CN110384692B - 鼠尾草酸和迷迭香酸联合制备防治ⅱ型糖尿病肾病的药物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鼠尾草酸和迷迭香酸联合制备防治Ⅱ型糖尿病肾病的药物的用途。本发明发现，质量比为6:1的鼠尾草酸和迷迭香酸可以显著协同降低Ⅱ型糖尿病肾病小鼠的空腹血糖，可以显著协同降低尿蛋白排泄率、增加尿肌酐含量，对糖尿病肾病小鼠肾功能具有显著的协同改善作用，这种协同作用是本领域技术人员意料不到的。

Description

鼠尾草酸和迷迭香酸联合制备防治Ⅱ型糖尿病肾病的药物的 用途

技术领域

本发明属于医药领域，涉及已知化合物联合制药用途，具体涉及鼠尾草酸和迷迭香酸联合制备防治Ⅱ型糖尿病肾病的药物的用途。

背景技术

Ⅱ型糖尿病肾病是Ⅱ型糖尿病引起的严重和危害性最大的一种慢性并发症，是导致患者致死率最高的并发症，由Ⅱ型糖尿病引起的微血管病变而导致的蛋白尿、肾小球硬化等是本症的特点。Ⅱ型糖尿病肾病在我国的发病率亦呈上升趋势，目前已成为终末期肾脏病的第二位原因，仅次于各种肾小球肾炎。由于其存在复杂的代谢紊乱，一旦发展到终末期肾脏病，往往比其他肾脏疾病的治疗更加棘手，因此及时防治对于延缓Ⅱ型糖尿病肾病的意义重大。

鼠尾草酸最初被发现存在于唇形科鼠尾草属植物鼠尾草中，后来发现其同样存在于其它唇形科植物迷迭香和三叶鼠尾草等中。鼠尾草酸为无色至淡黄色粉末晶体，是一种脂溶性物质，易溶于油脂，不溶于水，具有高效、安全无毒、耐高温等特性。鼠尾草酸具有抗氧化、延缓衰老作用，还具有减肥降脂功效作用，以及治疗心血管病、抗癌作用。

迷迭香酸是从唇形科植物迷迭香中分离得到的一种水溶性的天然酚酸类化合物，分布较为广泛，主要存在于唇形科、紫草科、葫芦科、椴树科、伞形科的多种植物中，尤以唇型科和紫草科植物中含量最高。迷迭香酸是一种天然抗氧化剂，具有较强的抗氧化活性，有助于防止自由基造成的细胞受损，因此降低了癌症和动脉硬化的风险。迷迭香酸具有较强的抗炎活性，同时迷迭香酸还具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的活性。目前，迷迭香酸在制药、食品、化妆品等领域中已体现出其重要的应用价值。

目前尚未见鼠尾草酸和迷迭香酸联合制备防治Ⅱ型糖尿病肾病药物的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供鼠尾草酸和迷迭香酸联合制备防治Ⅱ型糖尿病肾病的药物的用途。

本发明上述目的通过如下技术方案实现：

鼠尾草酸和迷迭香酸联合制备防治Ⅱ型糖尿病肾病的药物的用途。

优选地，鼠尾草酸和迷迭香酸的质量比为6:1。

优选地，所述药物以鼠尾草酸和迷迭香酸为活性成分，还含有药学上可以接受的载体，制成药学上可以接受的剂型。

更优选地，所述载体为固体、半固体或液体。

更优选地，所述剂型为片剂、注射剂、胶囊、口服液。

有益效果：

本发明发现，质量比为6:1的鼠尾草酸和迷迭香酸可以显著协同降低Ⅱ型糖尿病肾病小鼠的空腹血糖、尿蛋白排泄率，增加尿肌酐含量，对糖尿病肾病小鼠肾功能具有显著的协同改善作用，这种协同作用是本领域技术人员意料不到的。

附图说明

图1为鼠尾草酸与迷迭香酸对小鼠空腹血糖的影响；

图2为鼠尾草酸与迷迭香酸对小鼠尿蛋白排泄率的影响；

图3为鼠尾草酸与迷迭香酸对小鼠肌酐含量的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

一、实验材料

实验动物为C57BL/6小鼠，雄性，6-7周龄，购于斯贝福生物有限公司。60％高脂饲料(TP23400)和10％低脂对照饲料(TP23402)购自南通特洛菲饲料科技有限公司。

链脲佐菌素(美国Sigma公司)；柠檬酸(罗恩试剂有限公司)；柠檬酸钠，二水合物(罗恩试剂有限公司)；羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司)；鼠尾草酸(纯度＝98.76％，成都曼斯特生物科技有限公司)；迷迭香酸(纯度＝97％，上海源叶生物科技有限公司)；微量白蛋白(m-Alb)测试盒(南京建成生物工程研究所)；肌酐(Cr)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；通用型组织固定液(武汉塞维尔生物科技有限公司)。

血糖试纸(美国强生公司)；血糖测试仪(美国强生公司)；小鼠代谢笼(苏州冯氏动物实验动物中心)；多功能酶标仪(美国Gene公司)；恒温水浴锅(上海精宏仪器公司)；离心机(美国Thermo公司)；荧光倒置显微镜(日本Nikon公司)；电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。

二、实验方法

1、Ⅱ型糖尿病肾病模型的建立

将C57BL/6J小鼠适应性喂养一周后，分为正常组(Chow)和造模组，正常组小鼠喂以10％低脂对照饲料，造模组小鼠用60％高脂饲料诱导4周后，一次性注射低剂量(100mg/kg)的链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)以诱导胰岛β细胞部分损伤。注射1周后(这1周仍然喂以60％高脂饲料)，禁食过夜，尾尖采血，血糖数值≥250mg/dl(13.8mM)即为造模成功。

2、分组与给药

将造模组小鼠随机分为4组：模型组(HFD/STZ)、鼠尾草酸组(CA)、迷迭香酸组(RA)、鼠尾草酸/迷迭香酸联合给药组(CA/RA)，每组10只小鼠。随后10只正常组小鼠继续给予10％低脂对照饲料，模型组及给药组继续给予60％高脂饲料喂养11周，同时，给药组按照表1剂量灌胃给药11周，正常组和模型组灌胃给予等体积的溶媒0.5％CMC-Na溶液。

表1各组小鼠数量和灌胃剂量

Num	Group	Dose(mg/kg/d)	Numbers of mice
				1	Chow	/	10
2	HFD/STZ	/	10
				3	CA	30	10
4	RA	5	10
				5	CA/RA	30/5	10

3、小鼠空腹血糖值测定

在给药第11周首日将小鼠禁食过夜，次日采尾血测定空腹血糖。

4、小鼠尿液收集

在给药第11周末日，将小鼠置于小鼠代谢笼中，收集24h尿液，量取尿液体积，12000rpm，4℃离心1min，取上清，立即进行白蛋白或肌酐测定，或于-80℃冰箱冻存备用。

4.1小鼠尿微量白蛋白的测定

采用南京建成生物研究所的小鼠白蛋ELISA测定试剂盒进行尿液中白蛋白的含量测定，具体步骤如下：

1)试剂盒准备：将试剂盒从4℃冰箱中取出，室温平衡30min，用去离子水将洗涤液稀释至1×备用。

2)系列标准品溶液的配置：取320μg/mL标准品溶液，采用倍稀法稀释样品，最终得到320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25μg/mL的系列标准品溶液。

3)加样：标准品孔及待测样品孔加入已事先整合好生物素抗体的标准品溶液50μL，链霉素-HRP50μL；空白对照孔只加显色剂A&B和终止液，其余各步操作相同；待测样品孔加入样品50μL，然后各个孔加抗m-ALB50μL、37℃孵育30min。

4)洗涤：揭去封板膜，弃去液体，甩干，每孔加入300μL洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。

5)加酶：标准品孔和样品孔加入链酶亲和素-HRP50μL，盖上封膜板膜，摇匀，37℃孵育30min。

6)显色反应：每孔加入50μL显色剂A，再加入50μL显色剂B，轻轻震荡均匀，37℃避光显色10min。

7)终止反应：每孔加入50μL反应终止液，终止反应。

8)含量测定：于450nm处测定各个孔的吸光度(OD值)。

9)计算：根据标准品的浓度及对应的OD值用软件ELISAcale计算相应的标准线性回归方程，并计算样品的相应浓度。

4.2小鼠尿肌酐含量的测定(苦味酸比色法)

将尿液用双蒸水作1:200稀释后，按下表进行测定：

	空白管	标准管	测定管
				稀释尿液(mL)	/	/	0.4
试剂一(50μM肌酐标准品)(mL)	/	0.4	/
				双蒸水(mL)	0.4	/	/
试剂三(苦味酸溶液)(mL)	0.225	0.225	0.225
				试剂四(0.75mol/L氢氧化钠溶液)(mL)	0.225	0.225	0.225

充分混匀，37℃水浴10分钟，取出后流水冷却，于510nm波长处测定吸光度OD值，并按下式计算肌酐含量。

5、鼠尾草酸与迷迭香酸的协同作用判别

5.1金正均Q值法

通过对协同成分在Ⅱ型糖尿病肾病小鼠高血糖、肾功能损伤的治疗效果进行评价，应用金正均Q值法对鼠尾草酸及迷迭香酸的协同作用进行判别。计算公式如下：

其中E(a+b)为联合用药组的治疗率，即实测合并效应，Ea和Eb为两药单用时的治疗率，分母(Ea+Eb-Ea×Eb)为期望合并效应，Q为两者比值。Q值在0.85～1.15时，两药合并效应为相加，Q值＞1.15时为协同增效作用，Q值＜0.85时为拮抗作用。

5.2血糖值降低百分比、尿微量白蛋白量减少百分比和尿肌酐含量增加百分比计算

模型组与给药组小鼠平均血糖值、尿微量白蛋白量和尿肌酐含量差值占模型组小鼠平均血糖值、尿微量白蛋白量和尿肌酐含量的百分比。

6、数据分析与统计学处理

采用Graph pad prism 6软件对实验数据进行分析。结果分别表示为平均值±SEM，当p值小于0.05时，认为其具有统计学意义。

三、实验结果

1、鼠尾草酸与迷迭香酸对Ⅱ型糖尿病肾病小鼠的协同降糖作用

各组小鼠空腹血糖测定结果如图1所示，模型组小鼠空腹血糖值显著升高，鼠尾草酸单独给药组小鼠血糖降低，迷迭香酸单独给药组小鼠血糖也降低，两药联用之后，小鼠血糖显著降低，降糖作用明显加强。

2、鼠尾草酸与迷迭香酸对Ⅱ型糖尿病肾病小鼠肾功能改善作用

白蛋白主要由肝脏合成，经肾小管重吸收，当肾脏受损时，尿液中白蛋白将显著增加。肌酐主要由肌肉代谢产生，经肾小球滤过排出体外，当肾脏损伤时，排泄受阻，因而血中肌酐增加，尿液肌酐含量减少，因此24小时尿蛋白排泄率(Urine albumin excretion,UAE)及肌酐含量(Creatinine,CRE)是评价肾功能的重要指标。

如图2所示，模型组小鼠24小时尿蛋白排泄率显著增加至正常组的7.20倍，鼠尾草酸及迷迭香酸单独给药后，尿蛋白排泄率降低，但并未达到生物学统计意义，而两药合用之后，显著地降低。此外，图3所示模型组小鼠肌酐排泄受阻，显示模型组小鼠肾功能受损。鼠尾草酸与迷迭香酸给药后有改善作用，在合用之后尿肌酐含量显著回升。

3、鼠尾草酸与迷迭香酸协同作用判定

结果如表2所示，质量比为6:1的鼠尾草酸与迷迭香酸对Ⅱ型糖尿病肾病小鼠高血糖及肾功能损伤的联用Q值均＞1.15，呈现明显的协同作用。在此组合中，鼠尾草酸相对于迷迭香酸具有更强的治疗作用，在合用之后显示出协同增效的作用。

表2鼠尾草酸与迷迭香酸对Ⅱ型糖尿病肾病小鼠协同治疗作用判定

上述实施例表明，质量比为6:1的鼠尾草酸和迷迭香酸可以显著协同降低Ⅱ型糖尿病肾病小鼠的空腹血糖，可以显著协同降低尿蛋白排泄率、增加尿肌酐含量，对糖尿病肾病小鼠肾功能具有显著的协同改善作用，这种协同作用是本领域技术人员意料不到的。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (1)

1.鼠尾草酸和迷迭香酸联合制备防治Ⅱ型糖尿病肾病的药物的用途，所述鼠尾草酸和迷迭香酸的质量比为6:1。

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