CN112386672A

CN112386672A - 一种治疗间质性肺疾病的中药组合物及其应用

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Publication number: CN112386672A
Application number: CN201910746186.8A
Authority: CN
Inventors: 李友林
Original assignee: China Japan Friendship Hospital
Current assignee: China Japan Friendship Hospital
Priority date: 2019-08-13
Filing date: 2019-08-13
Publication date: 2021-02-23

Abstract

本发明提供一种治疗间质性肺疾病的中药组合物，所述中药组合物由如下原料药制成：黄芪8‑35重量份、桂枝8‑35重量份、杜仲6‑30重量份、干姜5‑25重量份、附子4‑22重量份、白芍4‑22重量份、五味子3‑16重量份、三七3‑16重量份、甘草3‑16重量份。本发明中药组合物治疗间质性肺疾病临床疗效较好，治疗后主、次要疗效指标均优于治疗前，总有效率达到76.72％。

Description

一种治疗间质性肺疾病的中药组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种中药组合物及其应用，具体涉及一种治疗间质性肺疾病的中药组合物及其应用。

背景技术

间质性肺疾病(Interstitial lung Disease，ILD)属中医学“肺痿”范畴，以咳嗽、胸闷、呼吸困难为主要临床表现。中医认为ILD是以肺脾为核心的脏腑功能失调、身体机能状态整体下降为基本病理改变的疾病。ILD患者由于肺脏虚损、津气严重耗伤、以致肺叶枯萎因津伤肺燥，燥盛则干，肺叶弱而不用则萎。肺气的充实，有赖于脾气的输布，脾气虚则肺气虚。而气之根在肾，肾虚则摄纳无权，气不归元，阳气阴津易于耗散。本病的表现在肺，但其病理变化与脾、胃、肾有密切关系。肺主气，脾为气血生化之源。脾胃运化水谷精微来充养肺气，脾气虚弱，运化无权，致肺气不足，气不化津以致肺失濡养，肺叶枯萎，发为肺痿。

间质性肺疾病病机本质呈现虚实寒热错杂，证候特征以肺脾两虚为主，涉及多个脏器的功能虚损，故而，只有进行“以肺脾为核心的脏腑整体辨证”，运用“温润辛金培本”的治疗原理，才能从本质上对间质性肺疾病进行治疗。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本申请提供一种治疗间质性肺疾病的中药组合物及其应用。

作为本申请的一个方面，本申请提供一种治疗间质性肺疾病的中药组合物，该中药组合物由如下原料药制成：黄芪、桂枝、杜仲、干姜、附子、白芍、五味子、三七、甘草。

在具体的实施方式中，所述中药组合物由如下重量比的原料药制成：黄芪8-35重量份、桂枝8-35重量份、杜仲6-30重量份、干姜5-25重量份、附子4-22重量份、白芍4-22重量份、五味子3-16重量份、三七3-16重量份、甘草3-16重量份。

在优选的实施方式中，所述中药组合物由如下重量比的原料药制成：黄芪10-28重量份、桂枝10-28重量份、杜仲8-25重量份、干姜7-22重量份、附子5-20重量份、白芍5-20重量份、五味子4-14重量份、三七4-14重量份、甘草4-14重量份。

在进一步优选的实施方式中，所述中药组合物由如下重量比的原料药制成：黄芪15-24重量份、桂枝15-24重量份、杜仲12-19重量份、干姜10-16重量份、附子7-14重量份、白芍7-14重量份、五味子5-9重量份、三七5-9重量份、甘草5-9重量份。

在最优选的实施方式中，所述中药组合物由如下重量比的原料药制成：

黄芪18重量份、桂枝18重量份、杜仲15重量份、干姜12重量份、附子9重量份、白芍9重量份、五味子6重量份、三七6重量份、甘草6重量份；

或，黄芪16重量份、桂枝22重量份、杜仲13重量份、干姜14重量份、附子8重量份、白芍13重量份、五味子6重量份、三七8重量份、甘草6重量份；

或，黄芪22重量份、桂枝16重量份、杜仲18重量份、干姜11重量份、附子13重量份、白芍8重量份、五味子8重量份、三七6重量份、甘草8重量份。

作为优选的实施方式，所述黄芪为生黄芪；所述附子为制附子；所述甘草为生甘草。

本发明所述中药组合物可以是各原料药粉碎后混合而成的组合物，也可以混合或单独提取后得到的提取物，或者是提取物进一步精制纯化得到的有效部位，还可以是加入药学上可接受的辅料制成的常规剂型。

其中，所述提取方法包括煎煮提取、回流提取、浸渍提取、超声提取、渗漉提取、微波提取等；所述纯化方法包括水提醇沉、碱溶酸沉以及各种柱色谱纯化方法，如大孔树脂柱、硅胶柱、凝胶柱、反相柱等；所述常规剂型包括但不限于注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、凝胶剂、缓释剂、口服液、滴丸剂或纳米制剂；所述药学可接受的辅料包括：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等。

本发明所述中药组合物除以上述原药材形式投料外，还可以采用以提取物(有效部位)的形式投料，因此，作为本发明的另一个方面，本发明进一步公开了一种治疗间质性肺疾病的中药组合物，所述中药组合物由如下重量比的原料制成：

黄芪提取物8-35重量份、桂枝提取物8-35重量份、杜仲提取物6-30重量份、干姜提取物5-25重量份、附子提取物4-22重量份、白芍提取物4-22重量份、五味子提取物3-16重量份、三七提取物3-16重量份、甘草提取物3-16重量份。

在具体的实施方式中，所述中药组合物由如下重量比的原料制成：

黄芪提取物10-28重量份、桂枝提取物10-28重量份、杜仲提取物8-25重量份、干姜提取物7-22重量份、附子提取物5-20重量份、白芍提取物5-20重量份、五味子提取物4-14重量份、三七提取物4-14重量份、甘草提取物4-14重量份。

在优选的实施方式中，所述中药组合物由如下重量比的原料制成：

黄芪提取物15-24重量份、桂枝提取物15-24重量份、杜仲提取物12-19重量份、干姜提取物10-16重量份、附子提取物7-14重量份、白芍提取物7-14重量份、五味子提取物5-9重量份、三七提取物5-9重量份、甘草提取物5-9重量份。

在进一步优选的实施方式中，所述中药组合物由如下重量比的原料制成：

黄芪提取物18重量份、桂枝提取物18重量份、杜仲提取物15重量份、干姜提取物12重量份、附子提取物9重量份、白芍提取物9重量份、五味子提取物6重量份、三七提取物6重量份、甘草提取物6重量份。

上述提取物可以是按常规方法提取制备得到的提取物，还可以是经进一步纯化精制制备得到的有效部位；所述常规提取方法包括煎煮提取、回流提取、浸泡提取、超声提取或渗漉提取中的一种或几种方式；所述提取溶剂为水或与水互溶的有机溶剂；进一步为甲醇、乙醇、丙酮中的一种或几种；更进一步优选为50-90％的乙醇；更进一步优选为60-80％的乙醇；所述纯化精制方法包括水提醇沉、萃取或经过大孔树脂柱、硅胶柱纯化等。优选为各原料药的水提取物。

作为本发明的第二个方面，本发明还提供了所述中药组合物在制备治疗间质性肺疾病的药物中的应用。

所述间质性肺疾病包括间质性肺病、肺间质纤维化、间质性肺炎、机化性肺炎。

作为本发明的第三个方面，本发明还提供了所述中药组合物在制备具有抗炎作用的药物中的应用。

作为本发明的第四个方面，本发明还提供了所述中药组合物在制备具有抗纤维化作用的药物中的应用。

本发明组方中黄芪补气固表、健脾益肺，为君药；桂枝温通经脉、助阳化气，杜仲补益肝肾，干姜温中散寒，回阳通脉，三者为臣药，共助君药健脾益肺补肾；附子温补肾阳，三七活血养血，五味子收敛固涩、益气生津，白芍养血调经、调和营卫，四者共为佐药；甘草补脾益气，调和诸药，为使药。全方益气温阳、通脉生肺，适用于肺脾肾多脏虚损所致中医肺痿，症见渐进性活动后呼吸困难，间质性肺疾病。

本发明通过对所述中药组合物治疗的116例ILD患者自身前后对照临床研究观察，说明本发明中药组合物治疗ILD临床疗效较好，治疗后主、次要疗效指标均优于治疗前，总有效率达到76.72％；充分继承了中医的整体观念和脏腑辨证理论，反映了ILD患者以肺脾为核心的脏腑功能失调、身体机能状态整体下降的本质问题；弥补了目前中成药多从实证着手，以祛除邪实为主，稍兼顾扶正，总体对人体正气固护不全面的缺陷。

附图说明

图1为大鼠HE染色肺组织切片。

图2为大鼠Masson染色肺组织切片。

具体实施方式

实施例1

组方：黄芪18g、桂枝18g、杜仲15g、干姜12g、附子9g、白芍9g、五味子6g、三七6g、甘草6g；

制备方法：按比例取各原料药，水煎煮提取，得中药组合物汤剂。

实施例2

组方：黄芪16g、桂枝22g、杜仲13g、干姜14g、附子8g、白芍13g、五味子6g、三七8g、甘草6g；

实施例3

组方：黄芪22g、桂枝16g、杜仲18g、干姜11g、附子13g、白芍8g、五味子8g、三七6g、甘草8g；

实施例4

组方：黄芪20g、桂枝17g、杜仲17g、干姜12g、附子11g、白芍9g、五味子7g、三七5g、甘草7g；

制备方法：取处方量的原料药，加10倍量70％乙醇回流提取2次，每次1.5小时；合并提取液，滤过，回收乙醇并浓缩；浓缩液减压干燥，粉碎成细粉，加入淀粉，混匀，制粒，再加入硬脂酸镁，混匀，压片，即得组合物片剂。

实施例5

组方：黄芪17g、桂枝20g、杜仲14g、干姜15g、附子9g、白芍11g、五味子5g、三七7g、甘草5g；

制备方法：取处方量的原料药，加10倍量80％乙醇超声提取3次，第一次40min，第2、3次各20min，合并提取液，滤过，减压浓缩；浓缩液减压干燥，粉碎成细粉，加入常规辅料，混匀；干压制粒，装入胶囊，即得组合物胶囊剂。

实施例6

组方：黄芪12g、桂枝25g、杜仲11g、干姜18g、附子6g、白芍16g、五味子4g、三七12g、甘草4g；

制备方法：取处方量的原料药，加入8倍量水浸渍6h，渗漉24h，流速2L/h。收集渗漉液，离心，上大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用60％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，滤液浓缩，干燥，粉碎成细粉，再加入制药上可接受的辅料按照本领域制剂的常规技术制成滴丸剂。

实施例7

组方：黄芪25g、桂枝12g、杜仲22g、干姜8g、附子16g、白芍6g、五味子12g、三七4g、甘草12g；

制备方法：取处方量的原料药，加水煎煮2次，第一次2小时，第二次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩，浓缩液加乙醇至含醇量至70％，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，并浓缩至相对密度为1.15(60℃)，加水至1000ml，过滤，加热煮沸灭菌，即得组合物口服液。

实施例8

组方：黄芪14g、桂枝27g、杜仲9g、干姜20g、附子7g、白芍18g、五味子5g、三七13g、甘草5g。

实施例9

组方：黄芪27g、桂枝14g、杜仲24g、干姜10g、附子18g、白芍7g、五味子13g、三七5g、甘草13g。

实施例10

组方：黄芪9g、桂枝30g、杜仲7g、干姜24g、附子5g、白芍22g、五味子3g、三七15g、甘草3g。

实施例11

组方：黄芪30g、桂枝9g、杜仲27g、干姜6g、附子22g、白芍5g、五味子15g、三七3g、甘草15g。

实施例12

组方：黄芪提取物18g、桂枝提取物18g、杜仲提取物15g、干姜提取物12g、附子提取物9g、白芍提取物9g、五味子提取物6g、三七提取物6g、甘草提取物6g。

实施例13

组方：黄芪提取物16g、桂枝提取物22g、杜仲提取物13g、干姜提取物14g、附子提取物8g、白芍提取物13g、五味子提取物6g、三七提取物8g、甘草提取物6g。

实施例14

组方：黄芪提取物22g、桂枝提取物16g、杜仲提取物18g、干姜提取物11g、附子提取物13g、白芍提取物8g、五味子提取物8g、三七提取物6g、甘草提取物8g。

实施例15

组方：黄芪提取物20g、桂枝提取物17g、杜仲提取物17g、干姜提取物12g、附子提取物11g、白芍提取物9g、五味子提取物7g、三七提取物5g、甘草提取物7g。

实施例16

组方：黄芪提取物17g、桂枝提取物20g、杜仲提取物14g、干姜提取物15g、附子提取物9g、白芍提取物11g、五味子提取物5g、三七提取物7g、甘草提取物5g。

实施例17

组方：黄芪提取物12g、桂枝提取物25g、杜仲提取物11g、干姜提取物18g、附子提取物6g、白芍提取物16g、五味子提取物4g、三七提取物12g、甘草提取物4g。

实施例18

组方：黄芪提取物25g、桂枝提取物12g、杜仲提取物22g、干姜提取物8g、附子提取物16g、白芍提取物6g、五味子提取物12g、三七提取物4g、甘草提取物12g。

实施例19

组方：黄芪提取物14g、桂枝提取物27g、杜仲提取物9g、干姜提取物20g、附子提取物7g、白芍提取物18g、五味子提取物5g、三七提取物13g、甘草提取物5g。

实施例20

组方：黄芪提取物27g、桂枝提取物14g、杜仲提取物24g、干姜提取物10g、附子提取物18g、白芍提取物7g、五味子提取物13g、三七提取物5g、甘草提取物13g。

实施例12-20所述提取物为各原料药的水提取物。

实施例21临床试验

1资料与方法

1.1.一般资料

选取2015年07月至2018年12月就诊于中日友好医院中医肺病二部、符合间质性肺疾病(间质性肺病、肺间质纤维化、间质性肺炎、机化性肺炎)诊断的患者病例资料116例，年龄(65.06±11.08)岁，其中男56例，女60例。

1.2.纳入标准

①经HRCT或病理活检结果诊断为间质性肺疾病(间质性肺病、肺间质纤维化、间质性肺炎、机化性肺炎)的患者，入选患者至少有一次初诊时CT和肺功能的检查；②年龄≥18周岁，性别不限；③神志清楚、思维正常、能进行语言沟通。

1.3.排除标准

①妊娠或哺乳期妇女；②伴有其它严重疾病患者；③合并精神疾病或严重神经官能症患者；④不能表达主观不适症状者；⑤同时接受吸入皮质类固醇治疗，或有胸部其他异常而可能干扰疗效评估者；⑥诊断为特殊类型的间质性肺疾病，如过敏性肺泡炎、结节病、肺淋巴管平滑肌瘤。

1.4.疗效指标

1.4.1主要疗效指标

1.4.1.1主要相关症状积分

医生记录患者主要相关症状积分，主要相关症状积分标准：见表1。

表1主要相关症状积分标准

1.4.1.2兼次相关症状积分

医生记录患者出现的除呼吸困难、咳嗽以外的临床症状积分，可能出现的临床症状包括喘息、胸闷、憋气、气短、咯痰、大便异常、小便不调、口苦、口干、眠差、乏力、汗出、纳差、腹胀、手足不温、皮疹、关节痛、眼部不适等。所有兼症积分相加，为治疗总积分。

1.4.2次要疗效指标

肺功能检查

治疗前后的肺功能检查对比(FVC、FEV1、PEF、DLCO-SB)。

1.4.3疗效判定标准

参照《中药新药临床研究指导原则》2002年版：临床痊愈：临床症状、体征消失或基本消失，证候积分减少≥95％；显效：临床症状、体征明显改善，证候积分减少≥70％但＜95％；有效：临床症状、体征均有好转，证候积分减少≥30％但＜70％；无效：临床症状、体征无明显改善，甚或加重，证候积分减少不足30％。

证候积分计算公式(尼莫地平法)＝[治疗前积分－治疗后积分]÷治疗前积分×100％。

1.5方法

1.5.1实验药物

实施例1制备的水煎剂，每日一剂，分2次服，7d为1个疗程，连服2个疗程，共14d。

1.5.2统计学方法

使用SPSS 25.0对各项资料进行统计、分析，各项参数以

表示，采用配对Wilcoxon符号秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1临床疗效

116例患者中，显效29例，占25.00％；有效60例，占51.72％；无效27例，占23.28％；总有效率76.72％。

2.2治疗前后症状体征积分比较

结果见表2。治疗后症状总积分、主要症状呼吸困难、咳嗽均显著低于治疗前，差异有统计学意义(P＜0.01)。

表2 116例患者治疗前后状体征积分比较(

分)

项目	治疗前	治疗后
			症状总分	24.76±3.95	12.47±5.68**
呼吸困难	1.93±0.64	1.06±0.61**
			咳嗽	2.15±0.75	1.00±0.69**

注：与治疗前比较，**P＜0.01。下表同。

2.3治疗前后肺功能FVC、FEV1、PEF、DLCO-SB比较见表3。治疗后FVC、FEV1、DLCO-SB均显著低于治疗前，差异有统计学意义(P＜0.01)。

表3 116例患者治疗前后肺功能比较(

分)

本发明通过对所述中药组合物治疗的116例ILD患者自身前后对照临床研究观察，说明本发明中药组合物治疗ILD临床疗效较好，治疗后主、次要疗效指标均优于治疗前，总有效率达到76.72％。

中医认为肺纤维化的基本病机多为本虚标实，虚实夹杂，标实多为瘀血、痰湿、热毒，临床治疗多以补虚泻实、标本兼顾，益气补血、活血化瘀等法运用最多。常用中药包括：补气药：黄芪、人参、西洋参、白术、大枣、甘草；温里药：干姜、制附子；补阳药：蛤蚧、杜仲、冬虫夏草；补阴药：麦冬、女贞子；补血药：白芍、熟地、当归、川芎；止咳化痰药：紫菀、贝母、橘红、白果叶、桔梗、瓜蒌、旋覆花；通络息风止痉药：地龙、全蝎、皂角刺；活血化瘀药：丹参、桃仁、三七、水蛭、姜黄；清热凉血药：赤芍、玄参、紫草、丹皮；发散风寒药：桂枝、防风、白芷、细辛；收涩药：五味子、山茱萸、诃子、乌梅等。

在本发明以前，发明人对常用中药进行了筛选，按照不同配伍原则建立了不同组方，经考察其有效率均不如本发明组方：

组方1：黄芪10g、西洋参3g、白术6g、麦冬9g、川贝母4g、赤芍12g、玄参9g、橘红3g、丹参9g、桃仁9g、防风5g、女贞子6g、蛤蚧3g、甘草2g。经过3个月的治疗，治疗组34例患者中改善3例，稳定21例，无效10例，总有效率达70.59％；

组方2：西洋参15g、三七3g、山茱萸15g、五味子15g、紫菀15g、麦冬15g、白果叶10g、炙甘草10，水煎服，每次100mL，每日2次，疗程2个月。治疗组61例患者的总有效率为62.3％。

本发明组方中黄芪补气固表、健脾益肺，为君药；桂枝温通经脉、助阳化气，杜仲补益肝肾，干姜温中散寒，回阳通脉，三者为臣药，共助君药健脾益肺补肾；附子温补肾阳，三七活血养血，五味子收敛固涩、益气生津，白芍养血调经、调和营卫，四者共为佐药；甘草补脾益气，调和诸药，为使药。全方益气温阳、通脉生肺，适用于肺脾肾多脏虚损所致中医肺痿。相对于其他组方配伍效果显著。

实施例22本发明中药组合物对博来霉素所致大鼠肺纤维化的影响

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物

SPF级SD雄性大鼠90只，体质量200±20g(北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号为SCXK(京)2012-0001)。动物室为清洁级，环境湿度22±2℃，相对湿度60-80％，普通专用饲料喂养，避免噪音及其它干扰，毎天定时清洁动物房，更换大鼠饮用水及添加饲料，隔天更换实验鼠用笼具。适应环境1周，活动、粪便等均未见异常后进行实验。

1.1.2药物与试剂

1.1.2.1实验药物

受试药物：生黄芪18g、桂枝18g、杜仲15g、干姜12g、制附子9g、白芍9g、五味子6g、三七6g、生甘草6g。根据《2010中国药典》标准上述药物从北京同仁堂中药饮片有限责任公司一次性购齐并鉴定，原方海合后加8倍量水，浸泡30min，按照12℃取时间依次为2h，分别将3次提取液过滤，80℃浓缩，置4℃冰箱中保存备用；

阳性对照药：醋酸泼尼松片(天津力生制药股份有限公司，国药准字H12020122生产批号1705021)；

1.1.2.2实验试剂

见表4。

表4实验试剂

1.1.2.3实验仪器

见表5。

表5实验仪器

仪器	公司
		ASP300脱全自动多功能酶标仪	MULTISKAN MK3(Thermo公司)
高速冷冻离心机	上海卢湘仪离心机仪器有限公司
		显微镜	日本OLYMPUS公司
图像分析软件	MIAS
		采图软件Nikon NIS—Elements D 3.2	日本尼康公司
BX51水机	德国LEICA公司
		EG1150H包埋机	德国LEICA公司
RM2235切片机	德国LEICA公司
		H I1 210摊片机	德国LEICA公司

1.2实验方法

1.2.1动物分组

90只SD雄性大鼠，随机数字表法分为：正常对照组，模型对照组，醋酸泼尼松组(6mg/kg)，本发明组合物大(20g生药/kg)、中(10g生药/kg)、小剂量组(5g生药/kg)，每组15只。

1.2.2模型建立

大鼠适应环境1周后，除正常对照组外，其余各组气管内注射博莱霉素生理盐水溶液(浓度为3mg/mL)5mg/kg。正常对照组气管内灌注等量生理盐水。注射后立即将大鼠直立并旋转，使药物能够均匀地分布于大鼠的肺内。大鼠清醒后随意进食。

1.2.3给药

模型建立次日，各给药组开始灌胃给药，每日1次，连续28日，正常对照组、模型对照组予生理盐水。

1.2.4标本采集及处理

于造模后第28d进行取材，具体方法是：采用2％戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠，将麻醉后的大鼠，仰卧定位于手术台上，剪开腹腔，暴露腹主动脉取动脉血。再向上剪开胸腔，暴露双肺，用去RNA酶处理的止血错夹闭右侧肺口，取下右肺，右肺上叶放于预先标记好的冻存管中，放入液氮保存以备提取RNA。右肺中叶在预冷的生理盐水中快速洗去血液，剔除结缔组织，放入4％多聚甲酸中以备制病理切片。剪开大鼠颈部皮肤，分离暴露气管，迅速于气管下段作一横型切口，行气管插管，用5ml注射器注入2ml生理盐水，保留2分钟后缓慢回抽，收集于10ml离心管中。如此反复3次，共6ml，回收率＞85％，离心管中肺泡灌洗液(BALF)于离心机中离心5分钟，提取上清液分装于EP管中，置-80℃冰箱中保存以备炎性细胞因子检测。

1.2.5检测指标及方法

1.2.5.1一般情况

每天观察实验期间各组大鼠精神活动、体重变化、摄食、饮水、毛色、呼吸及对外界刺激的反应情况，同时记录大鼠死亡情况及死亡时间，及时进行死亡原因分析。

1.2.5.2气道阻力和动态顺应性检测

给药第28日，给药后1小时，各组大鼠以戊巴比妥钠注射麻醉(2％，60mg/kg)，仰面固定，切开颈部皮肤暴露气管，T形剪开，行气管插管，放入密闭体描箱内，呼吸机辅助通气，待大鼠气道阻力基线稳定后，依次雾化递增浓度的乙酰甲胆碱20μL(0mg/mL、3.125mg/mL、6.25mg/mL、12.5mg/mL、25mg/mL)，检测气道阻力(RL)和动态顺应性(Cdyn)。

1.2.5.3支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞计数

以5mL生理盐水灌洗大鼠双肺，得到BALF，离心，沉淀涂片，HE染色，镜下肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞计数(％)。

1.2.5.4肺脏重量及肺系数

取出肺脏，去除肺外气管，电子天平称重，计算肺系数。

1.2.5.5组织病理学观察

取大鼠肺脏，中性甲醛固定，石蜡包埋，常规切片，分别行HE染色及Masson染色，光镜下观察病理改变(肺泡结构、炎细胞浸润、纤维化等)。

1.2.5.5.1HE染色

10％中性福尔马林固定的标本，常规酒精脱水，二甲苯处理，石蜡包埋，3μm连续切片，烤干备用。二甲苯I、II脱腊l5min。无水乙醇I、无水乙醇II、95％乙醇、80％乙醇逐级水化各2min，流水冲洗，苏木素染色10min，水洗3min，分色液10s，水洗3次，0.25％返蓝液40s，水洗3次，l％伊红染色1min，水洗3次。95％乙醇I、95％乙醇II逐级脱水1min，无水乙醇I、II逐级脱水2min，二甲苯Ⅰ2min，二甲苯Ⅱ、Ⅲ透明5min，中性树胶封固。

1.2.5.5.2Masson染色

Masson染色步骤：切片脱腊脱水处理，苏木素室温浸染1-2min；自来水流水冲洗3-5min，返蓝后用蒸馏水洗片；Masson立春红酸性复红溶液染5min，用1％磷钼酸水溶液浸洗1-2s；苯胺蓝或光绿液染色5min；用哪个0.2％冰醋酸浸洗1-2s；待晾干后，中性树胶封片；光学显微镜观察胶原纤维，阳性结果呈蓝绿色。

1.2.5.5.3参照站Szapiel的分级标准判定肺泡炎和肺纤维化的程度.

肺间质纤维化(Masson染色)和肺泡炎(HE染色)分级及积分标准，见表6。

表6肺泡炎和肺纤维化分级及积分标准

1.2.5.6肺组织匀浆相关指标检测

取肺组织，匀浆，检测羟脯胺酸(HYP)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、III型前胶原、IV型胶原、TIMP-1、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、TGF-β1、IL-6、TNF-α含量。

1.3统计方法

所有数据均以均数±标准差

表示，用SPSS25.0统计软件处理，数据服从正态分布采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，数据不服从正态分布或方差不齐采用非参数检验，以P<0.05或P<0.01为差异有统计学意义。

2.实验结果

2.1大鼠一般状态描述

实验期间共有5只大鼠死亡。其中模型组4只，醋酸泼尼松组1只，死亡原因考虑与BLM的细胞毒性有关，亦不排除与大鼠自身体质及对毒性耐受能力等因素的相关性。

试验期间共有26只大鼠死亡，其中模型组7只，泼尼松组3只，中药低剂量组5只，中药中剂量组4只，中药高剂量组7只。死亡大鼠解剖后发现不同程度的肺淤血、肿胀，个别见胸腔积液。死亡原因考虑与博来霉素细胞毒性有关。

正常组大鼠反应灵敏，精神好，呼吸平稳，身体壮硕，摄食饮水良好，毛色光泽，体重逐渐增加；模型组大鼠表现出精神萎靡不振，呼吸急促，动作迟缓，弓背踡缩，皮毛稀疏无光泽甚至污秽成束，摄食饮水量下降，造模后大鼠体重快速下降，两周后体重缓慢增长。各给药组大鼠一般情况略好于模型组，造模后大鼠体重快速下降，一周后体重呈现不同程度的增长。

2.2气道阻力和动态顺应性检测

与正常组相比，各组大鼠肺顺应性下降(P＜0.05)，模型组、组合物低中高各剂量组气道阻力上升(P＜0.05)；与模型组相比，各组大鼠顺应性呈上升趋势，气道阻力呈下降趋势，但无意义(P＞0.05)，见表7。

表7各组大鼠气道阻力和动态顺应性情况

组别	n	CDYN	RL
				正常组	15	0.40±0.09	0.29±0.04
模型组	8	0.20±0.12<sup>**</sup>	0.52±0.40<sup>*</sup>
				泼尼松组	12	0.26±0.10<sup>**</sup>	0.36±0.13
组合物低剂量组	10	0.23±0.08<sup>**</sup>	0.39±0.06<sup>**</sup>
				组合物中剂量组	11	0.29±0.08<sup>*</sup>	0.42±0.14<sup>**</sup>
组合物高剂量组	8	0.24±0.12<sup>**</sup>	0.42±0.11<sup>**</sup>

注：与正常组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与模型组相比，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01

2.3支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞计数

与正常组相比，泼尼松组支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞比例上升(P＜0.01)，淋巴细胞比例明显降低(P＜0.01)，中性粒细胞比例明显升高(P＜0.01)；低剂量组巨噬细胞比例升高(P＜0.05)，淋巴细胞比例降低(P＜0.05)；模型组、中药中剂量组、中药高剂量组无明显差异(P＞0.05)。与模型组相比，泼尼松组支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞比例上升(P＜0.05)，淋巴细胞比例明显降低(P＜0.05)。与泼尼松组相比，各中药组巨噬细胞比例降低(P＜0.05)，淋巴细胞比例升高(P＜0.05)，中药中剂量组中性粒细胞比例显著降低(P＜0.01)。提示泼尼松组存在免疫功能低下、炎性细胞浸润，考虑可能与激素长期应用出现免疫功能低下有关，见表8。

表8支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞计数

组别	巨噬细胞(％)	淋巴细胞(％)	中性细胞(％)
				正常组	14.09±6.64	82.27±7.86	3.64±2.34
模型组	22.50±9.87	74.17±9.70	3.33±2.58
				泼尼松组	43.18±7.51<sup>**▲</sup>	49.55±7.57<sup>**▲</sup>	7.27±3.44<sup>**▲</sup>
组合物低剂量组	24.00±8.43<sup>*△</sup>	70.50±9.56<sup>*△</sup>	5.50±1.58
				组合物中剂量组	11.50±5.80<sup>▲△△</sup>	86.50±7.09<sup>▲△△##</sup>	2.00±2.58<sup>△△##</sup>
组合物高剂量组	17.14±6.36<sup>△△</sup>	77.14±5.67<sup>△△</sup>	5.71±1.89<sup>&</sup>

注：与正常组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与模型组相比，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01；与泼尼松组相比，^△P<0.05，^△△P<0.01；与中药低剂量组相比，^#P<0.05，^##P<0.01；与中药中剂量组相比，^&P<0.05，^&&P<0.01

2.4肺脏重量及肺系数

2.4.1中药组合物对大鼠肺脏重量的影响

给药结束后，各组较正常组肺脏重量呈现上升趋势，其中模型组、中药组合物低中高剂量组肺脏重量明显升高(P＜0.05)；与模型组相比，泼尼松组肺脏重量明显降低(P＜0.05)；与泼尼松组相比，中药低剂量组肺脏重量明显升高(P＜0.05)，中药中、高剂量组呈上升趋势，但无统计学差异(P＞0.05)，见表9。

表9给药结束后大鼠肺重量

注：与正常组相比，^*P<0.05，^**P<0.01；与模型组相比，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01；与泼尼松组相比，^△P<0.05，^△△P<0.01

2.4.2用药结束后各组大鼠肺系数变化

各组大鼠肺系数无明显差异(P＞0.05)，见表10。

表10给药结束后大鼠肺系数

注：与正常组比较，^*P<0.05，^**P<0.01

2.5组织病理学观察

2.5.1解剖观察

正常组双肺呈粉红色，表面光滑，弹性较好。模型组双肺苍白，弹性差，体积缩小，硬度增加。其余各治疗组均轻于模型组，泼尼松组与模型组大体相当。

2.5.2 HE及Masson染色

正常组大鼠肺组织结构清晰，肺泡壁未见增厚，肺泡上皮细胞结构完整。模型组肺泡间隔明显增宽，成纤维细胞增生，炎症细胞浸润；肺泡结构破坏，部分肺泡腔萎缩消失。模型组、中药组及醋酸泼尼松治疗组肺泡炎性改变，肺实变呈斑片状分布，可见大量成纤维细胞及胶原纤维增生，少量巨噬细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞浸润，气管周围明显。病变区肺实质结构紊乱，肺泡间隔增厚，肺泡结构破坏，肺泡塌陷融合，肺大泡形成，肺泡腔内有多少不等的泡沫细胞(巨噬细胞)浸润；气管纤毛脱落、倒伏、粘连，支气管外壁明显增厚。中药组与模型组相比肺泡炎症或纤维化程度均有不同程度减轻。泼尼松组与模型组相比肺泡炎症或纤维化程度均有不同程度加重。结果见图1、2。

2.5.2.1 HE染色病理评分

与正常组相比，模型组与各治疗组HE染色病理评分明显升高(P<0.01)；与模型组相比，各治疗组病理评分明显降低(P<0.01)，提示中药及泼尼松对BLM所致大鼠肺部炎症均有抑制作用。结果见表11。

表11大鼠HE染色肺组织切片肺泡炎程度

组别	N	-	+	++	+++
						对照组	15	15	0	0	0
模型组<sup>**</sup>	8	0	0	0	8
						泼尼松组<sup>**△△</sup>	11	0	0	8	3
组合物低剂量组<sup>**△△</sup>	10	0	2	6	2
						组合物中剂量组<sup>**△△</sup>	10	0	0	7	3
组合物高剂量组<sup>**△△</sup>	8	0	0	4	4

注：与正常组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与模型组相比，^△P＜0.05，^△△P＜0.01。

2.5.2.2 Masson染色病理评分

与正常组相比，模型组、泼尼松组Masson染色病理学评分明显升高(P<0.01)；与模型组相比，泼尼松组病理评分呈上升趋势，各中药组评分呈下降趋势，但无统计学差别(P＞0.05)，提示中药对BLM所致大鼠肺纤维化发展有一定的抑制作用，泼尼松可能对大鼠肺组织纤维化进展有一定的促进作用，见表12。

表12大鼠Masson染色肺组织切片胶原纤维含量

2.6肺组织匀浆相关指标检测

2.6.1中药组合物对大鼠肺组织TGF-β1的影响

与正常组相比，泼尼松组大鼠肺组织中TGF-β1水平明显升高(P＜0.01)；与模型组相比，各组无明显差异(P＞0.05)；与泼尼松组相比，中药中、高剂量组TGF-β1水平明显降低(P＜0.01)，结果见表13。

表13 ELISA法检测肺组织TGF-β1变化

组别	剂量(g/kg)	n	TGF-β1(ng/mg)
				正常组	-	15	0.042±0.011
模型组	-	8	0.050±0.008
				泼尼松组	0.006	12	0.055±0.008<sup>**</sup>
组合物低剂量组	5	10	0.049±0.007
				组合物中剂量组	10	11	0.035±0.016<sup>△△</sup>
组合物高剂量组	20	8	0.036±0.016<sup>△△</sup>

2.6.2中药组合物对大鼠肺组织MCP-1的影响

与正常组相比，模型组、中药中剂量组、中药高剂量组大鼠肺组织MCP-1水平明显升高(P＜0.05)；与模型组相比，中药低剂量组MCP-1水平明显降低(P＜0.05)；与泼尼松组相比，中药中剂量组MCP-1水平明显升高(P＜0.05)，见表14。

表14 ELISA法检测肺组织MCP-1变化

注：与正常组相比，^*P<0.05，^**P<0.01；与模型组相比，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01；与泼尼松组相比，^△P<0.05，^△△P<0.01；与中药低剂量组相比，^#P<0.05，^##P<0.01

2.6.3中药组合物对大鼠肺组织IL-6的影响

与正常组相比，模型组、泼尼松组大鼠肺组织中IL-6水平明显升高(P＜0.01)；与模型组相比，中药低剂量组、中药中剂量组IL-6水平明显降低(P＜0.05)；与泼尼松组相比，中药低、中、高剂量组IL-6水平明显降低(P＜0.05)，见表15。

表15 ELISA法检测肺组织IL-6变化

组别	剂量(g/kg)	n	IL-6(ng/g)
				正常组	-	15	2.38±0.38
模型组	-	8	2.94±0.30<sup>**</sup>
				泼尼松组	0.006	12	3.18±0.72<sup>**</sup>
组合物低剂量组	5	10	2.48±0.34<sup>▲△△</sup>
				组合物中剂量组	10	11	2.50±0.62<sup>▲△△</sup>
组合物高剂量组	20	8	2.56±0.44<sup>△</sup>

2.6.4中药组合物对大鼠肺组织COLⅣ的影响

与正常组相比，泼尼松组、中药中剂量组、中药高剂量组大鼠肺组织中COLⅣ水平明显升高(P＜0.05)；与模型组相比，中药低剂量组COLⅣ水平明显降低(P＜0.05)，中药中剂量组COLⅣ水平明显升高(P＜0.01)；与泼尼松组相比，中药低剂量组COLⅣ水平明显降低(P＜0.01)，中药中剂量组COLⅣ水平明显升高(P＜0.05)，见表16。

表16 ELISA法检测肺组织COLⅣ变化

组别	剂量(g/kg)	n	COLⅣ(ng/mg)
				正常组	-	15	1.65±0.39
模型组	-	8	1.90±0.22
				泼尼松组	0.006	12	2.07±0.53<sup>*</sup>
组合物低剂量组	5	10	1.52±0.14<sup>▲△△</sup>
				组合物中剂量组	10	11	3.20±0.92<sup>**▲▲△##</sup>
组合物高剂量组	20	8	2.40±0.87<sup>*##</sup>

2.6.5中药组合物粒对大鼠肺组织bFGF的影响

与正常组相比，中药中、高剂量组大鼠肺组织bFGF水平明显升高(P＜0.01)；与模型组相比，中药中、高剂量组大鼠肺组织bFGF水平明显升高(P＜0.05)；与泼尼松组相比，中药中剂量组bFGF水平明显升高(P＜0.05)，见表17。

表17 ELISA法检测肺组织bFGF变化

组别	剂量(g/kg)	n	bFGF(ng/g)
				正常组	-	15	9.41±2.61
模型组	-	8	9.57±2.53
				泼尼松组	0.006	12	10.70±2.35
组合物低剂量组	5	10	9.27±2.42
				组合物中剂量组	10	11	13.08±3.45<sup>**▲▲△#</sup>
组合物高剂量组	20	8	12.64±1.97<sup>**▲#</sup>

2.6.6中药组合物对大鼠肺组织HYP的影响

与正常组相比，泼尼松组、中药中剂量组大鼠肺组织HYP水平明显升高(P＜0.01)；与模型组相比，泼尼松组、中药中剂量组HYP水平明显升高(P＜0.05)；与泼尼松组相比，中药低、中、高剂量组HYP水平无明显差异(P＞0.05)，见表18。

表18 ELISA法检测肺组织HYP变化

2.6.7中药组合物对大鼠肺组织COLⅢ的影响

与正常组相比，泼尼松组大鼠肺组织中COLⅢ水平明显升高，中药中剂量组COLⅢ水平明显降低(P＜0.01)；与模型组相比，中药中剂量组COLⅢ水平明显降低(P＜0.01)；与泼尼松组相比，中药中、高剂量组COLⅢ水平明显降低(P＜0.01)，见表19。

表19 ELISA法检测肺组织COLⅢ变化

2.6.8中药组合物对大鼠肺组织TNF-α的影响

与正常组相比，泼尼松组大鼠肺组织中TNF-α水平明显升高(P＜0.01)；与模型组相比，中药中、高剂量组TNF-α水平明显降低(P＜0.05)；与泼尼松组相比，中药中、高剂量组TNF-α水平明显降低(P＜0.01)，见表20。

表20 ELISA法检测肺组织TNF-α变化

2.6.9中药组合物对大鼠肺组织TIMP-1的影响

与正常组相比，各组大鼠肺组织TIMP-1水平均升高(P＜0.05)；与模型组相比，各组无差异(P＞0.05)；与泼尼松组相比，各组无差异(P＞0.05)，见表21。

表21 ELISA法检测肺组织TIMP-1变化

3结论

单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)属CC-趋化因子，要由巨噬细胞、内皮细胞、单核细胞、树突细胞、上皮细胞等分泌，主要趋化单核/巨噬细胞、淋巴细胞等炎性细胞向病变部位聚集并被激活产生各种细胞因子，导致炎症产生与发展。另外，MCP-1显著刺激肺成纤维细胞合成胶原，并可导致具有成纤维特性的细胞因子或介质产生，促进肌成纤维细胞在肺损伤部位聚集,参与肺纤维化形成，被认为是重要的致纤维化趋化因子。IL-6是一种多功能细胞因子，具有广泛的生物学活性。IL-6能增加胶原蛋白聚集、抑制ECM的分解、刺激成纤维细胞的增殖等。TNF-α是一种促炎性反应细胞因子，其在肺损伤的病理过程中高度表达，参与局部的损伤和炎症反应，导致炎症细胞聚集，进而刺激肺成纤维细胞大量增殖并分泌胶原，并刺激IL-1等其他细胞因子释放，是肺部炎症发生的重要介质。刺激MMP-9和胶原酶的表达和胶原的合成。本研究发现本发明中药组合物可以降低肺组织中MCP、IL-6、TNF-α水平，减轻炎性反应，降低胶原合成，从而发挥抗纤维化作用。本实验结果显示，本发明中药组合物抗炎、抗纤维化的作用趋势优于泼尼松。

急性毒性试验结果显示，ICR小鼠灌胃给予本发明中药组合物最大耐受剂量为357.6g(生药)/kg，相当于临床拟用剂量的3.6倍，且未见异常。

Claims

1.一种治疗间质性肺疾病的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由如下原料药制成：黄芪、桂枝、杜仲、干姜、附子、白芍、五味子、三七、甘草。

2.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由如下重量比的原料药制成：黄芪8-35重量份、桂枝8-35重量份、杜仲6-30重量份、干姜5-25重量份、附子4-22重量份、白芍4-22重量份、五味子3-16重量份、三七3-16重量份、甘草3-16重量份。

3.如权利要求2所述的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由如下重量比的原料药制成：黄芪10-28重量份、桂枝10-28重量份、杜仲8-25重量份、干姜7-22重量份、附子5-20重量份、白芍5-20重量份、五味子4-14重量份、三七4-14重量份、甘草4-14重量份。

4.如权利要求3所述的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由如下重量比的原料药制成：黄芪15-24重量份、桂枝15-24重量份、杜仲12-19重量份、干姜10-16重量份、附子7-14重量份、白芍7-14重量份、五味子5-9重量份、三七5-9重量份、甘草5-9重量份。

5.如权利要求4所述的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由如下重量比的原料药制成：

6.如权利要求1-5任一项所述的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物为各原料药粉碎后混合而成的组合物，或各原料药混合或单独提取后得到的提取物，或是提取物进一步精制纯化得到的有效部位，或加入药学上可接受的辅料制成的常规剂型。

7.如权利要求6所述的中药组合物，其特征在于，所述常规剂型包括注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、凝胶剂、缓释剂、口服液、滴丸剂或纳米制剂。

8.一种治疗间质性肺疾病的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由如下重量比的原料制成：

9.如权利要求8所述的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由如下重量比的原料制成：

10.如权利要求8或9所述的中药组合物，其特征在于，所述提取物为各原料药的水提取物。