CN112386594B

CN112386594B - As1842856在制备预防和/或治疗糖尿病肾病药物中的应用

Info

Publication number: CN112386594B
Application number: CN201910752689.6A
Authority: CN
Inventors: 铁璐; 李学军; 刘倩; 史运迪
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2019-08-15
Filing date: 2019-08-15
Publication date: 2022-12-02
Anticipated expiration: 2039-08-15
Also published as: CN112386594A

Abstract

本发明公开了一种FOXO1选择性抑制剂AS1842856的新用途。本发明所提供的AS1842856(式I)的新用途是其在制备预防和/或治疗糖尿病肾病药物中的应用。本发明的药效学实验证实，通过施加AS1842856可以明显降低糖尿病肾病损伤中血肌酐、血尿素氮的水平、抑制肾脏组织巨噬细胞浸润，其在肾脏保护方面将产生良好的应用前景。

Description

AS1842856在制备预防和/或治疗糖尿病肾病药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种FOXO1选择性抑制剂AS1842856在制备预防和/或治疗糖尿病肾病药物中的应用。

背景技术

糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病一个常见的慢性微血管并发症，是导致终末期肾脏疾病(ESRD)的主要原因，有30％的1型糖尿病患者和40％的2型糖尿病患者会发生糖尿病肾病。然而，迄今尚无有效的DKD治疗方法，研究显示仅血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)及血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)可以一定程度延缓糖尿病肾病的进程，但仍不能阻止其发展，并且可能伴有严重的副作用—包括咳嗽(用于ACEI)和严重的高钾血症，这通常限制了它们的使用。因此，任何新的治疗方法有益作用研究预防和/或治疗糖尿病肾病均具有十分重要的意义。

DKD的特征为血管功能障碍以及慢性炎症，目前研究发现免疫细胞浸润，特别是巨噬细胞在糖尿病肾病的发生及发展中起重要作用。肾脏组织中巨噬细胞积聚的程度与肾组织损伤的严重程度密切相关，高血糖会激活循环中的单核细胞向巨噬细胞分化，导致它们粘附于内皮细胞并迁移到心血管和肾脏组织中。一旦定位，活化的巨噬细胞就会发育成泡沫细胞并产生过氧化物以及促炎和促纤维化细胞因子等，从而影响肾脏组织中几乎所有的细胞，导致细胞外基质积聚、纤维化、细胞功能障碍以及蛋白尿的形成。也是糖尿病肾功能损伤一个重要环节；若能在糖尿病肾病的早期进行有效地治疗，特别是控制蛋白尿的形成，则可以逆转糖尿病肾脏的病理改变。

FOXO1，是有翼插头状转录因子亚家族中最广泛表达的成员之一，它通过调控下游靶基因的转录，直接或间接参与调节细胞增殖、凋亡、自噬、氧化应激以及代谢等诸多生理和病理过程，是疾病研究中一个重要的转录因子。目前仅有日本的Nagashima课题组研究发现了两类FOXO1的选择性抑制剂，其中仅有小分子化合物AS1842856和AS1708727活性较好，目前已经商品化的是AS1842856。AS1842856是一种可进入细胞内的氧代二氢喹啉，它可以通过直接结合FOXO1来抑制其转录活性(IC₅₀为33nM)，而并不结合于ser²⁵⁶-磷酸化的FOXO1以及无活性的FOXO1。基于HepG2细胞报告基因的检测结果显示，AS1842856对于FOXO家族成员FOXO1、FOXO3a和FOXO4功能的抑制率分别为70％、20％和3％。目前尚无该化合物在预防和/或治疗糖尿病肾病中应用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供FOXO1选择性抑制剂AS1842856的药物新用途。

本发明所提供的FOXO1选择性抑制剂AS1842856的药物新用途是其在制备预防和/或治疗糖尿病肾病的产品中的应用。

所述预防和/或治疗糖尿病肾病具体体现在下述方面：

1)降低糖尿病肾病损伤中血肌酐、血尿素氮的水平；

2)降低糖尿病肾病损伤中尿微量白蛋白与尿肌酐比值(ACR)；

3)降低糖尿病肾病损伤中肾脏组织巨噬细胞浸润。

所述产品具体可为药物或保健品。

所述FOXO1选择性抑制剂AS1842856的结构式如式I所示：

以FOXO1选择性抑制剂AS1842856为活性成分制备的预防和/或治疗糖尿病肾病的药物也均属于本发明的保护范围。

所述药物可通过注射、口服、喷射、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

所述药物可以制成注射液、悬浮剂、粉剂、片剂、颗粒剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明的药效学实验证实，FOXO1选择性抑制剂AS1842856能明显降低糖尿病肾病损伤中血肌酐、血尿素氮的水平、尿微量白蛋白与尿肌酐比值，并降低肾脏组织巨噬细胞浸润，其在预防和/或治疗糖尿病肾病方面将产生良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明所述实验例中FOXO1的选择性抑制剂AS1842856对于糖尿病小鼠血糖和体重的影响。(A)各组小鼠体重水平；(B)各组小鼠血糖水平。

图2为本发明所述实验例中FOXO1的选择性抑制剂AS1842856对于糖尿病小鼠血肌酐和血尿素氮水平的影响。(A)AS1842856给予4周后各组小鼠血肌酐水平；(B)AS1842856给予4周后各组小鼠血尿素氮水平；(C)AS1842856给予12周后各组小鼠血肌酐水平；(D)AS1842856给予12周后各组小鼠血尿素氮水平。

图3为本发明所述实验例中FOXO1的选择性抑制剂AS1842856对于糖尿病小鼠尿微量白蛋白肌酐比值(ACR)的影响。(A)AS1842856给予4周后各组小鼠尿ACR值；(B)AS1842856给予12周后各组小鼠尿ACR值。

图4为本发明所述实验例中FOXO1的选择性抑制剂AS1842856对于糖尿病小鼠肾脏组织巨噬细胞F4/80染色，黑色箭头代表阳性(放大倍数×200)。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中所用的FOXO1选择性抑制剂AS1842856购自默克密理博公司。

实施例1、FOXO1的选择性抑制剂AS1842856对于糖尿病小鼠肾功能的影响。

一、实验材料

1.试剂

肌酐检测试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)，尿素氮检测试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)，白蛋白检测试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)。

2.仪器

全自动酶标仪(赛默飞)，台式高速冷冻离心机(艾本德)。

3.实验动物

8-10周龄C57BL/6小鼠，体重20-25g，雄性，购自北京大学医学部实验动物科学部。

二、实验方法

1.动物分组及饲养

动物适应性喂养5天后按体重随机分为正常对照组(n＝10)、糖尿病模型组(n＝10)、阳性对照组给予贝那普利(5mg/kg，n＝10)、AS1842856低剂量组(0.2mg/kg，n＝10)、AS1842856中剂量组(1mg/kg，n＝10)、AS1842856高剂量组(5mg/kg，n＝10)；正常对照组小鼠腹腔注射等体积的枸橼酸钠缓冲液，糖尿病模型组、阳性对照组和AS1842856组小鼠均连续五天腹腔注射60mg/kg链脲佐菌素(西格玛奥德里奇)。注射72小时后剪尾取血测定血糖浓度，筛选出血糖在250mg/dL以上者作为糖尿病动物模型，4周后给药。贝那普利溶于生理盐水中，每天灌胃给药1次。AS1842856溶于5％DMSO/95％PEG-400(v/v)中，隔天皮下注射给药1次。饲养条件：5只/笼，室温22±1℃，湿度50±10％，自然光照，自由摄食饮水。

2.观察指标及测定方法

2.1血肌酐和血尿素氮测定

在分别给药4周及12周后，动物禁食12小时，眼角取血，每只500μ1左右，应用高速冷冻离心机，4℃，12,000rpm离心15分钟，收集上层血清。血肌酐和血尿素氮是反应肾功能的两个重要指标，均由商业试剂盒测量，从小鼠收集的血清用于按照试剂盒制造商的说明测量血肌酐和血尿素氮。

2.2尿微量白蛋白与尿肌酐比值测定

在分别给药4周及12周后，将动物置于代谢笼内24小时，收集每只小鼠的尿液。尿微量白蛋白与尿肌酐比值也是反应肾功能的重要指标。尿肌酐与尿白蛋白均由商业试剂盒测量，从小鼠收集的尿液用于按照试剂盒制造商的说明书测量尿肌酐和尿白蛋白。

2.3肾脏组织F4/80染色

动物给药4周后，应用戊巴比妥钠将小鼠麻醉处死，取小鼠肾脏组织。应用4％多聚甲醛固定肾脏组织后，将其包埋于石蜡中，制作5μm厚度的肾脏石蜡切片。石蜡切片依次经过二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、抗原修复、去除内源性酶后，使用正常山羊血清封闭非特异性位点，加入抗F4/80的一抗(1/200)，4℃孵育过夜，并用阴性血清作为阴性对照。第二天生物素化羊抗兔IgG二抗(1/2,000)，37℃孵育1小时；然后经DAB显色、苏木精染色、盐酸分色、氨水快速蓝化、梯度乙醇脱水、二甲苯透明处理和中性树胶封片，在光学显微镜下观察。可见细胞核呈蓝紫色，阳性区域呈棕色。

三、实验结果

由图1可见，与糖尿病模型组相比，0.2mg/kg、1mg/kg及5mg/kg的AS1842856并不影响糖尿病小鼠体重和血糖水平(与糖尿病组比较，^**P<0.01，^***P<0.001)。

由图2可见，与糖尿病模型组相比，0.2mg/kg、1mg/kg及5mg/kg的AS1842856给予4周及12周均可以降低糖尿病小鼠血肌酐和血尿素氮的水平(与正常对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001；与糖尿病组比较，^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001)。其中AS1842856的高剂量组对于糖尿病小鼠血肌酐和血尿素氮的作用均强于贝那普利5mg/kg组。

由图3可见，与糖尿病模型组相比，0.2mg/kg、1mg/kg及5mg/kg的AS1842856给予4周及12周均可以降低糖尿病小鼠尿微量白蛋白与尿肌酐比值(与正常对照组比较，^***P<0.001；与糖尿病组比较，^##P<0.01，^###P<0.001)。其中AS1842856给予12周的中剂量及高剂量组对于糖尿病小鼠尿微量白蛋白与尿肌酐比值的作用均强于贝那普利5mg/kg组。

由图4可见，与糖尿病模型组相比，5mg/kg的AS1842856则可以显著降低糖尿病小鼠肾脏组织巨噬细胞浸润(F4/80阳染)。

上述结果表明，FOXO1选择性抑制剂AS1842856能显著降低糖尿病肾病损伤小鼠的血肌酐、血尿素氮的水平、抑制糖尿病小鼠肾脏组织巨噬细胞浸润，其在预防和/或治疗糖尿病肾病方面将产生良好的应用前景。

Claims

1.式I所示的化合物在制备治疗糖尿病肾病所致蛋白尿的药物中的应用；

所述治疗糖尿病肾病所致蛋白尿体现在：降低糖尿病肾病损伤中尿微量白蛋白与尿肌酐比值。