CN113264859B - 萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子及其制备方法和应用 - Google Patents
萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子，结构通式为：
实验表明，该萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子能够靶向作用于Keap1蛋白，使Nrf2解离，其KD2值为0.106μM～3.08μM，具有高的靶向性、专一性、选择性。该萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子具有与SFN相当或比SFN更加优秀的抗炎活性，具有比SFN低的生物毒性，是一种潜在的用于治疗氧化应激损伤所引发的疾病，尤其是氧化应激损伤引起的急性肺损伤的化合物。
Description
技术领域
本发明属于医药化学技术领域，具体涉及一种萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子及其制备方法和应用。
背景技术
氧化应激是指由机体产生的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)所介导的氧化与抗氧化物质失衡，从而引起机体组织细胞产生氧化损伤。氧化应激不仅可以直接导致机体细胞坏死，也可以通过激活机体内的氧化还原信号途径导致细胞衰老、凋亡，甚至坏死。机体产生氧化损伤是导致许多疾病发病的基础，也是机体多种疾病发病所共有的机制之一。大量研究表明，在肿瘤、Ⅱ型糖尿病、老年痴呆等疾病的发病过程有明显的ROS反应增强，同时氧化应激损伤指标(如血清中MDA)水平显著升高。因此，使用高活性、多功能抗氧化剂，清除ROS、减轻氧化应激反应成为治疗多种疾病的新思路。
核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRf2)是一个富含亮氨酸拉链结构的转录因子，属于Cap-n-collar(CNC)转录因子家族成员是细胞和机体对抗氧化应激损伤的中枢调控者，普遍表达于各种组织和细胞中。生理条件下，NRf2在细胞质中与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like ECH-associatedprotein 1,Keap1)结合，处于非活性、易降解的状态，在内外界自由基和化学物质刺激时，NRf2与Keap1解离，进入细胞核与抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)结合，启动ARE下游的Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白、蛋白酶体/分子伴侣等基因转录和表达以抵抗内外界的有害刺激。NRf2及其信号通路与肿瘤、糖尿病、神经系统疾病、慢性肾功能衰竭、哮喘、慢性阻塞性肺病、自身免疫性疾病等多种疾病病理生理和发病过程密切相关，已成为广受关注的药物靶点。基于Keap1-NRf2系统的结构和机理知识，许多NRf2激活剂已被开发成潜在的治疗药物。根据它们的作用机制可分为两类，共价结合：亲电试剂与keap1结合使泛素结合酶从Keap1解离，从而使NRf2从构象改变的Keap1蛋白中解离；非共价结合：发生氧化应激时，Keap1-NRf2与泛素结合酶紧密结合，释放出NRf2。而共价结合除共价修饰Keap1外，还可能与keap1其他半胱氨酸残基相互作用，导致不可预测的副作用。
莱菔硫烷作为NRf2激活剂，具有优秀的抗癌症、抗氧化损伤、抗阿尔茨海默症以及抗肺损伤活性，但由于其与keap1共价结合的结合特性，很难达到治疗的选择性和专一性，增加了临床开发的不确定性。研究表明，异硫氰酸酯基团(-N＝C＝S，以下记作-NCS)是莱菔硫烷的关键药效基团，如何基于这一关键药效基团，开发靶向性强，毒性低的NRf2激活剂，是当前研究的主要方向。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子，以解决现有技术中，莱菔硫烷作为NRf2共价激活剂，这种共价结合常常是不可逆结合，长期作用使得Nrf2异常持续活跃有致癌变可能，且室温下不稳定、剂量难以控制以及选择性、专一性差问题。
本发明还提供一种萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子的制备方法。
本发明还提供一种萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子在制备治疗氧化应激损伤引发的疾病的药物中应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子，包括其可药用的盐、立体异构体、对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、光学异构体、外消旋体、多晶型物、溶剂合物或经同位素标记之化合物，具有如式Ⅰ所示的通式：
其中，R1是氢、酰胺基、羧酸基、烷基、三唑环、芳基、芳杂环基、饱和或部分不饱和杂环中的一种；
R2是氢、酰胺基、羧酸基、烷基、三唑环、芳基、芳杂环基、饱和或部分不饱和杂环中的一种；
R3是氢、羟基、氨基、烷基、卤素、甲氧基、硝基、羟基、三唑环中的一种；
-NCS表示-N＝C＝S；
一种萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子，包括其可药用的盐、立体异构体、对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、光学异构体、外消旋体、多晶型物、溶剂合物或经同位素标记之化合物，具有如式Ⅲ所示的通式：
其中，R1是氢、酰胺基、羧酸基、烷基、三唑环、芳基、芳杂环基、饱和或部分不饱和杂环中的一种；
R2是氢、酰胺基、羧酸基、烷基、三唑环、芳基、芳杂环基、饱和或部分不饱和杂环中的一种；
R3是氢、羟基、氨基、烷基、卤素、甲氧基、硝基、羟基、三唑环中的一种；
-NCS表示-N＝C＝S；
一种如上所述的萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子的制备方法，包括以下步骤：
通式为
的化合物与TDP在溶剂中反应，反应产物经浓缩，分离，得到所述萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子。
一种如上所述的萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子的制备方法，包括以下步骤：
低温下，通式为
的化合物A1与间氯过氧苯甲酸在溶剂中反应，反应产物经分离，制备所述萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子；
其中，M为
n＝2,3,4或5。
一种如上所述的萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子作为制备治疗氧化应激损伤引发的疾病的药物中的应用。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子及其制备方法和应用，其有益效果是：本发明合成了一种萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子，具有与SFN(莱菔硫烷)相似的异硫氰酸酯(-N＝C＝S)基团，实验表明，该萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子能够靶向作用于Keap1蛋白，使NRf2解离，其KD2值为0.106μM～3.08μM，具有高的靶向性、专一性、选择性。该萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子具有与SFN相当或比SFN更加优秀的抗炎活性，是一种潜在的用于治疗氧化应激损伤所引发的疾病，尤其是氧化应激损伤引起的急性肺损伤的化合物。
附图说明
图1是一实施例中，萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子的合成路线图。
图2是又一实施例中，萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子的合成路线图。
图3是萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子体外活性考察结果柱状图。
图4是化合物SFN和化合物SCN-1的蛋白免疫印迹结果示意图。
图5是SCN-1在5mg/kg和20mg/kg剂量下，各组小鼠BALF中的炎症因子(TNF-α)。
图6是SCN-6在5mg/kg和20mg/kg剂量依赖性的下调炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达。
图7是不同浓度的SCN-1处理6小时Western印迹检测肺的核和胞浆NRf2蛋白水平。
图8是化合物SFN和化合物SCN-6的蛋白免疫印迹结果示意图。
图9是SCN-6在5mg/kg和20mg/kg剂量下，各组小鼠BALF中的炎症因子(TNF-α)。
图10是SCN-6在5mg/kg和20mg/kg剂量依赖性的下调炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达。
图11是不同浓度的SCN-6处理6小时Western印迹检测肺的核和胞浆NRf2蛋白水平。
具体实施方式
以下结合本发明的附图，对本发明的技术方案以及技术效果做进一步的详细阐述。
一具体实施方式中，一种萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子，包括其可药用的盐、立体异构体、对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、光学异构体、外消旋体、多晶型物、溶剂合物或经同位素标记之化合物，具有如式Ⅰ所示的通式：
其中，R1是氢、酰胺基、羧酸基、烷基、三唑环、芳基、芳杂环基、饱和或部分不饱和杂环中的一种；
R2是氢、酰胺基、羧酸基、烷基、三唑环、芳基、芳杂环基、饱和或部分不饱和杂环中的一种；
R3是氢、羟基、氨基、烷基、卤素、甲氧基、硝基、羟基、三唑环中的一种；
-NCS表示-N＝C＝S；
例如，所述的萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子，其特征在于，具有如式Ⅱ所示的通式：
又一具体实施方式中，一种萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子，包括其可药用的盐、立体异构体、对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、光学异构体、外消旋体、多晶型物、溶剂合物或经同位素标记之化合物，其特征在于，具有如式Ⅲ所示的通式：
其中，R1是氢、酰胺基、羧酸基、烷基、三唑环、芳基、芳杂环基、饱和或部分不饱和杂环中的一种；
R2是氢、酰胺基、羧酸基、烷基、三唑环、芳基、芳杂环基、饱和或部分不饱和杂环中的一种；
R3是氢、羟基、氨基、烷基、卤素、甲氧基、硝基、羟基、三唑环中的一种；
-NCS表示-N＝C＝S；
例如，所述的萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子，其特征在于，具有如式Ⅳ所示的通式：
又一具体实施方式中，一种如上所述的萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子的制备方法，包括以下步骤：
通式为
的化合物与TDP(1,1'-硫代羰基二-2(1H)-吡啶酮)在溶剂中反应，反应产物经浓缩，分离，得到所述萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子。
其中，通式为
的化合物T1的合成路线可参考专利号为201810776137.4、名称为《萘磺酰胺乙酰胺类化合物及其应用和药物组合物》的中国发明专利，此处不再赘述。
请参看图1，在其中一个实施例中，本发明提供一种可能的合成过程，可以理解的是，式Ⅰ中所表示的化合物可以通过参考图1中所示的合成路线制备。
一具体实施例中，将化合物2-((N-(4-((4-氨基-N-(2-氨基-2-氧乙基)苯基)磺胺基)萘-1-基)-4-甲氧基苯基)磺胺基)乙酰胺(图1中，化合物8)(100mg,0.167mmol)，TDP(108mg,0.502mmol)，加入到无水二氯甲烷(10ml)中,氮气保护下过夜反应TLC(DCM/MeOH＝10/1,Rf＝0.54)点板反应完毕。将反应液浓缩，加入3ml甲醇,室温冷却析出固体，过滤，固体用少量甲醇淋洗，得到白色固体(30mg,0.046mmol,28.04％yield)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.36–8.10(m,2H),7.79–7.49(m,8H),7.33(t,J＝12.4Hz,2H),7.17–6.79(m,6H),4.45–4.14(m,4H),3.88(d,J＝21.6Hz,3H)，为式Ⅱ所示化合物(以下记作SCN-1)。
又一具体实施方式中，一种如上所述的萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子的制备方法，包括以下步骤：
S11、通式为
的化合物E加入吡啶中，随后低温下加入4-碘基苯磺酰氯，搅拌反应；向反应产物中加入水，过程中形成固体，静置，并倒出液体，残余固体中加入乙酸乙酯和石油醚，搅拌，过滤，固体用石油醚洗涤，制备通式为
的化合物D。
S12、三二亚苄基丙酮二钯和4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽加入到无水N-甲基吡咯烷酮中，氮气保护下，加入N,N-二异丙基乙胺，加入化合物D以及2-(2-氨基乙基硫代)乙基氨基甲酸叔丁酯、(3-巯基丙基)氨基甲酸叔丁酯、叔丁基(4-巯基丁基)氨基甲酸酯、2-(5-巯基)异吲哚-1,3-二酮中的一种，反应产物萃取，有机相经洗涤，干燥，柱层析分离制备通式为
的化合物B；其中，R为
n＝2,3,4。
S13、化合物B加入二氯甲烷与三氟乙酸的混合液中进行反应,反应产物调PH至碱性，萃取，有机相经洗涤，干燥，浓缩制化合物C；化合物C与二(2-吡啶)硫代碳酸酯加入溶剂中，在氮气保护下反应，反应产物经柱层析分离，制备通式为
的化合物A，其中，M为
n＝2,3,4或5。
低温下，化合物A与间氯过氧苯甲酸在溶剂中反应，反应产物经分离，制备所述萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子。
请参看图2，在其中一个实施例中，本发明提供一种可能的合成过程，可以理解的是，式Ⅲ中所表示的化合物可以通过参考2中所示的合成路线制备。
一实施例中，一种萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子的制备方法，包括以下步骤：
S111、N-(4-氨基萘-1-基)-4-甲氧基苯磺酰胺(图1或图2中所示化合物5)加入吡啶中，随后低温下加入4-碘基苯磺酰氯，搅拌反应；向反应产物中加入水，过程中形成固体，静置，并倒出液体，残余固体中加入乙酸乙酯和石油醚，搅拌，过滤，固体用石油醚洗涤，制备4-碘-N-(4-((4-硝基苯基)磺胺基)萘-1-基)苯磺酰胺(图2中所示化合物6)。
例如，化合物5(500mg,1.523mmol)加入5ml吡啶，随后0℃下加入4-碘基苯磺酰氯(689mg,2.284mmol)，反应液在0℃搅拌3小时，TLC(EA/PE＝1/3,Rf＝0.3)点板显示反应完毕。向混合物中加入50ml水，过程中形成固体，静置，并倒出液体，残余固体中加入乙酸乙酯(10mL)和石油醚(30mL)，搅拌10分钟，过滤，固体用石油醚洗涤，获得目标化合物，粉白色固体(650mg,0.986mmol,64.86％yield)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.20(s,1H),9.99(s,1H),7.97–7.74(m,4H),7.48(dd,J＝2.2,9.2Hz,2H),7.30(m,4H),6.92(m,4H),3.70(d,J＝2.8Hz,3H)，即为化合物6。
S121、将化合物6，碳酸钾加入DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中,随后加入2-溴乙酰胺，搅拌反应；向反应产物中加入水，过程中形成固体，残余固体用水和石油醚洗涤，获得化合物D1；
将三二亚苄基丙酮二钯和4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽加入到无水N-甲基吡咯烷酮中，氮气保护下，加入N,N-二异丙基乙胺，加入化合物D1以及2-(2-氨基乙基硫代)乙基氨基甲酸叔丁酯、(3-巯基丙基)氨基甲酸叔丁酯、叔丁基(4-巯基丁基)氨基甲酸酯、2-(5-巯基)异吲哚-1,3-二酮中的一种，反应产物萃取，有机相经洗涤，干燥，柱层析分离制备通式为
例如，将化合物6(600mg,0.986mmol)，碳酸钾(702mg,3.947mmol)加入2ml DMF中,随后加入2-溴乙酰胺(624mg,3.503mmol)，反应液在室温搅拌2小时，TLC(MeOH/DCM＝1/10,Rf＝0.5)点板显示反应完毕。向混合物中加入50ml水，过程中形成固体，残余固体用水和石油醚洗涤，获得目标化合物，白色固体(600mg,0.848mmol,85.96％yield)。直接用于下一步反应。将三二亚苄基丙酮二钯(77mg,0.084mmol)和4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽(49mg,0.084mmol)加入到无水N-甲基吡咯烷酮(10ml)中，氮气保护下，加入N,N-二异丙基乙胺(218mg,1.695mmol)，加入上一步化合物(600mg,0.708mmol)以及2-(2-氨基乙基硫代)乙基氨基甲酸叔丁酯(180mg,1.016mmol),反应液在80℃过夜反应，TLC(DCM/MeOH＝10/1,Rf＝0.4)点板反应完毕。反应液用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，柱层析分离(33-50％EAin PE)获得白色固体(630mg,0.832mmol,98.28％yield)。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.33–8.11(m,2H),7.76–7.22(m,10H),7.18–6.55(m,7H),4.41–4.11(m,4H),3.87(d,J＝18.8Hz,3H),3.29–2.96(m,4H),1.38(s,9H)，即为化合物7a。
同理，将上述过程中的2-(2-氨基乙基硫代)乙基氨基甲酸叔丁酯用物质的量相同的(3-巯基丙基)氨基甲酸叔丁酯、叔丁基(4-巯基丁基)氨基甲酸酯、2-(5-巯基)异吲哚-1,3-二酮替换，分别制备化合物7b、化合物7c和化合物7d。
化合物7b(白色固体(500mg,0.649mmol,95.35％yield)；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.37–8.03(m,2H),7.69–7.22(m,10H),7.21–6.70(m,7H),4.42–4.08(m,4H),3.87(d,J＝19.2Hz,3H),3.14–2.96(m,4H),1.82–1.65(m,2H),1.38(s,9H))
化合物7c(白色固体(500mg,0.637mmol,89.28％yield)；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.37–8.10(m,2H),7.67–7.23(m,10H),7.19–6.72(m,7H),4.42–4.12(m,4H),3.87(d,J＝18.8Hz,3H),3.08(dt,J＝6.8,14.4Hz,2H),2.95(t,J＝6.4Hz,2H),1.58(dd,J＝7.6,14.2Hz,4H),1.37(s,9H))。
化合物7d(白色固体(440mg,0.530mmol,88％yield)；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.41–8.05(m,2H),7.92–7.78(m,4H),7.68–7.20(m,10H),7.18–6.74(m,6H),4.25(q,J＝9.2,11.2Hz,4H),3.85(d,J＝13.8Hz,3H),3.67–3.46(m,2H),3.06(dt,J＝7.2,14.4Hz,2H),1.50–1.35m,4H),1.44(t,J＝8.0Hz,2H))。
S131、化合物B1加入二氯甲烷与三氟乙酸的混合液中进行反应,反应产物调PH至碱性，萃取，有机相经洗涤，干燥，浓缩制化合物C1；
化合物C1与二(2-吡啶)硫代碳酸酯加入溶剂中，在氮气保护下反应，反应产物经柱层析分离，制备通式为
的化合物A1，其中，M为
n＝2,3,4或5。
例如，将化合物7a，加入二氯甲烷/三氟乙酸＝5/1(15ml)中，过夜反应TLC(MeOH/DCM＝1/5,Rf＝0.5),反应液用饱和碳酸氢钠溶液调PH至9，乙酸乙酯萃取，有机相饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩获得目标产物白色固体(350mg,0.532mmol,64.10％yield)。直接用于下一步，将该化合物与二(2-吡啶)硫代碳酸酯(185mg,0.798mmol)加入二氯甲烷中，在氮气保护下反应6小时,TLC(DCM/MeOH＝9/1,Rf＝0.54)点板反应完毕。柱层析分离(6-10％MeOH in DCM)获得白色固体(100mg,0.143mmol,26.95％yield)。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.38–8.10(m,2H),7.65–7.47(m,8H),7.33(dd,J＝7.6,31.2Hz,2H),7.17–6.82(m,6H),4.40–4.13(m,4H),4.02–3.74(m,5H),3.56–3.44(m,2H).HRMS(+ESI)m/z:700.1031[M+H]+，制备2-((N-(4-((N-(2-氨基-2-氧乙基)-4-((2-异硫氰酸乙酯)巯基)苯基)磺胺基)萘-1-基)-4-甲氧基苯基)磺胺基)乙酰胺(化合物8a)，结构式如下：
参考如上方式，分别制备：
化合物8b(2-((N-(4-((N-(2-氨基-2-氧乙基)-4-((3-异硫氰酸丙基)硫代)苯基)磺胺基)萘-1-基)-4-甲氧基苯基)磺胺基)乙酰胺)：白色固体。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.35–8.06(m,2H),7.65–7.55(m,7H),7.47–7.27(m,3H),7.17–6.83(m,6H),4.39–4.15(m,4H),3.94–3.78(m,5H),3.24–3.12(m,2H),2.01(dt,J＝7.0,13.8Hz,2H).HRMS(+ESI)m/z:714.1172[M+H]+。
化合物8c(2-((N-(4-((N-(2-氨基-2-氧乙基)-4-((4-异硫氰酸丁基)硫代)苯基)磺胺基)萘-1-基)-4-甲氧基苯基)磺胺基)乙酰胺)：白色固体(67mg,0.082mmol,33.35％yield)。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.34–8.13(m,2H),7.63–7.52(m,6H),7.50(d,J＝8.6Hz,1H),7.43(d,J＝8.4Hz,1H),7.31(d,J＝29.4Hz,2H),7.17–7.13(m,1H),7.11–6.83(m,5H),4.37–4.18(m,4H),3.89(d,J＝40.2Hz,3H),3.78–3.71(m,2H),3.23–3.10(m,2H),1.85–1.68(m,4H).HRMS(+ESI)m/z:728.1332[M+H]+。
化合物8d(2-((N-(4-((N-(2-氨基-2-氧乙基)-4-((5-异硫氰酸酯基)硫代)苯基)磺胺基)萘-1-基)-4-甲氧基苯基)磺胺基)乙酰胺)：白色固体(122mg,0.164mmol,40.67％yield)。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.38–8.08(m,2H),7.62–7.39(m,8H),7.31(d,J＝29.4Hz,2H),7.22–6.82(m,6H),4.40–4.16(m,4H),3.89(d,J＝39.8Hz,3H),3.69(q,J＝6.6Hz,2H),3.17–3.06(m,2H),1.78–1.62(m,4H),1.57–1.46(m,2H).HRMS(+ESI)m/z:742.1512[M+H]+。
S141，低温下，化合物A1与间氯过氧苯甲酸在溶剂中反应，反应产物经分离，制备所述萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子。
例如，将化合物8a(30mg,0.0429mmol)与间氯过氧苯甲酸(5.18mg,0.03mmol)加入到四氢呋喃中，0℃下反应3小时,TLC(DCM/MeOH＝9/1,Rf＝0.67)原料基本反应完毕。柱层析分离(6-10％MeOH in DCM)获得(13mg,0.018mmol,42％yield)白色固体。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.94–7.78(m,4H),7.74-7.59(m,4H),7.41–7.10(m,6H),7.08–6.83(m,4H),4.37-4.15(m,4H),3.95-3.81(m,5H),3.57-3.48(m,2H).HRMS(+ESI)m/z:738.0811[M+H]+，即为2-((N-(4-((N-(2-氨基-2-氧乙基)-4-((2-异硫氰酸乙酯)亚砜基)苯基)磺胺基)萘-1-基)-4-甲氧基苯基)磺胺基)乙酰胺(以下记作SCN-3)，结构式为：
同理，利用化合物8b、化合物8c、化合物8d分别制备SCN-6、SCN-9和SCN-12。
SCN-6(2-((N-(4-((N-(2-氨基-2-氧乙基)-4-((3-异硫氰酸丙基)亚砜基)苯基)磺胺基)萘-1-基)-4-甲氧基苯基)磺胺基)乙酰胺)：白色固体(15mg,0.021mmol,45.44％yield)；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.43–8.09(m,2H),7.75–7.28(m,10H),7.27–6.76(m,7H),4.48–4.14(m,4H),3.97-3.88(m,3H),3.20-3.09(m,4H),1.97(dt,J＝6.6,11.4Hz,2H).HRMS(+ESI)m/z:730.1115[M+H]+。
SCN-9(2-((N-(4-((N-(2-氨基-2-氧乙基)-4-((4-异硫氰酸丁基)亚砜基)苯基)磺胺基)萘-1-基)-4-甲氧基苯基)磺胺基)乙酰胺)：白色固体(97mg,0.13mmol,48.5％yield)。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.34–8.05(m,2H),7.95–7.75(m,4H),7.68–7.26(m,6H),7.21–6.81(m,6H),4.48–4.16(m,4H),3.95–3.81(m,3H),3.70(t,J＝6.0Hz,2H),3.19–3.09(m,1H),2.87(d,J＝12.6Hz,1H),2.05-1.95(m,1H),1.75(d,J＝6.2Hz,1H),1.53–1.45(m,1H),1.31–1.26(m,1H).HRMS(+ESI)m/z:744.1275[M+H]+。
SCN-12(2-((N-(4-((N-(2-氨基-2-氧乙基)-4-((5-异硫氰酸酯基)亚砜基)苯基)磺胺基)萘-1-基)-4-甲氧基苯基)磺胺基)乙酰胺)：白色固体(30mg,0.039mmol,28.78％yield)。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.41–8.12(m,4H),7.57–7.31(m,8H),7.29–6.82(m,6H),4.48–4.20(m,4H),3.92(d,J＝36.4Hz,3H),3.80–3.72(m,2H),3.20–3.09(m,2H),1.80–1.64(m,4H),1.59–1.47(m,2H).HRMS(+ESI)m/z:758.1453[M+H]+。
对上述合成的化合物进行药理学实验，包括体外活性考察实验和体内作用机制研究。
1.体外活性考察
1.1荧光偏振法测定Keap1-NRf2蛋白结合抑制活性
荧光探针(FITC–βAla–DEETGEF–OH)溶解于缓冲液(10mM HEPES,pH 7.4,3.4mMEDTA,150mM NaCl,0.005％Tween-20)稀释至10nM，加入到梯度稀释的Keap1蛋白中，室温避光孵育60分钟，荧光各向异性值用SpectraMax M5e酶标仪读取(ex:485nm,em:535nm)。蛋白结合常数根据荧光各向异性值Mathematica7(Wolfram Research Inc.)拟合得到KD1＝329nM。
1.2ROS检测(DCFH-DA法)和NO检测
C57BL/6雌性小鼠，腹腔注射3％Brewer改良硫乙醇酸盐肉汤(3ml),1天1次共3天，第4天提取巨噬细胞，细胞在37℃含5％CO2的湿润空气中培养12小时，去掉上清液，加入100ul的用DMEM培养液配好的化合物(10μM),1小时后吸出上清液，加入含有LPS(1μg/ml)+化合物的DMEM培养液，6小时后用活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen SpeciesAssayKit,S0033，Beyotime，中国)根据制造商的说明书使用市售试剂盒进行检测；NO检测同理，加入含有LPS(100ng/ml)以及化合物的DMEM培养液，24小时后用NO(硝酸盐/亚硝酸盐测定试剂盒，S0023，Beyotime，中国)根据制造商的说明书使用市售试剂盒进行检测。结果见表1。
1.3ELISA和CCK8测试
巨噬细胞在在37℃含5％CO2的湿润空气中培养12小时，然后在暴露于LPS(100ng/mL)之前1小时用化合物预处理。LPS刺激4小时后，收集无细胞的上清液用于分析TNF-α含量，用SpectraMax M5酶标仪(Molecular Devices，California)在450nm处记录化学发光值。此外，细胞中加CCK8(CCK试剂盒)测其细胞毒性。结果见表1。
表1体外活性考察结果统计表
请一并参看图3，体外活性考察结果显示，上述制备的化合物SCN-1、SCN-3、SCN-6、SCN-9、SCN-12具有优秀的抗炎活性和较低的毒性，同时，具有优异的的靶点活性。
2.体外机制研究
2.1巨噬细胞在经化合物SCN-1、SCN-6和SFN处理1小时、3小时和6小时后，使用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂混合物的胞浆裂解液(Invent Biotechnologies,China)提取胞浆蛋白质和细胞核，使用BCA蛋白测定试剂盒(Beyotime Biotechnology,China)建立标准蛋白曲线。将胞浆蛋白质(40μg)和胞核蛋白质(20μg)通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离并转移到PVDF膜上(Millipore，Bedford，MA，U.S.A.)。用5％BSA将膜封闭2小时，在1％BSA中以1:500的稀释度制备一抗。将封闭的膜与相应的一抗在4℃下孵育过夜，然后在室温下与标记的二抗(1:4000)孵育1小时。
使用LI-COR Odyssey系统捕获并分析信号，结果见图4所示，图4是化合物SFN和化合物SCN-1的蛋白免疫印迹结果示意图。抗体商业来源：NRf2(ab137550)抗体购自AbcamTechnology(Abcam Technology，英格兰)，LaminB1(ab16048)抗体购自Abcam Technology(Abcam Technology，英格兰),GAPDH抗体(Abcam Cat#ab181602)。实验结果表明，给药3小时后，SCN-1处理后的巨噬细胞核中NRf2的含量上调，细胞浆中NRf2的含量下调，提示SCN-1可以诱导NRf2发生核转位，发挥抗氧化作用。
使用LI-COR Odyssey系统捕获并分析信号，结果见图8所示，图8是化合物SFN和化合物SCN-6的蛋白免疫印迹结果示意图。抗体商业来源：NRf2(ab137550)抗体购自AbcamTechnology(Abcam Technology，英格兰)，LaminB1(ab16048)抗体购自Abcam Technology(Abcam Technology，英格兰),GAPDH抗体(Abcam Cat#ab181602)。实验结果表明，给药3小时后，SCN-6处理后的巨噬细胞核中NRf2的含量上调，细胞浆中NRf2的含量下调，提示SCN-6可以诱导NRf2发生核转位，发挥抗氧化作用。
2.2化合物SCN-1、SCN-6在LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型作用考察
将雌性C57BL/6小鼠(6-8周龄，18-22g/只)随机分为五组：溶剂对照组(PBS含2％DMSO、1％蓖麻油、3％吐温-80)对照组、化合物SCN-1高剂量(20mg/kg)组和化合物SCN-1低剂量(5mg/kg)，化合物SCN-6高剂量(20mg/kg)组和化合物SCN-6低剂量(5mg/kg)，每组10只小鼠。化合物以给定剂量腹腔注射半个小时后再经腹腔注射LPS(15mg/kg),6小时后处死小鼠，双侧肺BALF、眼球取血以及肺部进行后续检测。通过Elisa方法测试了各组小鼠BALF中的炎症因子(TNF-α)。结果如图5、图9所示，化合物SCN-1、SCN-6能显著降低炎症因子(TNF-α)的含量。此外，提取总RNA，实时定量PCR(qRT-PCR)分析表明结果如图6、图10所示。SCN-1、SCN-6在5mg/kg和20mg/kg均可以剂量依赖性的下调炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达。由以上结果分析可得出，化合物SCN-6可以通过下调炎症因子发挥抗炎效果从而达到抗急性肺损伤的作用。
3.体内机制研究
3.1提取方式参照细胞中胞浆胞核蛋白的提取。
实验结果如图7、图11所示，在SCN-1(5mg/kg)、SCN-6(5mg/kg)的小鼠肺部组织中胞核中NRf2明显上调，而SCN-1(20mg/kg)、SCN-6(20mg/kg)导致NRf2在胞浆中表达增加，在胞核中表达减少。
萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子化合物在FP实验中均能有效地抑制Keap1-NRf2相互作用。进一步地，又验证化合物SCN-1、SCN-6降低LPS诱导原代巨噬细胞产生的炎症因子水平。体内小鼠炎症模型研究中，化合物SCN-1、SCN-6可通过显著降低小鼠BALF中炎症因子的产生。
本发明提供一类活性好、结构新颖并具有成药性潜力的萘磺胺异硫氰酸酯类Keap1-NRf2 PPI小分子抑制剂，可以干扰Keap1-NRf2相互作用，激活NRf2，降低细胞炎症因子和增强细胞抗氧化能力，从而减轻炎症损伤，具有潜在的抗急性肺损伤的作用，可用于制备成预防或治疗急性肺损伤的药物。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。
Claims (7)
1.一种萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子，其特征在于，具有如式Ⅱ所示的结构式：
其中，-NCS表示-N＝C＝S。
2.一种萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子，其特征在于，具有如式Ⅳ所示的通式：
其中，-NCS表示-N＝C＝S；
3.一种如权利要求1或2中所述的萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
结构式为
的化合物与TDP在溶剂中反应，反应产物经浓缩，分离，得到所述萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子。
4.一种如权利要求2所述的萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：低温下，通式为
的化合物A与间氯过氧苯甲酸在溶剂中反应，反应产物经分离，制备所述萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子；
其中，
-NCS表示-N＝C＝S；
M为
n＝2,3,4或5。
5.如权利要求4所述的萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：
通式为
的化合物B加入二氯甲烷与三氟乙酸的混合液中进行反应,反应产物调PH至碱性，萃取，有机相经洗涤，干燥，浓缩制化合物C；其中，R为
n＝2,3,4或5；
化合物C与二(2-吡啶)硫代碳酸酯加入溶剂中，在氮气保护下反应，反应产物经柱层析分离，制备化合物A；
三二亚苄基丙酮二钯和4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽加入到无水N-甲基吡咯烷酮中，氮气保护下，加入N,N-二异丙基乙胺，加入结构式为
的化合物D以及2-(2-氨基乙基硫代)乙基氨基甲酸叔丁酯、(3-巯基丙基)氨基甲酸叔丁酯、叔丁基(4-巯基丁基)氨基甲酸酯、2-(5-巯基)异吲哚-1,3-二酮中的一种，反应产物萃取，有机相经洗涤，干燥，柱层析分离制备化合物B；
结构式为
的化合物E加入吡啶中，随后低温下加入4-碘基苯磺酰氯，搅拌反应；向反应产物中加入水，过程中形成固体，静置，并倒出液体，残余固体中加入乙酸乙酯和石油醚，搅拌，过滤，固体用石油醚洗涤，制备化合物D。
6.一种如权利要求1～2中任意一项所述的萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子作为制备治疗氧化应激损伤引发的疾病的药物中的应用，所述氧化应激损伤由Keap1-NRf2蛋白结合导致。
7.一种如权利要求1～2中任意一项所述的萘磺胺异硫氰酸酯类双功能小分子作为制备预防或治疗氧化应激损伤引发的急性肺损伤的药物中的应用，所述氧化应激损伤由Keap1-NRf2蛋白结合导致。
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