CN112358992A - 一种高效复合微生物肥及其在农业生产中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体提供一种提高土壤肥力的高效复合微生物肥，并提供了其在农业生产中的应用。所述微生物肥包含多种解磷、解钾微生物，可以有效提高土壤肥力，增加作物产量，同时还能抑制病虫害的发生，应用前景广泛。

Description

一种高效复合微生物肥及其在农业生产中的应用
技术领域
本发明涉及功能微生物的筛选与应用技术领域，具体涉及一种高效复合微生物肥及其在农业生产中的应用。
背景技术
生物肥即微生物肥料，它是在人为选育土壤有益微生物菌种的基础上，经过工厂化培养，复合以有机营养基质，并添加一定比例的矿质营养元素生产出来的，是继有机肥、化肥之后的第三类肥料，它的营养元素集速效、长效、增效为一体。微生物肥有微生物菌肥和微生物有机肥。微生物菌肥有单元菌肥(单元微生物肥)和复合菌肥(复合微生物肥)之分。近几年来，复合微生物肥已成为发展主流，它们既含有解钾细菌，又含有解磷细菌、固氮菌以及一些有益的放线菌等微生物种类。
生物肥中的解磷细菌能分解土壤中的含磷矿物,释放出有效磷，可以将土壤固定的无效磷重新转化为有效状态，从而提高磷肥利用率；固氮菌可以把空气中的氮气转化为氮化合物，成为细菌本身和植物都可以利用的氮素形态,因而可以节约氮肥的投入；复合微生物肥中的某些菌种可以产生抗生素，抑制土壤中病原菌的生长和繁殖，控制根部病害的发生；有些菌种可以分泌植物生长刺激物质，促进根系的生长，增强植物的抗逆性；微生物肥料还具有促进土壤中有机残体转化为腐殖质的作用，从而改良土壤结构，改善土壤的水、肥、气、热状况；能增进赤霉素含量,增大叶面积，光合作用从而增加也就提高了产量；能防止对氮的过分吸收，硝酸盐含量降低，可溶性糖含量升高，Vc含量增大从而改善产品品质。
生物肥有一下几个主要特点：一是无污染、无公害；二是配方科学、养分齐全；三是活化土壤、增加肥效；四是低成本,高产出；五是提高农产品品质、降低有害积累；六是有效提高耕地肥力、改善土壤供肥环境；七是抑制土传病害；八是促进作物早熟。
迄今为止生物肥已在世界上60多个国家推广应用，这些国家和地区主要分布在亚洲、南美洲、欧洲和非洲等。为顺应农业可持续发展而研制的微生物肥料具有极其光明的应用前景，但其功能的发挥还没有尽善尽美，目前市售产品种类相对较少，而且使用效果不稳定，推广难度较大。因此，选育优良的具有解磷、解钾、固氮等功能的微生物菌种，仍然是目前生物肥产品开发的首要任务。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高土壤肥力的高效复合微生物肥，并提供了其在农业生产中的应用。所述微生物肥包含多种解磷、解钾微生物，可以有效提高土壤肥力，增加作物产量，同时还能抑制病虫害的发生，应用前景广泛。
本发明一方面提供了一种微生物肥，包含胶质芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。
所述胶质芽孢杆菌为申请人筛选获得的一株解磷解钾菌，命名为胶质芽孢杆菌LLH08(Bacillus mucilaginosus LLH08)，已于2020年6月1日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2020163。
所述微生物肥中各组分及其重量比分别为：胶质芽孢杆菌65-90份、解淀粉芽孢杆菌25-35份、苏云金芽孢杆菌20-30份、哈茨木霉40-66份和沼泽红假单胞菌30-55份。
进一步优选的，上述微生物肥中各组分及其重量比分别为：胶质芽孢杆菌90份、解淀粉芽孢杆菌25份、苏云金芽孢杆菌30份、哈茨木霉55份和沼泽红假单胞菌45份。
进一步优选的，所述解淀粉芽孢杆菌的菌种编号为CGMCC 1.8713。
进一步优选的，所述苏云金芽孢杆菌的菌种编号为CGMCC 1.7887。
进一步优选的，所述哈茨木霉的菌种编号为CGMCC 5.1233。
进一步优选的，所述沼泽红假单胞菌的菌种编号为CGMCC 1.2352。
本发明另一方面提供了上述微生物肥的制备方法，包括如下步骤：
1)将胶质芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、哈茨木霉和沼泽红假单胞菌分别活化后，扩大培养至对数生长期，将发酵液冷冻干燥，制成活菌量高达1010-1011CFU/g的超浓缩菌粉；
2)将步骤(1)制得的超浓缩菌粉按照如下重量比：胶质芽孢杆菌65-90份、解淀粉芽孢杆菌25-35份、苏云金芽孢杆菌20-30份、哈茨木霉40-66份和沼泽红假单胞菌30-55份配制成复合微生物肥。
上述胶质芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、哈茨木霉和沼泽红假单胞菌分别优选胶质芽孢杆菌CCTCC NO：M2020163、解淀粉芽孢杆菌CGMCC 1.8713、苏云金芽孢杆菌CGMCC 1.7887、哈茨木霉CGMCC 5.1233和沼泽红假单胞菌CGMCC 1.2352。
本发明还提供了上述复合微生物肥在农作物种植中的应用。
所述复合微生物肥可以单独施用，用量为25-60kg/亩。
所述复合微生物肥还可以按10-30％(质量比)的比例与无机肥和/或有机肥混合施用，用量为50-100kg/亩。
有益效果
本发明提供的复合微生物肥中胶质芽孢杆菌LLH08、解淀粉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、哈茨木霉和沼泽红假单胞菌五种菌共同作用，能够产生协同促进效果，比含单一菌种的微生物肥具有更好的肥效。与对照组相比，施用所述复合微生物肥的处理组大豆的分支数、结瘤数、株粒数、株粒重、百粒重均得到明显提高，大豆亩产量超过200kg/亩，较对照组提高14％以上；马铃薯的亩产提高了23.2％，产生了意料不到的技术效果。
所述复合微生物肥不仅能显著提高土壤肥力，增加作物产量，还能有效降低马铃薯根结线虫病的发病率，比无机肥对照组降低了71.2％，效果非常显著。
本发明提供的复合微生物肥可以单独施用，也可以按10-30％(质量比)的比例与无机肥和/或有机肥混合施用，可以使作物产量普遍提高20-45％。所述复合微生物肥的使用，还能大幅度减少无机肥和农药的使用，对环境友好，有利于提升农作物的品质，推动传统农业向生态农业、绿色农业的转变，实现农业健康、可持续的发展。
附图说明
图1为PCR扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳图谱；
图2为胶质芽孢杆菌LLH08菌落图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。本发明所选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。其中：
解淀粉芽孢杆菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CGMCC1.8713；苏云金芽孢杆菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CGMCC1.7887；哈茨木霉购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CGMCC 5.1233；沼泽红假单胞菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CGMCC 1.2352。
实施例中使用的培养基配方如下：
难溶性无机磷固体培养基：葡萄糖10g,(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KC1 0.3g，MgSO4.7H20 0.3g，FeSO4.7H20 0.03g，MnSO4.4H20 0.03g，Ca3(PO4)25.0g，蒸馏水1000ml,pH7.0-7.5，琼脂20g，115℃灭菌30min；
难溶性无机磷液体培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KC1 0.3g，MgSO4.7H20 0.3g，FeSO4.7 H20 0.03g，MnSO4.4H20 0.03g，Ca3(PO4)2 5.0g,，蒸馏水1000ml，pH 7.0-7.5，115℃灭菌30min；
硅酸盐细菌固体培养基为：蔗糖5.0g/L，磷酸钠2.0g/L，七水硫酸镁0.5g/L，碳酸钙0.1g/L，六水氯化铁5.0mg/L，琼脂粉15g/L，pH 7.0；
钾长石液体培养基：蔗糖5g，葡萄糖5g，(NH4)2SO4 0.5g，酵母粉0.5g，MgSO4·7H2O0.3g，磷酸氢二钠2g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·7H2O 0.03g，钾长石2g，蒸馏水1000mL，pH7.2，115℃灭菌20min；
硅酸盐细菌液体培养基为：蔗糖5.0g/L，磷酸钠2.0g/L，七水硫酸镁0.5g/L，碳酸钙0.1g/L，六水氯化铁5.0mg/L，pH 7.0。
实施例1土壤中解磷微生物的分离与筛选
1、土壤样品：山东省青岛市平度大泽山区葡萄根际土壤。
2、土壤稀释液的制备：
除去地表植物残体和表层土5cm-10cm，用多点采集的方法在每个采样点从土壤中采集10g样品，放入样品袋中。经阴干后，采用四分法将土壤样品缩分至约50g左右；然后置于含有250ml灭菌PB缓冲液的500ml三角瓶中；30℃、180rpm震荡30min，静置沉淀，取上清液；取100ml上清液，12000rpm离心10min，取沉淀；将沉淀悬浮于50ml灭菌PB缓冲液中再次12000rpm离心10min；重复两次以后，将沉淀悬浮于10ml的无菌水中，制得土壤悬浮液。
取0.1ml土壤悬浮液均匀涂布于难溶性无机磷固体培养基上，30℃培养箱中倒置培养3天，观察培养基上长出的菌落，其中有15个菌落周围有透明圈产生，将其分别命名为A1，A2，A3，……，A15。
将初筛得到的15株解磷菌分别接种到难溶性无机磷固体培养基上，30℃培养3天后，观察菌落周围透明圈的大小，结果发现透明圈最大的五株菌分别为A4，A7，A11，A14，A15。
将上述透明圈最大的五株菌分别接种到50mL难溶性无机磷液体培养基中，30℃，200rpm，培养6天，同时以不加任何菌的液体解磷培养基作为对照组。
(1)磷标准曲线的绘制
依次吸取5mg/l的磷标准溶液0.0、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、3.2、4.0ml于试管中，然后各加入钼锑抗显色剂2ml，蒸馏水定容至20ml，摇匀静置20min，700nm波长下测定吸光度。此时各管中磷的浓度分为：0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、0.50、0.80、1.00mg/l。以磷浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制磷标准曲线。
(2)培养液有效磷含量测定
在无菌条件下分别取上述五株菌的培养液各5ml，8000rpm，离心5min，取上清液，稀释到合适的浓度，吸取0.5ml稀释液至试管中，加5ml蒸馏水，加2滴2,4-二硝基酚指示剂，加2ml钼锑抗显色剂，然后用蒸馏水定容至20ml，摇匀静置20min，于700nm波长下比色，吸光度值代入标准曲线计算上清液中的有效磷含量，具体结果见表1。
表1不同菌株的解磷效果
样品 有效磷含量(mg/L)
空白对照组 0
A4 311
A7 179
A11 262
A14 914
A15 433
从表1中的结果可以看出，本发明筛选到的五株菌均具有较强的解磷能力，能将培养基中的难溶磷(Ca3(PO4)2)分解成可溶性的有效磷，效果非常显著。其中，A11菌株的解磷效率最高，有效磷含量高达914mg/L，取得了意料不到的效果。
实施例2A11菌株的鉴定
1、分子生物学鉴定
挑取平板上A11菌株的单菌落于营养肉汤培养基中，37℃培养24小时，然后取500ul菌株发酵液，利用试剂盒提取该菌株的基因组。以该基因组为模板，设计引物序列，PCR扩增16s rDNA序列。
1)引物序列:
A11F：AGGGTTTGATCCTGGCTCC；
A11R：GGTGGATTCTTGTTACGACTT。
2)反应体系(50μL)
表2 16s rDNA PCR扩增体系
Figure BDA0002779435310000061
3)PCR扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳图谱如图1所示，扩增得到的16s rDNA片段的长度为1500bp左右，符合常规的16s rDNA序列长度。
4)PCR产物测序
将扩增后的PCR产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。测序结果显示A11菌株的16srDNA序列为SEQ ID NO:1。将该序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，其与胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)的相似性最高。因此，初步确定A11菌株为胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)。
SEQ ID NO:1如下所示：
Figure BDA0002779435310000062
Figure BDA0002779435310000071
2、菌落形态
将A11菌株接种于硅酸盐细菌固体培养基上，37℃培养3天。该菌株生长良好，菌落如图2所示：菌落隆起，呈玻璃半球状，透明或半透明，边缘平坦，表面光滑，比较粘稠，弹性大，可以拉成丝状；菌体呈粗杆状，有荚膜，大小为3～6μm×1.2～1.6μm，革兰氏染色不定；产芽孢，芽孢为椭圆形，中生。
结合A11菌株的16srDNA比对结果和菌落形态，申请人确认A11菌株为胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，命名为胶质芽孢杆菌LLH08(Bacillus mucilaginosusLLH08)。
申请人已于2020年6月1日将上述胶质芽孢杆菌LLH08(Bacillus mucilaginosusLLH08)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020163。
实施例3胶质芽孢杆菌LLH08解钾能力测定
3.1测定方法
配制钾长石液体培养基，按95mL分装于250mL三角瓶。将胶质芽孢杆菌LLH08菌悬液以5％的接种量接入摇瓶，同时做三个平行，并设置无接种对照组，30℃摇床震荡培养72h。
3.2发酵液的处理
从每个摇瓶中各取发酵液20mL，4℃、5 000r/min离心15min；将全部离心上清液放入50mL消煮管中；加入5mL浓硫酸与2mL的过氧化氢溶液在消煮炉消煮，并反复加几次20％过氧化氢溶液，至粘性物质完全消化后，用蒸馏水定容至50mL。使用火焰光度计测定其中K+含量。
结果显示，胶质芽孢杆菌LLH08发酵液中钾含量达到77.4μg/mL，从而说明，本发明筛选到的胶质芽孢杆菌LLH08具有较强的解钾能力，可广泛应用于生物肥领域。
实施例4胶质芽孢杆菌LLH08耐盐能力测定
在无菌条件下，取适量新鲜的胶质芽孢杆菌LLH08发酵液，5000rpm/min离心5min，用PBS缓冲液洗2次，再用同体积PBS缓冲液重菌体后稀释50倍，作为接种液。
在无菌条件下，向96孔板中分别加入190μL盐浓度为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％的硅酸盐细菌液体培养基，每个盐浓度做3个平行，然后再加入10μL接种液，不接菌的孔作为对照。每孔加入50μL高压灭菌过的石蜡油以防止培养过程中水分蒸发。置于37℃恒温培养，观察培养基是否变浑浊。
结果显示，胶质芽孢杆菌LLH08菌株在0.1％～1.0％盐浓度下生长，在1.1％～1.5％盐浓度下不生长，最大耐受盐浓度为1.0％，因此有利于其在盐碱地中的应用。
实施例5胶质芽孢杆菌LLH08的产酶活力测定
5.1发酵菌液的制备
(1)菌种活化
将胶质芽孢杆菌LLH08接种于斜面培养基进行活化，温度控制在30-35℃，培养24-48小时，得到原始斜面种子；
(2)摇瓶培养
将斜面种子接种于100mL摇瓶培养基中，33℃、220r/min摇床培养8-12小时，得种子液备用；
(3)种子罐培养
将种子液接种于种子罐培养基中，装料系数0.7-0.8，121℃蒸汽灭菌20分钟，接种量5％，培养温度31～33℃，通气量为1：0.6～0.8(v/v·min)，控制溶氧饱和度DO值为15％～30％，pH控制在7.2±0.2，培养8～12小时，获得对数生长期种子液；
(4)发酵培养
第一阶段：将种子罐种子液接种于发酵基础培养基中，装料系数0.7-0.8，121℃蒸汽灭菌20分钟，接种量5％～10％，控制参数：温度30～33℃，pH值7.0～7.2，通气量1：0.8～1.2(v/v·min)，以搅拌转速控制溶氧饱和度DO值20％～30％，以植物油为消泡剂控制泡沫；每间隔4小时取一次样，立即作镜检观察菌数及菌体形态，化验糖、氨态氮；根据检验结果适时补料，控制糖剂量为2.2g/L～3.4g/L、以NH4Cl控制氮源0.5g/L～0.1g/L，接近对数生长末期时停止补氮；
第二阶段：控制参数：温度33～37℃，pH值7.2～8.0，通气量为1：1.0～0.8(v/v·min)，以搅拌转速控制溶氧饱和度DO值5％～10％，加入0.1g/L碳酸钙，促进芽孢形成，每间隔4小时取样，立即作镜检观察菌体形态，当镜检视野中的菌体形态全部芽孢时即为发酵终点，停止发酵，此时发酵液中活菌数高达109～1010CFU/mL。
5.2酶活检测
将胶质芽孢杆菌LLH08发酵液在4℃条件下，8000rpm，离心5min，取上清，按照下述方法测定发酵上清液中的植酸酶酶活。检测结果显示，所述胶质芽孢杆菌LLH08发酵上清液中植酸酶酶活达8.3U/mL。
而现有公开的多株胶质芽孢杆菌均不产植酸酶，因此本发明提供的胶质芽孢杆菌LLH08与现有菌株存在明显区别，取得了意料不到的技术效果。
(1)植酸酶酶活测定方法
酶活单位的定义：在30℃、pH值为5.0的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的植酸钠溶液中释放1μmol无机磷所需要的酶量即为一个酶活力单位U。
测定方法：取4ml浓度为7.5mmol/L的植酸钠溶液(pH5.0 0.25mol/L乙酸缓冲液配制)，加入到比色管中，30℃平衡5min，再加入2ml经pH5.0 0.25mol/L乙酸缓冲液适当稀释并经30℃平衡好的植酸酶酶液，混匀于30℃精确保温反应30min。反应结束后，加入4ml终止液(2份硝酸溶液(硝酸：水＝1:2)、1份100g/L钼酸铵溶液、1份2.35g/L钒酸铵溶液)，混匀以终止反应。然后室温放置10min显色，分光光度计415nm处测定吸光值。
酶活计算公式：
U＝(A-A0-0.0016)×F/(0.0415×30)
式中：A为样品的吸光值；A0为空白样品的吸光值；F为实际样液反应前的总稀释倍数；30为酶解反应时间，min。
实施例6胶质芽孢杆菌LLH08在油菜大田栽培实验中的应用
1、实验地点：
青岛市平度油菜种植大棚，土壤整体状况较为均匀。
2、实验过程
设置20个实验区，每个实验区为3m×3m的方形区域，且每个实验区之间保持1米的间隔。
实验共设2个组：①空白对照组：不添加任何物质；②胶质芽孢杆菌LLH08处理组：在每个实验区中按30mL/m2的比例均匀喷洒实施例4所述胶质芽孢杆菌LLH08发酵菌液，然后将表层5-10cm厚的土壤进行有效混匀。每个组随机选择10个实验区。
1)种子处理：用5％的次氯酸钠表面灭菌油菜种子10min，用蒸馏水清洗3-4次除去次氯酸钠后在常温下放置30min自然干燥；
2)播种与收获：在每个实验区均匀播种50g油菜种子，定时浇水和管理，不施加肥料。播种50天后，收获全部油菜，并分别检测每个实验区油菜的鲜重和干重，计算每个处理组油菜的平均鲜重和平均干重，进行比较；
3)收获油菜的同时，分别采集每个实验区的土样，分别检测土样中有效磷和有效钾的含量，并进行比较。
试验结果表明：与空白对照组相比，胶质芽孢杆菌LLH08处理组油菜的平均鲜重和干重比空白对照组分别提高了355.2％和290.5％，有效磷和有效钾含量比空白处理组分别提高了61.3％和69.1％。
上述结果表明，本发明提供的胶质芽孢杆菌LLH08能极显著提高土壤中有效磷和有效钾的含量，提升土壤肥力，从而有利于种植作物的生长，显著提高作物产量，因此可广泛应用于生物肥领域。
实施例7胶质芽孢杆菌LLH08在盐碱地种植小麦中的应用
1、菌粉制备
将实施例4所述胶质芽孢杆菌LLH08发酵液进行喷雾干燥，制备得到活菌量约为10亿/g的菌粉。
2、实验地点：
青岛市胶州李哥庄盐碱地小麦种植区，该种植区内土壤盐度约为0.4％，小麦播种时间相同，当前处于苗期，小麦长势相近。
小麦耐盐品种：青麦6号。
3、小麦种植实验：
选取10m×50m的区域作为一个实验区，共设置30个实验区，且每个实验区之间保持1米的间隔。每个处理组随机选择10个实验区进行实验。
(1)空白对照组：清水浇施小麦根部；
(2)菌粉处理组：将胶质芽孢杆菌LLH08菌粉随水浇施于小麦的根部，间隔10天用一次，连续使用三次。其中：
处理组1：菌粉用量为2.0kg/亩；
处理组2：菌粉用量为4.0kg/亩。
在小麦成熟期，统一进行收割、脱粒和晾晒，统计各实验区小麦的产量，计算小麦的平均产量和增产率，具体结果见表3。
增产率＝(处理组小麦产量-空白对照组小麦产量)/空白对照组小麦产量×100％。
表3胶质芽孢杆菌LLH08对盐碱地小麦产量的影响
实验分组 平均产量kg/亩 增产率
对照组 475.2 -
处理组1 602.6 26.8％
处理组2 633.4 33.3％
从表3的实验数据可以看出，与对照组相比，施用本发明所述胶质芽孢杆菌LLH08菌粉的处理组小麦产量普遍提高26.8％-33.3％。从而说明，胶质芽孢杆菌LLH08能有效适应盐碱地的环境，提高土壤肥力，进而促进小麦生长，显著增加产量，取得了意料不到的技术效果。
实施例8胶质芽孢杆菌LLH08对苹果的增产效果实验
在青岛市崂山区苹果园选择土壤性状一致、肥力均匀中等、往年苹果轮纹病发病相对均匀的平地和山区果园(果实不套袋)，进行促增产效果实验，每个处理区面积为2亩。
将胶质芽孢杆菌LLH08菌粉加水稀释至终浓度为0.5g/L和1.0g/L，分别在开花前、落花后至幼果期、套袋前和果实膨大期均匀的喷施到果树树体上，滴水为度。同时以不喷施任何菌剂的果树作为对照。
在每个处理区内采用五点取样法，按照东、西、南、北、中五个方位每点选择1株果树，从每株果树的东、南、西、北4个方位齐胸高处各选5个新稍，每个新梢从第4片叶起连续摘取5片叶，每树共计100片叶混在一起称重。计算百叶重和增重效果，统计分析差异显著性，具体结果见表4。产量调查分别从处理区和对照区的东、南、西、北、中5个方各选4株树，共20棵，将所有果实采摘称重，计算产量，同时考察果实的着色情况和含糖量，具体结果见表5。
平均单株百叶重和增重效果的计算方法如下：
平均单株百叶重(g)＝5株树百叶重的和/5，
增重效果(％)＝(处理区平均单株百叶重-对照区平均单株百叶重)/对照区平均单株百叶重×100％。
表4胶质芽孢杆菌LLH08对苹果叶片增重的效果
处理 调查叶片总数 总叶重g 单叶重g 增重率
对照组 500 430.8 0.862 -
0.5g/L处理组 500 465.4 0.931 8.03％
1.0g/L处理组 500 466.8 0.934 8.36％
表5胶质芽孢杆菌LLH08对苹果增产的效果
处理 测定产量(Kg/亩) 增产率 着色率 含糖量
对照组 6806 - 35.2％ 12.6％
0.5g/L处理组 7782 14.3％ 73.2％ 13.9％
1.0g/L处理组 7755 13.9％ 79.1％ 14.1％
从表4和5的数据可以看出，胶质芽孢杆菌LLH08对苹果叶片的生长、果实的发育及着色都有明显的促进作用，与对照组相比，处理组苹果叶片深绿，叶片较厚，叶重增加8％以上，苹果产量提高14％左右，增产效果明显。此外，处理组苹果的着色率和含糖量也普遍高于对照组，苹果的品质也得到显著提高。
实施例9胶质芽孢杆菌LLH08对苹果轮纹病的防治效果实验
在青岛市平度大泽山果园和烟台市栖霞霞山果园选择土壤性状一致、肥力均匀中等、往年苹果轮纹病发病相对均匀的果园(均为套袋果园)，进行轮纹病防治效果实验，每个处理区面积为2亩。
将胶质芽孢杆菌LLH08菌粉加水稀释至终浓度为0.5g/L，分别在开花前(3月29日)、落花后至幼果期(5月2日)、套袋前(5月26日)、果实膨大期(7月5日)、8月5日和9月5日共6次均匀的喷施到果树树体上，滴水为度。同时以不喷施任何菌剂的果树作为对照。
苹果摘袋后，在每个处理区内采用五点取样法，按照东、西、南、北、中五个方位选择树势及挂果量比较一致的果树，每点选1株果树摘无病果混在一起装箱(果实于10月23日采摘)，箱子上标明所摘树的编号。将果实放入室内常温诱发，观察果实的发病情况，分别记载不同种类病害的发病率，计算防治效果，统计差异显著性。每次调查时凡是病果一律剔除，只计发病率不计病情指数，无病果继续诱发，统计和计算发病率和防治效果。
发病率(％)＝发病果数/调查总果数×100％，
防治效果(％)＝(对照区发病率—处理区发病率)/对照区发病率×100％。
分别于11月7日、11月25日和12月30日共3次调查上述苹果的发病情况，结果见表6所示。
表6胶质芽孢杆菌LLH08对苹果轮纹病的防治效果
Figure BDA0002779435310000131
从表6的数据可以看出，苹果采摘2个月内，施用胶质芽孢杆菌LLH08菌粉的处理组果树的苹果轮纹病发病率显著低于对照组，防治效率高达91.2％。从而说明，本发明提供的胶质芽孢杆菌LLH08对苹果轮纹病有明显的防治效果，取得了意料不到的技术效果。
除了轮纹病外，本发明所述胶质芽孢杆菌LLH08还能有效防治苹果的褐斑病和炭疽病，防治效率超过80％，效果显著。
实施例10胶质芽孢杆菌LLH08杀线虫能力测定
将活化的胶质芽孢杆菌LLH08种子液按5％的接种量接种到硅酸盐细菌液体培养基中，37℃、220r/min摇床培养48h后得发酵液。
取0.2mL(约80条左右)线虫悬液和0.8mL的发酵液加入1.5mL离心管中，30℃培养24h后，小心吸去0.8mL上清，并加入0.2mL浓度为1mol/L的NaOH溶液混匀，立刻在显微镜下观察，计算线虫致死率。线虫死活判断标准：线虫活跃、弯曲，加入NaOH溶液后变弯曲，线虫为活；僵直不动，加入NaOH溶液后仍然僵直，线虫为死。
实验结果显示：胶质芽孢杆菌LLH08发酵液处理24h后，根结线虫幼虫的致死率达到87.6％，从而说明本发明筛选到的胶质芽孢杆菌LLH08对根结线虫幼虫具有很强的杀伤作用。
实施例11胶质芽孢杆菌LLH08对黄瓜根结线虫病的防治效果实验
1、实验地点：
青岛市平度田庄镇黄瓜种植大棚。黄瓜、大蒜轮作，连续种植多年，黄瓜根结线虫病比较严重。
2、实验设计
本实验共三个处理组，每个处理组10垄黄瓜，共1000株，每个处理组之间设立保护行；
(1)空白组处理：不作任何处理；
(2)胶质芽孢杆菌LLH08处理：作底施处理，在黄瓜定植前开沟施入，菌粉使用量：8kg/亩，施用后浇水处理；
(3)化学农药处理：使用阿维菌素2000倍稀释液在黄瓜移栽时作灌根处理，黄瓜定植后覆土，阿维菌素使用量：2kg/亩。
黄瓜收获后统计根结指数、卵囊数、虫口密度等指标。
结果显示，与空白对照组相比，胶质芽孢杆菌LLH08菌粉处理组黄瓜的根结数减少了42.3％，虫口密度降低了50.7％，卵囊数减少了78.3％，综合防治效果与化学农药处理组相当。从而说明本发明提供的胶质芽孢杆菌LLH08对黄瓜根结线虫病具有良好的防治效果，其对根结线虫的发生与发展具有很强的抑制作用。
综上所述，本发明提供的胶质芽孢杆菌LLH08可单独作为防治苹果轮纹病、褐斑病、炭疽病、根结线虫等植物病害的生防菌剂、生物肥等，广泛应用于农业生产领域，还可与其他芽孢杆菌、固氮菌、链霉菌等进行组合，用于其他常见植物病害的防治，防治效率达到68％以上，促生增产效果达到10％以上，效果显著，应用前景广阔。
实施例12
一种微生物肥，其各组分及其重量分别为：胶质芽孢杆菌LLH08 65份、解淀粉芽孢杆菌35份、苏云金芽孢杆菌20份、哈茨木霉66份和沼泽红假单胞菌30份。
上述微生物肥的制备方法，包括如下步骤：
1)将胶质芽孢杆菌LLH08、解淀粉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、哈茨木霉和沼泽红假单胞菌分别活化后，扩大培养至对数生长期，将发酵液冷冻干燥，制成活菌量高达1010-1011CFU/g的超浓缩菌粉；
2)将步骤(1)制得的超浓缩菌粉按照如下重量比：胶质芽孢杆菌LLH08 65份、解淀粉芽孢杆菌35份、苏云金芽孢杆菌20份、哈茨木霉66份和沼泽红假单胞菌30份配制成微生物肥。
实施例13
一种微生物肥，其各组分及其重量比分别为：胶质芽孢杆菌LLH08 90份、解淀粉芽孢杆菌25份、苏云金芽孢杆菌30份、哈茨木霉55份和沼泽红假单胞菌45份。
制备方法参照实施例12。
实施例14
一种微生物肥，其各组分及其重量比分别为：胶质芽孢杆菌LLH08 80份、解淀粉芽孢杆菌30份、苏云金芽孢杆菌28份、哈茨木霉40份和沼泽红假单胞菌55份。
制备方法参照实施例12。
实施例15复合微生物肥对大豆生产性能和产量的影响
1、供试肥料：实施例12-14所述的微生物肥，含菌量≥109cfu/g，含水量≤10％。
2、供试作物：大豆品种合农75。
3、实验方法
处理组：微生物菌肥，45kg/亩基施；
对照组：常规对照为农家肥5m3，基施氮肥13kg，磷肥(P2O5)8.0kg，钾肥(K2O)10.0kg。亩留苗1.6万株。4月29日播种，10月13日收获，分别统计各实验区的大豆产量，计算大豆的亩产量。
4、结果与分析
不同处理组对大豆生产性能和产量的影响详见表7。
表7大豆生产性能及亩产量
Figure BDA0002779435310000151
Figure BDA0002779435310000161
从表7的实验结果可知：与对照组相比，施用本发明提供的微生物肥的处理组大豆的分支数、结瘤数、株粒数、株粒重、百粒重均得到明显提高，大豆亩产量超过200kg/亩，较对照组提高14％以上，效果非常显著。
实施例16复合微生物肥对马铃薯产量的影响
(1)微生物肥
样品1：胶质芽孢杆菌LLH08菌粉，有效活菌数约1010cfu/g；
样品2：解淀粉芽孢杆菌菌粉，有效活菌数约1010cfu/g；
样品3：苏云金芽孢杆菌菌粉，有效活菌数约1010cfu/g；
样品4：哈茨木霉菌粉，有效活菌数约1010cfu/g；
样品5：沼泽红假单胞菌菌粉，有效活菌数约1010cfu/g；
样品6：实施例12所述复合微生物肥，由胶质芽孢杆菌LLH08、解淀粉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、哈茨木霉和沼泽红假单胞菌组成，总有效活菌数约1010cfu/g；
(2)实验过程
在青岛市平度蔬菜种植区选取土质肥沃、地力均匀的地块种植马铃薯，分别于播种时(4月24日)、开花时(6月25日)分别施用样品1-6，施肥量12kg/亩，同时，以施用等量无机肥作为对照组，采取相同的方法进行田间管理。8月1日收获马铃薯。对实验组和对照组的马铃薯产量进行测评，结果如表8所示。
表8复合微生物肥对马铃薯产量的影响
Figure BDA0002779435310000162
Figure BDA0002779435310000171
从表8的数据可以看出：
(1)单独施用胶质芽孢杆菌LLH08菌粉的实验组1和单独施用解淀粉芽孢杆菌菌粉的实验组2马铃薯的产量显著高于无机肥对照组，亩产比对照组分别提高15.2％和10.3％，单独施用哈茨木霉菌粉的实验组4马铃薯的产量比对照组略高，为5.1％。从而说明胶质芽孢杆菌LLH08、解淀粉芽孢杆菌或哈茨木霉单独作用，均能有效提高土壤肥力，效果优于等量的无机肥；
(2)单独施用苏云金芽孢杆菌菌粉的实验组3和单独使用沼泽红假单胞菌菌粉的实验组5马铃薯的亩产均显著低于无机肥对照组，说明苏云金芽孢杆菌或沼泽红假单胞菌单独作用对土壤肥力的提升效果不如等量的无机肥；
(3)施用含相同菌量的由胶质芽孢杆菌LLH08、解淀粉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、哈茨木霉和沼泽红假单胞菌组成的复合微生物肥的实验组6，马铃薯的亩产显著高于实验组1和实验组3，亩产比对照组提高了23.2％，也显著高于实验组1和实验组3。
上述结果说明，本发明提供的复合微生物肥中胶质芽孢杆菌LLH08、解淀粉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、哈茨木霉和沼泽红假单胞菌五种菌共同作用，能够产生协同促进效果，比含单一菌种的微生物肥具有更好的肥效，产生了意料不到的技术效果。
本发明提供的复合微生物肥不仅能显著提高土壤肥力，增加作物产量，还能有效降低马铃薯根结线虫病的发病率，比无机肥对照组降低了71.2％，效果非常显著。
本发明提供的复合微生物肥可以单独施用，也可以按10-30％(质量比)的比例与无机肥和/或有机肥混合施用，可以使作物产量普遍提高20-45％。所述复合微生物肥的使用，还能大幅度减少无机肥和农药的使用，对环境友好，有利于提升农作物的品质，推动传统农业向生态农业、绿色农业的转变，实现农业健康、可持续的发展。
序列表
<110> 青岛力力惠生物科技股份有限公司
<120> 一种高效复合微生物肥及其在农业生产中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1496
<212> DNA
<213> 胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)
<400> 1
gtttgattct ggctcaggac gaacggtggc ggcgtgccta atacaagcaa gtcgagcgga 60
gcacttcggt gcttagcggc ggacgggtga gtaacacgta ggcaacctgc ctgtaagatc 120
gggataacta ccggaaacgg tagctaagac cggatagctg gtttccgtgc atgccggaat 180
catgaaacac ggggcaacct gtggcttacg gatgggcctg cggcgcatta gctagttggc 240
ggggtaacgg cccaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcgtccacac 300
tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg 360
ggcgcaagcc tgacggagca acgccgcgtg agtgaagaag gttttcggat cgtaaagctc 420
tgttgccagg gaagaatgtc gtggagagta actgctctgc gaatgacggt acctgagaag 480
aaagccccgg ctaactacgt gccaggagcc gcggtaatac gtagggggca agcgttgtcc 540
ggaattattg ggcgtaaagc gcgcgcaggc ggtcttttaa gtctggtgtt taagcccggg 600
gctcaacccc ggttcgcacc ggaaactgga agacttgagt gcaggagagg aaagcggaat 660
tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcggctt 720
tctggactgt aacggacgct gaggcgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc 780
tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct aggtgttagg ggtttcgata cccttggtgc 840
cgaagtaaac acaataagca ctccgcctgg ggagtacgct cgcaagagtg aaactcaaag 900
gaattgacgg ggacccgcac aagcagtgga gtatgtggtt taattcgaag caacgcgaag 960
aaccttacca ggtcttgaca tccctctgaa agccctagag atagggtcct ccttcgggac 1020
agaggtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1080
ccgcaacgag cgcaaccctt gactttagtt gccagcattg agttgggcac tctagagtga 1140
ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac 1200
ctgggctaca cacgtactac aatggccggt acaacgggaa gcgaagtcgc gagatggagc 1260
gaatccttag aagccggtct cagttcggat tgcaggctgc aactcgcctg catgaagtcg 1320
gaattgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg tcttgtacac 1380
accgcccgtc acaccacgag agtttacaac acccgaagcc ggtggggtaa cccgcaaggg 1440
ggccagccgt cgaaggtggg gtagatgatt ggggtgaagt cgtaacaagg taaccg 1496

Claims (10)

1.一种微生物肥，其特征在于，所述的微生物肥包含胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）。
2.如权利要求1所述的微生物肥，其特征在于，所述的胶质芽孢杆菌的保藏号为CCTCCNO：M2020163。
3.如权利要求2所述的微生物肥，其特征在于，所述的微生物肥中各组分及其重量比分别为：胶质芽孢杆菌65-90份、解淀粉芽孢杆菌25-35份、苏云金芽孢杆菌20-30份、哈茨木霉40-66份和沼泽红假单胞菌30-55份。
4.如权利要求3所述的微生物肥，其特征在于，所述的微生物肥中各组分及其重量比分别为：胶质芽孢杆菌90份、解淀粉芽孢杆菌25份、苏云金芽孢杆菌30份、哈茨木霉55份和沼泽红假单胞菌45份。
5.如权利要求1-4任一所述的微生物肥，其特征在于，所述的解淀粉芽孢杆菌的菌种编号为CGMCC 1.8713，所述的苏云金芽孢杆菌的菌种编号为CGMCC 1.7887，所述的哈茨木霉的菌种编号为CGMCC 5.1233，所述的沼泽红假单胞菌的菌种编号为CGMCC 1.2352。
6.权利要求1-5任一所述微生物肥的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
（1）将胶质芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、哈茨木霉和沼泽红假单胞菌分别活化后，扩大培养至对数生长期，将发酵液冷冻干燥，制成活菌量高达1010-1011CFU/g的超浓缩菌粉；
（2）将步骤（1）制得的超浓缩菌粉按照如下重量比：胶质芽孢杆菌65-90份、解淀粉芽孢杆菌25-35份、苏云金芽孢杆菌20-30份、哈茨木霉40-66份和沼泽红假单胞菌30-55份配制成微生物肥。
7.权利要求1-5任一所述的微生物肥在农作物种植中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述微生物肥可以单独施用，用量为25-60kg/亩。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述微生物肥可以按10-30%（质量比）的比例与无机肥和/或有机肥混合施用，用量为50-100kg/亩。
10.权利要求1-5任一所述的微生物肥在植物病害防治中的应用。
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