干燥，抽滤，有机相在旋转蒸发以上浓缩，过硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯＝6：1的洗脱条件分离得到405mg淡黄色固体，产率：35％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.40–7.36(m,2H),6.94–6.90(m,2H),3.84(s,3H),3.52(m,8H),1.47(s,9H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.57,160.94,154.59,129.15,128.19,127.51,113.81,80.28,55.36,28.37.

称取上一步反应所得的4-(4-硝基苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(357mg，1.16mmol),加入5mL二氯甲烷，加入1mL三氟乙酸，在室温下搅拌，体系马上由淡黄色变成深棕色，6小时后体系变成墨绿色。TLC板检测反应发现体系中原料已经完全转化，停止反应。加入饱和碳酸氢钠溶液，使体系变为pH约为7，此时体系变为黄色。利用分液漏斗分离有机相，旋转蒸发浓缩后，以二氯甲烷:氨的甲醇溶液＝30：1过硅胶柱，收集有机相，旋转蒸发浓缩后得到236mg淡黄色固体，产率：98％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.23–8.00(m,2H),6.88–6.73(m,2H),3.49–3.30(m,4H),3.13–2.93(m,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ155.20,138.31,125.94,112.56,77.39,77.27,77.07,76.75,48.10,45.74.

称取上一步反应得到的1-(4-硝基苯基)哌嗪(207mg，1.0mmol)，加入4-甲氧基苯甲酰氯(204.7mg，1.2mmol)，加入三乙胺(200mg,2.0mmol)，加入8mL的二氯甲烷作溶剂，室温搅拌过夜。加入30mL纯净水，用二氯甲烷萃取3次(30mL×3)，收集有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸发浓缩有机相，以石油醚：乙酸乙酯＝2：1的极性过硅胶柱，得到300mg淡黄色固体，产率：88％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.12(d,J＝9.3Hz,2H),7.43(d,J＝8.6Hz,2H),6.93(d,J＝8.6Hz,2H),6.82(d,J＝9.4Hz,2H),3.84(s,7H),3.46(s,4H).¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ170.58,161.16,154.52,139.08,129.33,127.04,125.95,113.88,113.09,77.38,77.27,77.06,76.75,55.43,47.19.HRMS(ESI)计算C₁₈H₁₉N₃O₄,[M+H]⁺＝342.1454,测得[M+H]⁺:342.1449。

实施例31

称取第三步反应产物80.0mg，加入2.5mL二氯甲烷、57mg的4-甲氧基苄氯和50mg的三乙胺中，室温搅拌过夜。检测反应完成后，水/EA萃取3次，收集EA相。然后在DCM:MeOH＝50:1的洗脱条件下，用色谱柱对产物进行分离，再经干燥，得到34.3mg黄色固体，收率29.8％。¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.05(dt,J＝3.8,1.9Hz,1H),8.54–8.46(m,1H),8.09(t,J＝6.3Hz,1H),7.54–7.47(m,1H),7.35–7.26(m,2H),7.05(t,J＝6.8Hz,1H),6.95–6.84(m,2H),3.83(s,3H),3.61(s,2H),3.23(dd,J＝14.2,9.6Hz,4H),2.76(s,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ158.92,154.35,152.22,142.79,141.42,132.93,130.46,129.45,125.96,123.72,121.33,113.72,112.52,62.32,60.41,55.29,52.96.

实施例32

称取第三步反应产物8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(100mg，0.39mmol)，加入6mL二氯甲烷，加入4-甲氧基磺酰氯(79.8mg，0.39mmol)和三乙胺(80mg,0.80mmol)，室温下搅拌过夜反应。检测反应完全后，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取,收集乙酸乙酯相。之后采用色谱柱法在石油醚：乙酸乙酯＝2:1的洗脱剂条件下分离得到产物，旋干抽滤，得到淡黄色固体109mg，产率66％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.03(dd,J＝4.2,1.6Hz,1H),8.32(dd,J＝8.6,1.8Hz,1H),8.06(d,J＝8.3Hz,1H),7.78(d,J＝8.9Hz,2H),7.46(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H),7.07(dd,J＝8.6,4.1Hz,3H),3.91(s,3H),3.40–3.21(m,8H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ163.48,153.02,152.51,144.02,141.33,132.34,130.12,127.11,125.43,123.93,121.86,114.59,113.57,55.84,52.44,46.25.HRMS(ESI)计算C₂₀H₂₀N₄O₅S,[M+H]⁺＝429.1233,测得[M+H]⁺:429.1227。

实施例33

称取第三步反应产物8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(50mg，0.19mmol)，加入5mL二氯甲烷，加入喹啉-8-磺酰氯(115mg，0.50mmol)和三乙胺(40mg,0.40mmol)，室温下搅拌过夜反应。检测反应完全后，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取,收集乙酸乙酯相。之后采用色谱柱法在DCM：MeOH＝50:1的洗脱剂条件下分离得到产物，旋干抽滤，得到黄色固体57mg，产率65％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.14(d,J＝2.7Hz,1H),9.04(d,J＝2.9Hz,1H),8.56(d,J＝7.2Hz,1H),8.39(d,J＝8.5Hz,1H),8.32(d,J＝8.3Hz,1H),8.09(dd,J＝18.5,8.2Hz,2H),7.69(t,J＝7.8Hz,1H),7.60(dd,J＝8.3,4.2Hz,1H),7.47(dd,J＝8.6,4.1Hz,1H),7.06(d,J＝8.3Hz,1H),3.81(s,4H),3.24(t,J＝4.4Hz,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ153.41,152.32,151.30,144.20,143.64,141.25,136.73,136.60,133.78,133.21,132.36,129.12,125.62,125.42,123.83,122.23,121.66,113.36,53.21,46.39.HRMS(ESI)计算C₂₂H₁₉N₅O₄S,[M+H]⁺＝450.1236,测得[M+H]⁺:450.1219。

实施例34

称取5-溴-8-硝基喹啉(0.25g,1.0mmol),1-叔丁氧羰基高哌嗪(0.24g,1.12mmol)和碳酸钾(0.41g，3.00mmol)放入25mL的圆底烧瓶中，加入转子，加入10mL DMF,加热至100℃过夜。取100μL体系中的样品，加入1mL纯水和200μL的乙酸乙酯萃取，以石油醚：乙酸乙酯＝3：1的极性进行TLC爬板，发现只在R_f约为0.3处有一个新点，原料5-溴-8-硝基喹啉已经反应完全。停止加热，待体系冷却至室温后，加入50mL的纯净水，随后加入50mL乙酸乙酯进行萃取(×3)，收集有机相，合并后，加入无水硫酸钠干燥，旋转蒸发，浓缩后，加入硅胶旋干，以石油醚：乙酸乙酯＝3：1的极性过硅胶柱，得到89mg黄色固体，产率24％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.06–8.95(m,1H),8.52(d,J＝8.5Hz,1H),8.06(d,J＝8.3Hz,1H),7.49(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H),7.10(d,J＝8.4Hz,1H),3.76–3.61(m,4H),3.43–3.30(m,4H),2.16–2.05(m,2H),1.49(d,J＝6.0Hz,9H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ155.75,152.26,142.59,141.51,132.99,125.75,124.16,121.38,113.93,113.71,79.94,56.28,55.67,47.44,46.88,46.24,45.43,28.51.

称取4-(8-硝基喹啉-5-基)-1,4-二氮杂-1-羧酸叔丁酯(80mg，0.21mmol)，加入溶解于8mL的二氯甲烷中，加入1mL的三氟乙酸，室温搅拌4h,点板，原料已经反应完全。加入饱和碳酸氢钠溶液，将三氟乙酸中和至微碱性，用二氯甲烷萃取(50mL×3)，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，抽滤，旋至剩余6mL左右，直接投下一步。往瓶中加入4-甲氧基苯甲酰氯(43mg，0.25mmol),加入三乙胺(40mg,0.40mmol)，室温下搅拌过夜反应。检测反应完全后，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取,收集乙酸乙酯相。之后采用色谱柱法在石油醚：乙酸乙酯＝3:1的洗脱剂条件下分离得到产物，旋干抽滤，得到黄色固体32.4mg，产率:38％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.06(d,J＝3.0Hz,1H),8.49(d,J＝28.9Hz,1H),8.08(d,J＝7.7Hz,1H),7.47(d,J＝39.0Hz,3H),7.13(d,J＝8.1Hz,1H),6.93(d,J＝7.4Hz,2H),4.00(d,J＝21.5Hz,2H),3.84(s,2H),3.74(m,2H),3.57(m,2H),3.39(s,3H),2.19(m,2H).HRMS(ESI)计算C₂₂H₂₂N₄O₄,[M+H]⁺＝407.1719,测得[M+H]⁺:407.1712。

实施例35

称取N-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺(800mg，4.99mmol),4-甲氧基乙酰氯(680mg，4.0mmol),加入三乙胺(800mg,8.0mmol)，加入10mL二氯甲烷，室温搅拌反应，2.5小时后，取样，TLC板检测，发现反应原料4-甲氧基苯甲酰氯已经完全转化。无需纯化，直接往反应体系中加入1mL三氟乙酸，室温搅拌过夜。加入饱和碳酸氢钠溶液至无气泡，加入30mL二氯甲烷萃取(×3)，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，抽滤，旋转蒸发，以二氯甲烷:氨的甲醇溶液＝15:1的极性过硅胶柱，分离得到270mg，两步累积产率：35％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.87–7.67(m,2H),7.08(t,J＝5.6Hz,1H),6.95–6.78(m,2H),3.80(s,3H),3.44(q,J＝5.8Hz,2H),2.89(t,J＝5.9Hz,2H),1.75(s,2H).

称取8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(100mg，0.40mmol)，N-(2-氨基乙基)-4-甲氧基苯甲酰胺(84mg，0.44mmol),4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(11.4mg，0.02mmol)，加入碳酸铯(388mg，1.19mmol)，加入三(二亚苄基丙酮)二钯(10.9mg，0.012mmol)，加入甲苯10mL，迅速用氮气抽充3次，搅拌加热至100℃回流过夜。第二天停止加热，冷却后，取样点板，发现8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉已经完全转化。将体系进行抽滤，滤液中加入30mL纯净水，用乙酸乙酯萃取三次(30mL×3)，收集有机相，用无水硫酸钠干燥，抽滤，旋转蒸发浓缩后，以二氯甲烷：氨的甲醇溶液＝15：1的极性过硅胶柱，最终得到45mg，产率；31％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.37(d,J＝8.8Hz,1H),8.73(d,J＝3.3Hz,1H),8.53(d,J＝9.0Hz,1H),7.74(d,J＝8.5Hz,2H),7.61(dt,J＝8.8,5.5Hz,2H),6.91(d,J＝8.6Hz,2H),6.68(d,J＝9.0Hz,1H),6.51(s,1H),3.82(d,J＝10.9Hz,5H),3.74(q,J＝5.5Hz,2H).¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ167.80,162.44,151.01,147.40,136.17,133.45,131.78,130.66,128.80,126.22,126.11,124.85,123.36,113.86,101.41,55.43,42.88,39.27.HRMS(ESI)计算C₁₉H₁₈N₄O₄,[M+H]⁺＝367.1406,测得[M+H]⁺:367.1415。

实施例36

称取第三步反应产物8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(150mg，0.57mmol)，加入4-羟基苯硼酸(86mg，0.65mmol)，加入四(三苯基膦)钯(0)(36.5mg，0.03mmol)，加入碳酸钠(64mg，0.6mmol)，加入8mL甲苯，加热至90℃，回流过夜。待原料反应完全，抽滤除去固体，加入30mL纯净水，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取,收集乙酸乙酯相。之后采用色谱柱法在石油醚：乙酸乙酯＝3:1的洗脱剂条件下分离得到产物，旋干抽滤，得到乳白色固体62mg，产率40％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.82(s,1H),9.05(d,J＝2.9Hz,1H),8.37(d,J＝7.7Hz,1H),8.28(d,J＝7.8Hz,1H),7.71(dd,J＝8.7,4.1Hz,1H),7.63(d,J＝7.8Hz,1H),7.36(d,J＝8.4Hz,2H),6.97(d,J＝8.4Hz,2H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ158.41,152.77,147.30,144.56,139.43,135.19,131.60,128.26,127.09,126.27,123.71,123.21,116.13.HRMS(ESI)计算C₁₅H₁₀N₂O₃,[M+H]⁺＝267.0770,测得[M+H]⁺:267.0769。

实施例37

称取第三步反应产物8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(150mg，0.57mmol)，加入4-羟甲基苯硼酸(144mg，0.95mmol)，加入四(三苯基膦)钯(0)(36.5mg，0.03mmol)，加入碳酸钠(64mg，0.6mmol)，加入8mL甲苯，加热至90℃，回流过夜。待原料反应完全，抽滤除去固体，加入30mL纯净水，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取,收集乙酸乙酯相。之后采用色谱柱法在二氯甲烷：甲醇＝60:1的洗脱剂条件下分离得到产物，旋干抽滤，得到乳白色固体58mg，产率36％。¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.08(dd,J＝4.1,1.6Hz,1H),8.30(dd,J＝8.7,1.6Hz,1H),8.09(d,J＝7.7Hz,1H),7.66(dd,J＝12.0,7.0Hz,1H),7.57(d,J＝7.9Hz,3H),7.51(dd,J＝8.7,4.2Hz,1H),7.45(d,J＝8.1Hz,2H),4.84(s,2H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ152.30,147.57,144.77,141.52,139.94,136.94,134.75,129.98,128.59,128.47,127.59,127.32,125.76,123.19,122.64,64.83.HRMS(ESI)计算C₁₆H₁₂N₂O₃,[M+H]⁺＝281.0926,测得[M+H]⁺:281.0929。

实施例38

称取第三步反应产物50.0mg，在2mL的DMF溶剂中加入金刚烷-1-甲酸90mg和CDI约80mg。在60℃加热搅拌条件下反应5h。检测反应基本完全后，在H₂O/EA中萃取3次，收集EA相。然后在DCM:MEOH＝30:1的洗脱条件下，经硅胶柱对产物进行分离纯化，干燥后得到黄色固体产物66.9mg，产率82.3％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.26(dd,J＝8.9,1.6Hz,1H),8.92(dd,J＝4.1,1.6Hz,1H),8.45(d,J＝8.8Hz,1H),7.63(dd,J＝8.8,4.1Hz,1H),7.01(t,J＝6.5Hz,1H),4.07–3.98(m,4H),3.70–3.62(m,4H),2.06(s,6H),1.75(s,3H),1.55(s,6H).¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ171.49,162.60,152.39,142.40,140.29,135.71,132.48,125.43,123.89,121.69,53.33,45.38,40.40,38.58,36.70,28.47.HRMS(ESI)计算值C₂₄H₂₈N₄O₃,[M+H]⁺＝421.2240,测得[M+H]⁺:421.2225。

实施例39

称取8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(50mg，0.19mmol)溶解于5mL干燥的DMF中，加入1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺(76.7.0mg,0.38mmol)，加入4-二甲氨基吡啶(4.6mg，0.038mmol)，3-羟基金刚烷-1-羧酸(45.6mg，0.23mmol)，60℃搅拌过夜。TLC板检测后，发现原料已反应完全，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取。以二氯甲烷：氨的甲醇溶液＝20：1过硅胶柱，得到26mg黄色固体，产率：30％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.11(dd,J＝4.1,1.6Hz,1H),8.54(dd,J＝8.6,1.7Hz,1H),8.11(d,J＝8.3Hz,1H),7.57(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H),7.09(d,J＝8.3Hz,1H),4.01(s,4H),3.68(dt,J＝10.3,4.9Hz,1H),3.44(dd,J＝6.5,3.8Hz,1H),3.19(t,J＝4.9Hz,4H),2.38–2.32(m,2H),2.02(s,3H),1.98(d,J＝3.6Hz,3H),1.77(d,J＝2.9Hz,3H),1.49(s,2H).HRMS(ESI)计算值C₂₄H₂₈N₄O₄,[M+H]⁺＝437.2189,测得[M+H]⁺:437.2186.

实施例40

称取8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(25.8mg，0.10mmol)溶解于5mL干燥的DMF中，加入1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺(24.0mg,0.20mmol)，加入4-二甲氨基吡啶(38mg，0.20mmol)，3-溴-1-金刚烷甲酸(25.9mg，0.10mmol)，于室温下搅拌过夜。TLC板检测后，发现原料已反应完全，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取。以二氯甲烷：氨的甲醇溶液＝200：1过硅胶柱，得到28mg黄色固体，产率：56％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.08(dd,J＝4.1,1.6Hz,1H),8.52(dd,J＝8.6,1.6Hz,1H),8.08(d,J＝8.2Hz,1H),7.54(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H),7.07(d,J＝8.3Hz,1H),3.98(s,4H),3.17(s,4H),3.06(s,1H),2.95(s,2H),2.88(s,2H),2.62(s,2H),2.26(s,2H),1.73(s,4H),1.25(s,1H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ173.77,153.14,152.42,143.83,141.31,132.40,125.36,123.90,121.77,113.20,63.97,53.23,50.12,48.19,46.17,45.47,37.43,34.58,32.06.HRMS(ESI)计算值C₂₄H₂₇BrN₄O₃,[M+H]⁺＝499.1345,测得[M+H]⁺:499.1340.

实施例41

称取8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(25.8mg，0.10mmol)溶解于5mL干燥的DMF中，加入1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺(24.0mg,0.20mmol)，加入4-二甲氨基吡啶(38mg，0.20mmol)，3,5-二甲基金刚烷-1-羧酸(20.8mg，0.10mmol)，于室温下搅拌过夜。TLC板检测后，发现原料已反应完全，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取。以二氯甲烷：氨的甲醇溶液＝200：1过硅胶柱，得到14mg黄色油状液体，产率：31％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.08(d,J＝5.6Hz,1H),8.52(d,J＝8.6Hz,1H),8.09(d,J＝8.3Hz,1H),7.53(dd,J＝8.6,4.1Hz,1H),7.07(d,J＝8.3Hz,1H),3.98(s,4H),3.16(s,4H),2.15(s,1H),1.87(s,2H),1.38(s,4H),1.25(s,4H),1.19(d,J＝8.2Hz,2H),0.87(s,6H).HRMS(ESI)计算值C₂₆H₃₂N₄O₃,[M+H]⁺＝449.2553,测得[M+H]⁺:449.2556.

实施例42

称取8-硝基-5-(哌嗪-1-基)喹啉(25.8mg，0.10mmol)溶解于5mL干燥的DMF中，加入1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺(24.0mg,0.20mmol)，加入4-二甲氨基吡啶(38mg，0.20mmol)，2-金刚烷酮-5-甲酸(19.4mg，0.10mmol)，于室温下搅拌过夜。TLC板检测后，发现原料已反应完全，加入30mL纯净水和乙酸乙酯(30mL×3)萃取。以二氯甲烷：氨的甲醇溶液＝200：1过硅胶柱，得到16mg黄色固体，产率：37％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.08(d,J＝3.3Hz,1H),8.51(d,J＝8.4Hz,1H),8.08(d,J＝8.2Hz,1H),7.54(dd,J＝8.5,4.0Hz,1H),7.07(d,J＝8.2Hz,1H),3.98(s,4H),3.17(s,4H),2.65(s,2H),2.32(d,J＝30.4Hz,6H),1.64(s,4H),1.25(s,1H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ216.37,173.84,153.06,152.45,143.83,141.26,132.45,125.39,123.92,121.85,113.26,53.24,46.09,45.58,41.56,40.55,38.29,38.16,27.72.HRMS(ESI)计算值C₂₄H₂₆N₄O₄,[M+H]⁺＝435.2032,测得[M+H]⁺:435.2033.

实施例43

称取前一步的产物(S-42)30mg，溶于MeOH(5mL)中，加入NaBH₄(8mg)，冷却至0℃，搅拌24h。(搅拌6h后再加入NaBH₄ 10mg)。加水/EA萃取混合物3次，收集有机相后用Na₂SO₄干燥。真空条件除去溶剂，在DCM:氨的甲醇溶液＝50:1条件下经硅胶柱纯化，得到橙色固体约17mg，产率约56％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.11(d,J＝4.2Hz,1H),8.54(t,J＝7.5Hz,1H),8.10(d,J＝8.2Hz,1H),7.65–7.52(m,1H),7.09(dd,J＝14.1,5.8Hz,1H),5.36(s,1H),3.87–3.72(m,4H),3.20(dd,J＝29.7,10.5Hz,4H),2.33–1.18(m,14H)。HRMS(ESI)计算值C₂₄H₂₈N₄O₄,[M+H]⁺＝437.2189,测得[M+H]⁺:437.2179.

以下是生物测试部分(针对TH-407b也就是表格中的S-42分子)

高通量筛选：

HEK-Blue hTLR7细胞购自Invitrogen公司(cat.hkb-htlr7)，能稳定表达人TLR7和胚胎分泌碱性磷酸酶。在清华大学药学院平台筛选了来自Chembridge文库、Sigma药物文库和Selleck文库等的10万余个小分子化合物。小分子化合物的初始筛选浓度为5μM。最后从Sigma库中成功获得了一种潜在的母体化合物(Sigma-5-8-L20)。

小分子的生物活性测试(对TLR7及TLR8的抑制效果)：

在添加有10％体积分数的胎牛血清、青霉素(100U/mL)和链霉素(100mg/mL)的DMEM培养基中培养HEK-Blue hTLR7和HEK-Blue hTLR8细胞。

96孔板中，细胞密度每孔4-5万个细胞，先于37℃、5％CO₂的培养箱中培养24小时。24小时后，吸走上清，换用新鲜的不含血清的DMEM培养基。用1μg/mL的R848(TLR7及TLR8的激活剂)和指定浓度的相应化合物处理细胞，置于37℃、5％CO₂的培养箱中孵育培养24小时。之后每孔取出50μL的上清转移至新的96孔板中，之后在这个新的96孔板中每孔再加入50μL的Quanti-Blue，之后37℃避光条件下孵育至明显变色(约30分钟)，使用多功能酶标仪在620nm处测定吸光度数值。最后利用Prism软件进行作图及数据处理工作，求得IC₅₀(半抑制浓度)数值结果。其中对数据进行归一化时，以单独只加R848处理的细胞作为100％活性，以未处理即不加入任何调节剂的细胞作为0％活性。

细胞毒性测试：

将HEK细胞(4-5万个细胞/孔)置于96孔板中，与指定的化合物在37℃共孵育24小时并相应测定活性后。向剩余的未转移的含有细胞的培养液中加入Cell Counting Kit-8检测试剂(1:10稀释，例如每孔剩余液体为50μL，则每孔加入5μL的CCK-8试剂即可)。然后，在37℃孵育，约2小时内观察到颜色变化，此时在450nm处测定吸光度。对数据进行归一化，未经药物小分子处理的细胞孔存活率认定为100％存活，只有培养基和CCK-8检测试剂的无细胞孔认定为0％存活。

小分子的特异性测试：

在分别过表达各种TLRx(x＝1-9)的HEK-Blue细胞中，测试小分子化合物对TLR家族蛋白的选择性。具体测定方法步骤与前述“小分子的生物活性测试”相同，只是使用了相应的不同TLR配体去激活相应细胞：100ng/mL的Pam₃CSK₄，100ng/mL的Pam₂CSK₄，5μg/mL的poly(I/C)，20ng/mL的LPS，50ng/mL的鞭毛蛋白，1μg/mL的R848，2μg/mL的R848以及0.5μM的ODN2006去相应的激活hTLR1/2，hTLR2/6，hTLR3，hTLR4，hTLR5，hTLR7，hTLR8以及hTLR9细胞。

IL-8mRNA水平的测试：

将HEK-Blue TLR7细胞以每孔一百万个细胞的密度铺于6孔板中，孵育24小时后，用无血清培养基进行更换，在37℃条件下，用加或不加R848(2μg/mL)以及不同浓度的化合物处理细胞约16小时后刮除细胞，重悬于磷酸盐缓冲液(PBS)中。使用Trizol试剂(invitrogen，No.15596026)按照标准流程说明书提取总RNA。使用iScriptTM cDNA合成试剂盒(Bio-rad，No.1708890)按照生产厂家说明书进行逆转录。使用iTaq Universal SYBRGreen Supermix(Bio-Rad，No.1725120)进行定量聚合酶链反应。IL-8和GAPDH引物均来自瑞生。

酶联免疫吸附试验(Elisa)：

通过ELISA法检测了TNF-α和IL-6的表达水平。使用RAW264.7细胞系，在添加有10％体积分数的胎牛血清、青霉素(100U/mL)和链霉素(100mg/mL)的RPMI培养基中，于6孔板中(细胞密度约200万个细胞每孔)在37℃、5％CO₂的培养箱中孵育24小时后，用不含血清的RPMI培养基更换掉之前的完全培养基，用加或不加R848(2μg/mL)以及不同浓度的相应化合物处理细胞。24小时后，收集培养液上清，根据厂家说明书的流程步骤，使用小鼠TNF-α和IL-6的OptEIA ELISA试剂盒(BD Biosciences)来测定TNF-α和IL-6的表达量。

蛋白质印迹法(Western Blot)：

Western blot法检测经2μg/mL R848和TH-407b处理的RAW264.7细胞中TNF受体相关因子3(TRAF3)、磷酸化IKBα(p-IKBα)和IKBα的上调与抑制效果。收集并裂解Raw264.7细胞。将总蛋白分离到细胞裂解缓冲液(50mM的Tris-HCl,150mM的NaCl,10％甘油，0.2％Triton X-100，蛋白酶抑制剂1X，纯水定容至1L，并调整pH至7.5左右)中。采用BCA法测定蛋白浓度，并加载到10％的SDS-PAGE中。采用电印迹法将蛋白转移到PVDF转移膜(MerckMillipore)上(100mA，1小时)。采用1:1000稀释的TRAF3(CST公司，货号4729)，IKBα(Bioss；1287R)和p-IKBα(Bioss；52169R)抗体作为一抗。用1:5000稀释的过氧化物酶标记亲和纯化的山羊抗兔IgG(H+L)抗体(用于TRAF3、IKBα和p-IKBα)(CST公司)作为二抗。TBST中加入5％质量体积比的脱脂奶粉用于膜的封闭，以及一抗、二抗的稀释配置。印迹的可视化是由Thermo Super Signal West Pico kit(Thermo Fisher Scientific)完成的。GAPDH(CST公司，货号2118)作为内参对照。

系统性红斑狼疮病人样本的测试：

以系统性红斑狼疮(SLE)患者样本及健康人样本作为对照，采用静脉穿刺法采集全血。所有在人体外周血PBMCs上进行的实验都经过了PUMCH(no.S-478)的批准，并与机构准则保持一致。采用密度梯度离心法从健康人和3例系统性红斑狼疮患者中分离出人PBMCs。分离后立即将细胞置于0.2mL RPMI培养基中，以3百万个细胞/孔的密度培养于96孔圆底板(Thermo Scientific)中。然后用指定的化合物TH-407b处理细胞。孵育24小时后，4℃，4000rpm下离心10min后收集上清，-80℃冷冻，用于Elisa检测。使用BD OptEIATM人TNF-α、IL-6和IL-1β抗体elisa试剂盒(BD Biosciences)，根据说明书流程步骤测定TNF-α、IL-6和IL-1β水平的表达量变化。

下表1为化合物在HEK-Blue hTLR7及HEK-Blue hTLR8细胞系中对R848诱导的信号转导的抑制效果数据，说明：IC₅₀值及标准差由三次及以上独立的实验测定；N.A.表示在100μM浓度条件下无明显的活性效果。

表1

此实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (5)

1.一种Toll样受体-7小分子抑制剂，其具有以下结构：

其中，A选自NO₂，NH₂，H；

X选自

n为0-3；

Y选自酰基，亚烷基，磺酰基；

Z选自取代或未取代的芳基或杂芳基，稠环芳基，降冰片烯基，环烷基，烷基等；取代基选自氟代烷基，烷基取代胺基，烷氧基，羟基，羟烷基，硝基，卤素等。

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中，

其中，A选自NO₂，NH₂，H；

X选自

单键；

Y选自酰基，亚甲基，磺酰基；

Z选自取代或未取代的苯基，取代或未取代的环己基，取代或未取代的噻吩基，取代或未取代的吡啶基，取代或未取代的喹啉基，取代或未取代的金刚烷基，取代或未取代的烷基，取代基选自氟代烷基，烷基取代胺基，烷氧基，羟基，羟烷基，硝基，卤素等。

3.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，抑制剂为下列化合物中任一个：

4.一种制备权利要求1-3中任一项所述化合物的方法，

包括以下步骤：

硝基取代的溴代喹啉通过硝化反应由溴代喹啉制备，反应条件为浓硝酸、浓硫酸，室温下反应；

通过亲核取代反应，由溴代喹啉或硝基取代的溴代喹啉与1位保护的哌嗪反应制备哌嗪1位氮原子被保护的哌嗪-喹啉结构化合物，反应条件为碳酸钾、DMF，加热回流；

将哌嗪1位氮原子被保护的哌嗪-喹啉结构化合物脱除保护基；

通过酰基化反应将“Z”部分引入至哌嗪环的另一侧。

5.权利要求1-3中任一项所述化合物在制备Toll样受体-7小分子抑制剂中的应用。

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