CN113980854A - 一种促进豆科作物增加根瘤数量与根瘤固氮酶活性的微生物菌剂及其应用 - Google Patents

一种促进豆科作物增加根瘤数量与根瘤固氮酶活性的微生物菌剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属微生物技术领域，具体涉及一种促进豆科作物增加根瘤数量与根瘤固氮酶活性的微生物菌剂及其应用，所述微生物菌剂由解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和路德维希肠杆菌4种微生物菌分别经发酵培养后浓缩混合复配而成。该微生物菌剂能有效促进具固氮酶活性的根瘤数量与固氮酶活性的增加，促进作物生长，提高作物产量和产品品质。

Description

一种促进豆科作物增加根瘤数量与根瘤固氮酶活性的微生物 菌剂及其应用
技术领域
本发明属微生物技术领域，具体涉及一种促进豆科作物增加根瘤数量与根瘤固氮酶活性的微生物菌剂及其应用。
背景技术
花生等豆科作物根系能够与土壤中的根瘤菌共生结瘤固氮。当花生根系萌发生长时，根瘤菌通过根系裂缝侵入，刺激根系皮层细胞发育，在主根和侧根上逐渐形成肉眼可见的根瘤。根瘤菌在根瘤中定殖并大量繁殖，到一定时期形成许多球形的类菌体，并通过固氮酶作用进行生物固氮，将空气中的氮气转化为氮肥，供给豆科作物氮素营养，不仅提高了土壤肥力，促进作物高产，还降低化肥投入、减少环境污染。因此生物固氮对改善土壤营养、解决农业和能源的可持续发展问题起重要的作用。
然而，农业实际生产中过度依赖化学合成肥料，长期过量或不合理使用导致土壤板结、微量元素缺乏、土壤养分失调，抑制了根瘤菌和土壤固氮菌的生长繁殖和结瘤，导致花生等豆科作物根瘤数量少，生物固氮效率低。此外，豆科植物与根瘤菌共生具有较强的专一性，新种植的土壤中有效根瘤菌的数量往往很少，需人工接种高效优良菌株才能充分发挥固氮作用。微生物菌剂是一种环境友好型肥料，能提高土壤肥力、利于土壤有益微生物繁殖、优化微生态环境，提高豆科作物生物固氮能力，促进增产。因此高效固氮微生物筛选和根瘤固氮微生物菌肥应用一直是生物固氮研究领域中的热点，近年来，微生物肥料发展迅速，品种不断增加。但是由于菌种种类、固氮能力、生产技术以及有效活菌数等原因，导致菌肥效果不明显，目前能够大规模应用到生产中并具显著结瘤固氮作用，特别是诱导豆科作物产生“超级结瘤”现象的产品尚无。
综上所述，本发明的目的是针对现有技术不足，研制和应用一种微生物菌剂，旨在高效促进豆科作物增加根瘤数量，提高生物固氮效应。本发明主要由解淀粉酶芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporu)、胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)和路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwiggi，CN105586300 B)4种分离自我国花生主产区花生荚果和根际的外生和内生菌株研制而成，具有促进花生等豆科作物根瘤数、根瘤重、根瘤密度显著增加，增强根瘤固氮酶活性，提高叶片叶绿素含量，提高植株氮含量和总生物量等作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种促进豆科作物增加根瘤数量与根瘤固氮酶活性的微生物菌剂及其应用，旨在提高花生等豆科作物结瘤固氮效应。该微生物菌剂能有效促进具固氮酶活性的根瘤数量与固氮酶活性的增加，促进作物生长，提高作物产量和产品品质。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
提供一种促进豆科作物增加根瘤数量与根瘤固氮酶活性的微生物菌剂，所述微生物菌剂由解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporu)、胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)和路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)4种微生物菌分别经发酵培养后浓缩混合复配而成。
进一步地，所述的解淀粉芽孢杆菌为保藏号CCTCC NO:M 20211295的解淀粉芽孢杆菌BA-HZ54菌株，保藏日:2021年10月20日，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址为：中国武汉，武汉大学；
所述的侧孢短芽孢杆菌为保藏号为CCTCCNO:M 20211296的侧孢短芽孢杆菌BL-TS08菌株，保藏日:2021年10月20日，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址为：中国武汉，武汉大学；
所述的胶质芽孢杆菌为保藏号CCTCCNO:M 20211297的胶质芽孢杆菌BM-TS05菌株，保藏日:2021年10月20日，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址为：中国武汉，武汉大学。
进一步地，所述的路德维希肠杆菌为保藏号CCTCC NO:M 2016014的路德维希肠杆菌BG10-1菌株，所述的路德维希肠杆菌已于2016年1月7日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2016014(CN 201610155898.9)。
优选地，解淀粉芽孢杆菌有效活菌数≥2×109cfu/克，侧孢短芽孢杆菌有效活菌数≥2×109cfu/克，胶质芽孢杆菌≥1×1010cfu/克，路德维希肠杆菌有效活菌数≥1×1010cfu/克。
上述4种微生物菌株分离于我国花生主产区花生荚果及根际中。
进一步地，本发明所述微生物菌剂为高浓缩活菌颗粒剂或粉剂、水剂，优选为颗粒剂。
按上述方案，上述颗粒剂的载体为腐殖酸、木薯粉以及膨润土粘合剂。腐殖酸、木薯粉以及膨润土粘合剂的重量比例约为8.5:10:0.5，原料均匀混合后造粒并烘干，得到颗粒载体，待用。
按上述方案，本发明所述的微生物菌剂是将各菌种的浓缩菌液与上述颗粒载体复配生产而成。具体为，分别将各菌种发酵液离心所得的浓缩菌体溶于适量水中，将其均匀喷雾吸附于颗粒载体上。
提供一种上述微生物菌剂在促进豆科作物根瘤数增加与增加根瘤固氮酶活性上的应用。
按上述方案，具体施用方法为，将微生物菌剂在豆科作物播种或生长期施用，用量2-4kg/亩。具体地，可单施或随基肥混拌后一起人工撒施/穴施，或机械撒施于土壤。
按上述方案，所述的豆科作物包括但不限于花生、大豆、苜蓿草、紫云英等。
按上述方案，上述应用还包括诱导豆科作物产生超级结瘤现象。
本发明有益效果：
1.本发明能高效促进花生、大豆、苜蓿草、紫云英等豆科作物根瘤增多、根瘤固氮酶活性增强，诱发根系出现超级结瘤现象，显著提高根系固氮酶活性和生物固氮效应，提高豆科作物氮素营养供应能力，并具有促进作物生长、提高植株叶绿素含量、氮含量及干物质累积，最终提高作物产量和品质等有益效果，经济效益显著。
2.本发明可单施，也可在播种期随肥施用，使用简单，易于推广应用，且亩用量少(仅2-4kg/亩)，节本增效显著。
3.本发明不仅避免了过量化学肥料投入造成的环境污染和能源浪费，还有利于提高土壤肥力，改善农田生态环境，生态效益显著，对化肥减施、碳达峰和碳中和具有重要意义。
附图说明
图1：促进豆科作物增加根瘤数量的微生物菌剂；
图2：对照区与菌剂处理区花生根瘤比对；
图3：对照与菌剂处理花生长势比对；
图4：对照与处理花生根瘤固氮酶活性比对；
图5：对照与处理每平米花生植株鲜重比对；
图6：对照与处理单株花生植株干重比对；
图7：对照与菌剂处理花生单株瘤数和单株瘤重比对。
具体实施方式
实施例1：一种促进豆科作物增加根瘤数量的微生物菌剂的制备方法
1、菌株的鉴定
本发明涉及到的微生物菌株是从河北唐山、广西贺州花生荚果和根际经细菌常规分离纯化和16S rDNA序列分子鉴定获得。其中解淀粉芽孢杆菌BA-HZ54菌株、侧孢短芽孢杆BL-TS08菌株和胶质芽孢杆菌BM-TS05菌株于2021年10月20日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号分别为CCTCCNO:M20211295、CCTCCNO:M20211296和CCTCC NO:M20211297。路德维希肠杆菌已于2016年1月7日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2016014(中国专利申请号201610155898.9)。
2、微生物菌剂制备
1)微生物发酵生产。在无菌条件下，将活化后的解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆、胶质芽孢杆菌和路德维希肠杆菌接种到分别接种到液体培养基中(含玉米粉3.5-4.0％，蛋白胨1.5-2.0％，K2HPO4+KH2PO4，1:1，0.4-0.5％，水1L，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min)，三角瓶180r/min、37℃摇培24h。然后按1％接种量分别接种到300L发酵罐中进行发酵生产。发酵培养温度为30-37℃，pH7.0-7.2，搅拌速度为180-220rpm，待菌体量达到1×1010cfu/ml后停止发酵。
2)微生物菌剂颗粒载体制备。所述颗粒载体由腐殖酸、木薯粉、以及膨润土粘合剂组成。上述原料在颗粒载体中所占的比例为8.5:10:0.5，原料均匀混合后经造粒机造粒后烘干待用。
3)微生物菌剂产品制备。按照解淀粉芽孢杆菌200mL+侧孢短芽孢杆200mL+胶质芽孢杆菌1L+路德维希肠杆菌1L的发酵液生产1Kg菌肥的比例，分别将确定体积的4个菌种发酵液离心所得的菌体，溶于适量水中制成混合菌悬液，然后在混合机内对载体进行喷雾(菌悬液与载体的质量比为1:10)，低温(≤60℃)干燥后即可制得微生物菌剂(见图1)，经包装可得到成品微生物菌剂产品。研制成的微生物菌剂中解淀粉芽孢杆菌有效活菌数≥2×109cfu/克，侧孢短芽孢杆菌有效活菌数≥2×109cfu/克，胶质芽孢杆菌≥1×1010cfu/克，路德维希肠杆菌有效活菌数≥1×1010cfu/克。
实施例2：微生物菌剂应用在促进花生等豆科作物增加根瘤数的效果
1、田间试验设置
在河南正阳、河北唐山、辽宁阜新、湖北襄阳等我国花生等豆科作物主产区进行微生物菌剂产品田间示范应用，各点试验面积50亩，设置对照组和处理组，处理组与对照组间设隔离带。
对照组：面积25亩，品种为当地主栽品种，采用当地常规播种方式，以及除草、病虫害防治、控旺等常规田间管理措施。
处理组：面积、品种、播种方式、田间管理技术均同对照组，在此基础上，于花生播种期以2kg/亩用量与基肥一起混匀，随肥机械或人工均匀撒施于土壤。
2、结瘤情况调查和测定
处理与对照相比：(1)花生根系发达，长势稳健，不早衰；(2)根瘤数显著增加，增长50倍以上；花生收获前进行根系及结瘤状况调查与瘤数、瘤重及根瘤密度等测定(不同试验点对照与处理各至少5个植株样)，调查与测定结果见图2、图7：①菌剂处理与对照相比花生根系更发达，长势更稳健；②菌剂处理显著促进各试验点根瘤数增多增大，对照组花生根瘤稀少，处理组根瘤多而浓密；③菌剂处理单株瘤数、单株瘤重显著增加，增长50倍以上。上述结果表明，微生物菌剂处理根瘤数、根瘤重及根瘤密度等较对照显著增加，本发明能高效促进花生等都豆科作物根系结瘤固氮。
实施例3：微生物菌剂应用在提高花生等豆科作物根瘤固氮酶活性的效果
田间实验设置同实施例2。
固氮酶活性反映了根瘤固氮能力的强弱，为了进一步明确微生物菌剂处理的花生根系根瘤是否具有固氮酶活性，采用本领域专业人员公认的乙炔还原法检测对照组和处理组根系根瘤固氮酶活性，具体步骤如下。
1)气相色谱的参数设定：本发明用氢离子火焰法(FID)检测乙烯、乙炔的峰值。操作步骤详见仪器说明。国产GC-4000系列气相色谱仪的工作参数为：汽化室温度：120℃；层析室温度：60℃；氢焰：130℃；柱压：～0.1Mpa；空气压力：～0.2Mpa，氢气压力：～0.05Mpa；载气(N2)压力：～0.3Mpa衰减：1×或2×，色谱柱：GDX-502
检测时，用微量进样器吸取气体样品50-100μL，乙烯在色谱柱的保留时间为1.5–2.5分钟。
2)根瘤固氮酶活检测：适量根瘤放入小玻璃瓶中，橡皮塞密封瓶口，每个实验处理≥5个重复。用注射器从瓶中抽出1/10体积的空气，造成瓶内负压，再注入1/10瓶体积的乙炔气作为固氮酶底物。小瓶置28℃反应2小时后取出作检测。
3)乙烯标准曲线制作：取6个相同体积的玻璃瓶，用微量进样器分别加一定体积的乙烯气体，检测其峰值。乙烯体积梯度的选择根据根瘤样品的乙烯还原能力而定。原则是：样品和标准曲线在色谱仪的同一条件下测定时，标准曲线的峰面积值范围覆盖所有待测样品的峰面积值。
乙烯体积＝K×峰面积
K为响应系数，可由标准曲线中乙烯体积值与对应的峰面积值作线性回归计算而求得。
4)酶活计算：
固氮酶活性为单位重量的根瘤在单位时间内还原乙炔的摩尔数：
固氮酶活＝乙炔的摩尔数/鲜根瘤重×反应时间
根据气体的摩尔数与体积、温度，压力的关系，摩尔数可由乙烯体积求得：
Figure BDA0003353550010000061
式中：t℃：摄氏气温；P：气压，通常取760毫米汞柱；
22.4：1mol气体在标准状态下的体积是22.4升；273是绝对温度
结果显示，菌剂处理高效促进了花生根系结瘤，且这些根瘤均具有固氮酶活性，菌剂处理的单克根瘤及单株根系固氮酶活性显著增加(图4)。对照花生单克根瘤固氮酶活范围为0.027～0.68μmol/g.h，平均值为0.36μmol/g.h，处理组花生单克根瘤固氮酶活范围为1.19～2.98μmol/g.h，平均值为2.07μmol/g.h，处理组单克根瘤固氮酶活较对照提高5倍以上；对照花生单株根系固氮酶活范围为0.020～0.33μmol/株.h，平均值为0.18μmol/株.h，处理组花生单株根系固氮酶活范围为4.51～10.60μmol/株.h，平均值为7.10μmol/株.h，处理组单株根系固氮酶活性提高达40倍。
结果表明，本发明微生物菌剂能显著增强花生等豆科作物根瘤固氮酶活性，提高根瘤生物固氮能力和固氮效应，对花生等豆科作物氮素营养供给，农田化肥减施，碳达峰、碳中和等具有重要的现实意义。
实施例4：微生物菌剂应用提高花生等豆科作物叶绿素含量
田间实验设置同实施例2。
花生生育期调查植株长势及叶片情况，发现菌剂处理区较对照区花生长势强，叶色更绿(图3)。在花生生长期采集花生叶片，采用分光光度法测定河南、吉林、湖北、湖南、四川等试验点叶片(每个试验点随机采集3个样，每个样由至少5个单株叶片混合而成)叶绿素含量，样品处理和检测方法步骤具体参加国家标准GB/T 22182-2008《油菜籽叶绿素含量测定分光光度法》。
微生物菌剂处理叶绿素含量比对结果见表1，对照组花生叶片叶绿素含量为447.49～498.16mg/kg，平均值471.57mg/kg，本发明微生物菌剂处理花生叶片叶绿素含量为492.70～531.39mg/kg，平均值511.54mg/kg。菌剂处理明显提高花生叶片叶绿素含量，比对照增加5.45％～13.39％，平均增加8.48％。
结果表明，本发明具有改善作物氮素营养，提高叶片叶绿素含量和氮含量，从而提高蛋白质含量，改善作物营养品质。
表1微生物菌剂处理叶绿素含量比对
Figure BDA0003353550010000071
实施例5：微生物菌剂应用提高花生等豆科作物生物量及干物质积累
田间试验设置同实施例2。
对收获期花生植株每平方米(每个试验点对照和处理各随机选择3个点，每个点2平米进行取样测定)及单株(每个试验点对照和处理随机选择10株以上)地上鲜重、花生果鲜重及干重调查和称重。
辽宁、吉林、河南、江苏、湖北等花生主产区示范应用点每平方米花生地上鲜重和地下鲜重测定结果见图5：各试验点对照区每平方米花生地上植株鲜重含量范围0.1～2.67Kg，平均值1.42Kg，处理区每平方米花生地上植株鲜重含量范围为0.2～3.54Kg，平均值2.15Kg，是对照的1.5倍；各试验点对照区每平米花生果鲜重含量范围0.6～1.01Kg，平均值0.86Kg/m2，处理区每平米花生果鲜重含量范围为0.8～1.28Kg，平均值1.03Kg，是对照的1.2倍。
单株花生地上植株干重测定，结果见图6：对照区单株花生地上干重15.9～40.9g，平均值26.8g，菌剂处理区单株花生地上干重28.6～41.8g，平均值34.1g，处理区单株干重较对照增加27.2％。
结果表明，菌剂处理具有增加花生等豆科作物地上部和地下部生物量及干物质积累作用，从而提高作物产量和品质。
本发明提供的一种由解淀粉芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌及路德维希肠杆菌混合研制而成的微生物菌剂，能有效增加花生等豆科作物根瘤数量，提高根瘤固氮酶活性和生物固氮效应，促进作物生长，提高叶片叶绿素含量、地上和地下鲜重，促进干物质累积，提高作物产量和品质，具有明显的经济效益和生态效益，在花生、大豆、苜蓿草、紫云英等豆科作物上有广阔的应用前景，对农田化肥减施、碳达峰、碳中和及农业产业高质量发展具有重要意义。

Claims (10)

1.一种促进豆科作物增加根瘤数量与根瘤固氮酶活性的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂由解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporu)、胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)和路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)4种微生物菌分别经发酵培养后浓缩混合复配而成；
所述的解淀粉芽孢杆菌为保藏号CCTCC NO:M 20211295的解淀粉芽孢杆菌BA-HZ54菌株；所述的侧孢短芽孢杆菌为保藏号为CCTCCNO:M 20211296的侧孢短芽孢杆菌BL-TS08菌株；所述的胶质芽孢杆菌为保藏号CCTCCNO:M 20211297的胶质芽孢杆菌BM-TS05菌株。
2.根据权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于：所述的路德维希肠杆菌为保藏号CCTCC NO:M 2016014的路德维希肠杆菌BG10-1菌株。
3.根据权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于：解淀粉芽孢杆菌有效活菌数≥2×109cfu/克，侧孢短芽孢杆菌有效活菌数≥2×109cfu/克，胶质芽孢杆菌≥1×1010cfu/克，路德维希肠杆菌有效活菌数≥1×1010cfu/克。
4.根据权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂为高浓缩活菌颗粒剂或粉剂、水剂。
5.根据权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于：颗粒剂的载体为腐殖酸、木薯粉以及膨润土粘合剂，腐殖酸、木薯粉以及膨润土粘合剂的重量比例为8.5:10:0.5，原料均匀混合后造粒并烘干，得到颗粒载体，待用。
6.根据权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于：所述的微生物菌剂是将各菌种的浓缩菌液与上述颗粒载体复配生产而成颗粒剂。
7.权利要求1所述的微生物菌剂在促进豆科作物根瘤数增加与增加根瘤固氮酶活性上的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：具体施用方法为，将微生物菌剂在豆科作物播种或生长期施用，用量2-4kg/亩。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的豆科作物包括但不限于花生、大豆、苜蓿草、紫云英。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：上述应用还包括诱导豆科作物产生超级结瘤现象。
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