CN112336862B - β3-肾上腺素能受体激动剂在制备治疗神经系统疾病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及β3‑肾上腺素能受体激动剂在制备治疗或预防神经系统类疾病的药物中的应用。本发明通过研究发现，β3‑肾上腺素能受体激动剂能够抑制自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型骨髓造血干细胞及相关前体细胞的分化，减少中性粒细胞以及CD4⁺T淋巴细胞、B淋巴细胞等的生成，从而减少CD4⁺T淋巴细胞、B淋巴细胞向中枢神经系统的浸润，最终抑制EAE小鼠的中枢神经系统炎症，减少组织损伤，对于治疗神经炎症性疾病和免疫性疾病具有重要的临床应用价值。本发明还公开了一种药物组合物，所述药物组合物包括β3‑肾上腺素能受体激动剂，可以作为神经系统类疾病的治疗药物。

Description

β3-肾上腺素能受体激动剂在制备治疗神经系统疾病的药物 中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及β3-肾上腺素能受体激动剂在制备治疗或预防神经系统疾病的药物中的应用，特别涉及米拉贝隆在制备治疗或预防神经系统疾病的药物中的应用。

背景技术

炎症是机体免疫系统依据内外环境变化所表现出的适度或异常的系统反应，适度的炎症免疫反应对于保护机体免受内环境的病理损害具有重要作用，但过度的炎症和免疫反应会引起中枢神经系统(Central Nervous System，CNS)和外周神经系统(PeripheralNervous System，PNS)损伤，导致神经系统炎症性疾病。近年来，人们发现继发性炎症和免疫反应也可以显著影响多种神经系统疾病的临床症状及预后，如脑卒中、颅脑损伤、癫痫，以及阿尔茨海默病、帕金森病等退行性病变。因此，控制炎症免疫反应对于诸多神经系统疾病的预防及治疗，均有重要意义。

多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)是由活化后的CD4⁺T细胞介导的累及中枢神经系统的自身免疫性疾病，其主要的免疫机制为外周淋巴细胞进入CNS后引起神经纤维不可逆的炎性脱髓鞘改变及轴突损伤。治疗MS的传统药物包括可帕松(Copaxone)、干扰素β等，副作用较轻，但疗效不显著。新进美国FDA批准的药物如那他珠单抗(Natalizumab)和芬戈莫德(Fingolimod)对MS有显著疗效，这些药物通过抑制淋巴细胞粘附或迁移来减轻神经炎症，但可能引起进行性多灶性白质脑病和心源性猝死等严重并发症。另一种典型的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病-视神经脊髓炎(Neuromyelitis optica，NMO)在亚洲尤其我国发病率高，神经组织受损更严重，且目前仍缺乏有效疗法。

自身免疫性T淋巴细胞和B淋巴细胞是决定神经免疫性和炎症性疾病发展和转归的核心部分，而骨髓则是成人免疫细胞的生发场所。骨髓来源的免疫细胞的增殖和分化受到外界环境因素和内部信号通路的共同调控，然而，神经炎症性疾病对造血干细胞的动态调控作用，及其对神经免疫炎性疾病发展和转归的影响，还尚不清楚。

因此，重新评估神经免疫和炎症疾病的病理机制，以寻找新的药物或治疗手段，是当前亟待解决的重要问题。

发明内容

发明要解决的问题

鉴于现有技术存在的问题，例如，对于神经系统的炎症疾病和免疫疾病，缺少有效治疗手段的问题。为此，本发明提供了β3-肾上腺素能受体激动剂在制备治疗或预防神经系统疾病的药物中的应用。

用于解决问题的方案

(1)β3-肾上腺素能受体激动剂在制备治疗或预防神经系统疾病的药物中的应用。

(2)根据(1)所述的应用，其中，所述神经系统疾病包括神经炎症性疾病和/或神经免疫性疾病；可选地，所述神经免疫性疾病为神经系统的自身免疫性疾病。

(3)根据(1)或(2)所述的应用，其中，所述神经系统疾病包括多发性硬化症、脑脊髓炎、视神经脊髓炎、脑卒中、颅脑损伤、癫痫、阿尔茨海默病和/或帕金森病。

(4)根据(1)-(3)任一项所述的应用，其中，所述β3-肾上腺素能受体激动剂为米拉贝隆。

(5)根据(1)-(4)任一项所述的应用，其中，所述药物还包括一种或多种药学上可接受的载体；可选地，所述药学上可接受的载体包括溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、矫味剂、矫嗅剂、着色剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、pH调节剂、稳定剂、稀释剂、助流剂、表面活性剂和/或防腐剂。

(6)根据(1)-(5)任一项所述的应用，其中，所述药物还包括一种或多种神经系统疾病的治疗药物。

(7)根据(1)-(6)任一项所述的应用，其通过包括以下各项在内的途径中的一种施用所述药物：静脉内施用、腹膜内施用、冠状动脉内施用、动脉内施用、皮内施用、皮下施用、透皮递送、气管内施用、关节内施用、心室内施用、吸入、脑内、经脐、口服、眼内、肺部施用、导管注入、通过栓剂以及直接注射到组织中。

(8)一种药物组合物，其用于治疗或预防神经系统疾病，其中，所述药物组合物包括β3-肾上腺素能受体激动剂。

(9)根据(8)所述的药物组合物，其中，所述β3-肾上腺素能受体激动剂为米拉贝隆。

(10)根据(8)或(9)所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包括一种或多种神经系统疾病的治疗药物；可选地，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体。

发明的效果

本发明通过研究发现，β3-肾上腺素能受体激动剂能够抑制自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型(EAE)骨髓造血干细胞及相关前体细胞的分化，减少中性粒细胞以及CD4⁺T淋巴细胞、B淋巴细胞等的生成，从而减少CD4⁺T淋巴细胞、B淋巴细胞向中枢神经系统的浸润，最终抑制EAE中的中枢神经系统炎症，减少组织损伤，对于治疗神经炎症性疾病和免疫性疾病具有重要的临床应用价值。

附图说明

图1示出了自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型免疫后立即予米拉贝隆或PBS灌胃治疗，造模后至25天进行临床评分。图中，米拉贝隆给药组：通过MOG35-55免疫诱导C57/BL6小鼠EAE，免疫后立即给予米拉贝隆灌胃；PBS对照组：通过MOG35-55免疫诱导C57/BL6小鼠EAE，免疫后立即给予PBS灌胃。

图2示出了在EAE高峰期，流式细胞术检测米拉贝隆对CNS内各种免疫细胞的浸润以及Th细胞的分化的影响。图2A示出中性粒细胞、Ly6C^low单核细胞、Ly6C^high单核细胞、巨噬细胞、B细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞向中枢神经系统浸润的数量；图2B示出了Th1细胞、Th17细胞的数量检测结果。

图3示出了在EAE高峰期，流式细胞术检测米拉贝隆对小鼠骨髓造血细胞及其下游细胞数目的影响。图3A示出了LSK细胞和HSC细胞的数量检测结果；图3B示出了CMP细胞、MDP细胞和CLP细胞的数量检测结果；图3C示出了中性粒细胞、Ly6C^low单核细胞、Ly6C^high单核细胞、巨噬细胞、B细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞的数量检测结果。

图4示出了Tamoxifen诱导后的Fgd5-CreER-tdTomato小鼠进行EAE造模，并在免疫后立即给予米拉贝隆治疗，在第14天，流式检测骨髓内新生细胞(tdTomato+)的数量。图中，米拉贝隆给药组：Fgd5-CreER-tdTomato小鼠连续5天腹腔注射Tamoxifen(3mg/只鼠)，后诱导EAE模型，并给予米拉贝隆灌胃；PBS对照组：Fgd5-CreER-tdTomato小鼠连续5天腹腔注射Tamoxifen(3mg/鼠)，后诱导EAE模型，并给予PBS灌胃。图4A示出了Tamoxifen诱导后的Fgd5-CreER-tdTomato小鼠进行EAE造模的过程；图4B示出了骨髓内新生细胞中LSK、HSC、CMP、GMP、MDP、CLP的细胞数量；图4C示出了骨髓内新生细胞中中性粒细胞、Ly6C^low单核细胞、Ly6C^high单核细胞的细胞数量；图4C示出了骨髓内新生细胞中B细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞的细胞数量。

图5示出了在EAE高峰期，流式细胞术检测米拉贝隆对骨髓内新生的免疫细胞(中性粒细胞、Ly6C^low单核细胞、Ly6C^high单核细胞、巨噬细胞、B细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞)向CNS浸润的影响。

图6示出了在EAE高峰期，分选小鼠骨髓HSC细胞，PCR检测Eomes，CD44，Ncf4，Trem2，Bax基因开关的表达水平。图中健康鼠表示未进行干预的小鼠；EAE+米拉贝隆：通过MOG35-55免疫诱导小鼠自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，免疫后立即给予米拉贝隆灌胃。EAE+PBS：通过MOG35-55免疫诱导小鼠自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，免疫后立即给予PBS灌胃。

图7示出了在EAE高峰期，分选小鼠骨髓HSC细胞，细胞内染色分析HSC细胞内RhoGTPase的表达情况。图中，米拉贝隆给药组(EAE+米拉贝隆)：通过MOG35-55免疫诱导C57/BL6小鼠自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，免疫后立即给予米拉贝隆灌胃；PBS对照组(EAE+PBS)：通过MOG35-55免疫诱导C57/BL6小鼠自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，免疫后立即给予PBS灌胃。

具体实施方式

以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

如无特殊声明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。

本说明书中，如没有特别说明，则“％”均表示质量百分含量。

本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

首先，本发明提供了β3-肾上腺素能受体激动剂在制备治疗或预防神经系统疾病的药物中的应用。

本发明在研究中发现，在自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型中，EAE能够激活骨髓造血干细胞，促进其向淋巴系细胞，以及单核、粒细胞前体细胞的方向分化。而β3-肾上腺素能受体激动剂能够抑制内骨髓造血干细胞及相关前体细胞的分化，减少中性粒细胞以及CD4⁺T淋巴细胞、B淋巴细胞等的生成，从而减少CD4⁺T淋巴细胞、B淋巴细胞向中枢神经系统的浸润，进一步减轻炎症反应和自身免疫性反应，减少组织损伤，对于神经炎症性疾病和免疫性疾病的治疗具有重要意义。

在本发明中，术语“自身免疫性脑脊髓炎”(Experimental autoimmuneencephalomyelitis，EAE)是一种以特异性致敏的CD4⁺T细胞介导为主的，以中枢神经系统内小血管周围出现单个核细胞浸润及髓鞘脱失为特征的自身免疫性疾病，EAE小鼠模型是人类多发性硬化(MS)的理想动物模型，在临床神经免疫学的研究中具有重要意义。

在本发明中，术语“神经炎症类疾病”是指表现有神经炎症反应的神经系统疾病，例如，神经炎症参与其发生、发展过程的阿尔兹海默病、帕金森病等神经退行性疾病，颅脑损伤等由外部损伤引起的神经系统疾病，癫痫等慢性神经系统疾病，以及脑卒中等急性心脑血管疾病。

在本发明中，术语“神经免疫性疾病”是指由于机体对自身抗原发生反应免疫，引起神经系统病变。例如，多发性硬化症、视神经脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎(acutedisseminated encephalomyelitis，ADEM)等中枢神经系统自身免疫性疾病。

在本发明中，术语“肾上腺素能受体”在接受交感神经节后纤维支配的各种器官中存在着与肾上腺素、去甲肾上腺素起反应的受体。肾上腺素能受体可以分为三个亚型，分别为β1受体、β2受体和β3受体。β1受体主要分布于心脏，占肾上腺素能受体总量的75％-80％，功能上β1受体与心肌收缩力和速率的增加以及房室结传导速率有关。β2受体主要分布于肝脏、肺脏、子宫和肾脏外周血管。β3受体主要分布于白色脂肪和棕色脂肪上，在小肠、胆囊、尿道括约肌和膀胱中，在前列腺和胃中也有表达。

在本发明中，术语“β3-肾上腺素能受体激动剂”是能够选择性激活β3-肾上腺素能受体的激动剂。目前，选择性β3-肾上腺素能受体激动剂正在被开发用于治疗II型糖尿病、肥胖症和膀胱过度活动症。关于β3-肾上腺素能受体激动剂在治疗神经系统疾病方面的研究还未见报道。

在本发明中，术语“LSK细胞”即细胞表型为Lin-/SCA1+/c^-KIT+的细胞，来自于小鼠骨髓中，是分离小鼠造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)的主要来源。术语“造血干细胞”(Hematopoietic stem cells，HSCs)是一群数量极少、具有自我更新能力和可生成各种血细胞及免疫细胞的起始细胞，多数以静息状态存在于骨髓中。HSCs分化出的血细胞可以分成两大群系：骨髓群系(myeloid lineage)和淋巴群系(lymphoid lineage)。

在本发明中，术语“CMP细胞”表示共同髓系前体细胞(Common myeloidprogenitor)，由HSC细胞分化而来，CMP细胞可进一步分化为GMP、MDP、MEP等细胞。术语“GMP细胞”表示粒细胞/巨噬细胞前体细胞(Granulocyte-macrophage progenitor)，可进一步分化为粒细胞、巨噬细胞等。术语“MDP细胞”表示巨噬细胞/树突状细胞前体细胞(Macrophage-dendritic cell progenitor)，由CMP细胞分化而来，可进一步分化为巨噬细胞、树突状细胞(DC细胞)等。

在本发明中，术语“CLP细胞”表示共同淋巴系前体细胞(Common lymphoidprogenitor，CLP)。CLP细胞由淋巴细胞分化而来，并可进一步分化为CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、B细胞、NK细胞、ILC细胞等。

在本发明中，术语“单核细胞”是血液中最大的血细胞，单核细胞来源于骨髓中的造血干细胞，并在骨髓中发育，目前认为它是巨噬细胞和树突状细胞的前身。术语“巨噬细胞”是一种位于组织内的白血球，源自单核细胞，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞对死亡细胞、细胞残片及病原体进行吞噬和消化，并激活淋巴细胞或其他免疫细胞，参与机体的非特异性免疫反应和细胞免疫反应。术语“树突状细胞”是一种存在于哺乳动物的白细胞，树突状细胞将抗原处理后展示给免疫系统的其他白细胞，故是一种抗原呈递细胞。此外，单核细胞和巨噬细胞还是重要的炎症调控细胞，具有促炎和抑炎的双向功能。

在本发明中，术语“B细胞”又称B淋巴细胞，是来源于骨髓的多能干细胞，B细胞在抗原刺激下可分化为浆细胞，浆细胞可合成和分泌抗体(免疫球蛋白)，主要执行机体的体液免疫。

在本发明中，术语“T细胞”又称T淋巴细胞，是由来源于骨髓的淋巴干细胞，在胸腺中分化、发育成熟后，通过淋巴和血液循环而分布到全身的免疫器官和组织中发挥免疫功能。T细胞根据功能的差异被分为几个亚型，其中，CD4⁺T细胞的细胞表面有CD4蛋白的表达，包括对其他淋巴细胞的活动起辅助作用的辅助CD4⁺T细胞，以及对于免疫耐受至关重要的调节CD4⁺T细胞。CD8⁺T细胞的细胞表面有CD8蛋白的表达，它通过识别所有有核细胞表面的MHC-I分子上的短肽抗原，来分辨正常细胞和应杀伤的异常细胞。

在本发明中，术语“Ly6C”是一种14kD的细胞表面蛋白，在50％的骨髓细胞和外周少量T淋巴细胞中表达。最近的研究表明，巨噬细胞亚群的特征在于差异性Ly6C表达，因此，Ly6C被认为是鉴定单核细胞和巨噬细胞亚群的重要表面标志物。“Ly6C^low单核细胞”为Ly6C低表达的单核细胞，“Ly6C^high单核细胞”为Ly6C高表达的单核细胞。

在本发明中，术语“治疗”被定义为向受试者或来自受试者的分离的组织或细胞系施加或施用治疗剂。所述受试者一般患有疾病或病症、存在疾病或病症的症状或对疾病或病症具有易感性。确切地说，如本文所用的治疗是针对患有神经炎症性疾病和神经免疫性疾病的受试者。治疗的目的一般是医治、治愈、缓和、减轻、救治、缓解或改善所述疾病、病症或症状。如本文所用的“经过治疗”指的是疾病或病症被医治、治愈、缓和、减轻、救治、缓解或改善。

在一些具体的实施方案中，，所述神经系统疾病包括神经炎症性疾病和/或神经免疫性疾病。进一步的，所述神经系统疾病包括多发性硬化症、脑脊髓炎、视神经脊髓炎、脑卒中、颅脑损伤、癫痫、阿尔茨海默病和/或帕金森病。

在一些具体的实施方案中，所述β3-肾上腺素能受体激动剂为米拉贝隆。米拉贝隆是第一个用于治疗膀胱过度活动症的β3-肾上腺素能受体激动剂类药物。米拉贝隆的结构如下所示：

EAE发生后，大量CD4⁺T细胞、B细胞等免疫细胞向中枢神经系统浸润，于此同时，EAE激活骨髓造血干细胞，使其大量增殖与分化，生成更多中性粒细胞以及淋巴细胞并向中枢浸润。中枢神经炎症进一步增加，组织损伤加重。为此，使用β3-肾上腺素能受体激动剂，抑制骨髓造血干细胞活性，减少骨髓来源的中性粒细胞及淋巴细胞的生成，即可减轻EAE中枢神经系统炎症，减少组织损伤(图1-图5)。

进一步探索β3-肾上腺素能受体激动剂骨髓抑制的分子机制发现，米拉贝隆通过抑制HSC内Eomes，CD44，Ncf4，Trem2，Bax等基因开关的激活，抑制HSC向淋巴细胞和中性粒细胞分化(图6)；米拉贝隆可以激活造血干细胞(HSC)和前体细胞表达的Rho-GTPase，从而抑制造血系统生成B细胞和CD4⁺T细胞，最终减轻神经炎症和组织损伤(图7)。β3-肾上腺素能受体激动剂通过抑制骨髓来源的CD4⁺T细胞和B淋巴细胞，可在多种神经免疫和炎症性疾病中起到防止或减轻神经炎症及自身免疫反应的作用，对于神经系其他类型疾病继发神经炎症及自身免疫反应的神经系统疾病，也可成为一治疗靶点。

在一些具体的实施方案中，所述药物还包括一种或多种药学上可接受的载体。在一些更为具体的实施方案中，所述药物包括治疗有效量的β3-肾上腺素能受体激动剂和一种或多种药学上可接受的载体。

在本发明中，术语“药学上可接受的载体”是指适于与人体或动物体的细胞、组织或器官相容，且不会诱发毒性、刺激性、变态反应性等毒副作用的辅料成分。示例性的，药学上可接受的载体是本领域所熟知的，包括溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、矫味剂、矫嗅剂、着色剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、pH调节剂、稳定剂、表面活性剂和/或防腐剂。

在本发明中，术语“有效量”指的是足以提供所需的作用但不存在毒性或存在可接受的毒性的化合物的量。该量在受试者之间可能有所不同，取决于受试者的物种、年龄以及身体状况、正在治疗的疾病的严重度、所使用的具体化合物、它的施用方式等。合适的有效量可以由本领域的普通技术人员确定。

在本发明中，术语“治疗有效量”用于指示活性化合物或药物制剂引起所指示的生物反应或药物反应的量。这种反应可以出现在由研究人员、兽医、内科医生或其他临床医师所试图治疗的组织、系统(包括人类在内的动物)中。

在一些具体的实施方案中，所述药物还包括一种或多种神经系统疾病的治疗药物。示例性的，神经系统疾病的治疗药物的治疗药物包括用于治疗多发性硬化症的可帕松、干扰素β、那他珠单抗、芬哥莫德等。

在一些具体的实施方案中，通过包括以下各项在内的途径中的一种施用所述药物：静脉内施用、腹膜内施用、冠状动脉内施用、动脉内施用、皮内施用、皮下施用、透皮递送、气管内施用、关节内施用、心室内施用、吸入、脑内、经脐、口服、眼内、肺部施用、导管注入、通过栓剂以及直接注射到组织中。

其次，本发明还提供了一种药物组合物在制备治疗或预防神经系统疾病的药物中的应用，其中，所述药物组合物包括β3-肾上腺素能受体激动剂。作为优选，β3-肾上腺素能受体激动剂为米拉贝隆。

药物组合物中由于包含β3-肾上腺素能受体激动剂，可以抑制骨髓来源的CD4⁺T细胞以及B细胞，减轻在多种神经炎症性疾病以及免疫性疾病中的神经炎症和自身免疫反应，有效减轻神经系统损伤。

在一些实施方案中，药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备：可通过将本公开的化合物或其药学上可接受的盐与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂组合，制成适于人或动物使用的任何剂型。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括O/W型、W/O型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

为了将包含β3-肾上腺素能受体激动剂的药物组合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将包含β3-肾上腺素能受体激动剂的药物组合物制成胶囊剂，可以将含有治疗有效量的β3-肾上腺素能受体激动剂与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将含有治疗有效量的β3-肾上腺素能受体激动剂先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备β3-肾上腺素能受体激动剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种，也可用于制备β3-肾上腺素能受体激动剂的胶囊剂。

为将包含β3-肾上腺素能受体激动剂的药物组合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

为达到用药目的，增强治疗效果，本公开的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

实施例

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

下述实施例中涉及小鼠购自美国缅因州巴尔港杰克逊实验室。

实施例1：EAE模型小鼠的临床症状及细胞分化和细胞浸润检测

1、实验动物：

C57/BL6小鼠，12周龄，雌性，随机分为米拉贝隆给药组和对照组；

Fgd5-creER-tdTomato小鼠，12周龄，雌性，随机分为米拉贝隆给药组和对照组。

2、模型建立：

将小鼠多肽抗原MOG35-55(M-E-V-G-W-Y-R-S-P-F-S-R-V-V-H-L-Y-R-N-G-K，纯度＞95％)与含有灭活结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂在注射器中反复混合进行乳化，使之形成油包水的状态。选取小鼠双侧下肢后背皮肤为注射点，皮下注射乳剂(MOG35-55 200μg，灭活结核分枝杆菌500μg)，每侧100μl，共注射200μl。在免疫的当天及两天后腹腔注射百日咳毒素200ng。每天观察小鼠的状态进行临床评分，按照0-5分的标准：0：无症状；1：尾巴无力；2：后肢无力或者步态不稳；3：完全后肢瘫痪；4：完全后肢瘫痪伴前肢无力或瘫痪；5：死亡。

3、给药方式：

Tamoxifen(Sigma-Aldrich)以30mg/ml的浓度溶于乙醇/玉米油(体积比1:9)中，Fgd5-creER-tdTomato小鼠按3mg/只小鼠剂量给药，免疫前连续5天进行腹腔注射。

米拉贝隆(Medchem,Monmouth Junction,NJ,USA)溶于DMSO/PBS(体积比1:9)中，按2mg/kg体重灌胃给药，对照组给予PBS。免疫后立即给药，每天一次，直至实验结束。

4、实验方法：

12周雌性C57小鼠通过MOG35-55免疫诱导自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，造模后给予米拉贝隆灌胃治疗，对照组小鼠给予PBS灌胃。每天观察小鼠的状态进行临床评分，直至造模后25天。在EAE高峰期，分析全脑组织中向脑内浸润的免疫细胞亚群数目，同时还检测了小鼠骨髓内造血细胞及其下游细胞数目。

Fgd5特异性表达于HSC，通过给Fgd5-CreER-tdTomato小鼠注射Tamoxifen诱导tdTomato表达可使HSC及其下游细胞被标记，从而追踪HSC的增殖和分化。我们给Tamoxifen诱导后的小鼠进行EAE造模，在第14天，检测骨髓内新生细胞(tdTomato+)，同时我们还检测了来源于骨髓新生免疫细胞向中枢浸润的情况(流式细胞术，每组小鼠6只)。

通过流式细胞术分选健康鼠，PBS处理的EAE鼠，和米拉贝隆治疗的EAE鼠骨髓的HSC，检测HSC内控制淋巴细胞和中性粒细胞分化的多个基因表达水平的变化(RT-PCR，每组小鼠6只)，同时对HSC内控制淋巴细胞和中性粒细胞生成的关键分子开关-RhoGTPase的表达情况进行了分析(免疫荧光染色，每组小鼠6只)。

5、实验结果：

5.1米拉贝隆用药对EAE小鼠疾病病程及残疾程度的影响

如图1所示，与PBS处理组相比，EAE小鼠接受米拉贝隆给药后，发病时间有所延迟，临床评分明显降低。这说明米拉贝隆确实能够减缓并减轻EAE小鼠的临床症状。

5.2米拉贝隆给药对中枢神经系统免疫细胞浸润的影响

如图2所示，在EAE高峰期，与PBS处理组相比，米拉贝隆给药组的EAE小鼠中枢神经系统浸润的B细胞和CD4⁺T细胞明显减少，Th1以及Th17细胞也明显减少。这说明米拉贝隆能够减少B细胞和CD4⁺T细胞向中枢神经系统浸润，减轻神经炎症。

5.3米拉贝隆给药对骨髓造血细胞及免疫细胞数目的影响

如图3所示，在EAE高峰期，与PBS处理组相比，米拉贝隆给药组的EAE小鼠骨髓内LSK细胞、造血干细胞(HSC细胞)、CMP、MDP以及CLP细胞数量明显减少，与此同时，骨髓内中性粒细胞及B细胞，CD4⁺T细胞明显减少。说明米拉贝隆给药确实能够使骨髓内造血细胞及免疫细胞数目减少。

5.4米拉贝隆给药抑制骨髓淋巴细胞等免疫细胞的生成，并影响其向中枢浸润。

如图4所示，EAE小鼠新生HSC及其下游细胞被tdTomato所标记，即为tdTomato+。与PBS处理组相比，米拉贝隆给药的EAE小鼠骨髓内新生LSK细胞、造血干细胞(HSC细胞)、CMP、GMP、MDP以及CLP细胞明显减少，与此同时，骨髓内新生中性粒细胞、B细胞及CD4⁺T细胞明显减少。说明米拉贝隆能够抑制HSC的活性，并抑制淋巴细胞等免疫细胞的生成。

如图5所示，在EAE高峰期，通过流式细胞术检测到，米拉贝隆给药组小鼠中枢浸润B细胞以及CD4⁺T细胞较PBS处理组明显减少。说明米拉贝隆减少了新生的B细胞和CD4⁺T细胞向CNS的浸润。

以上结果表明，在EAE模型中，米拉贝隆给药从骨髓这一源头上遏制淋巴细胞等免疫细胞的生成，并减少其向中枢浸润。

5.5米拉贝隆调控骨髓造血干细胞增殖与分化的分子机制

如图6所示，通过流式细胞术分选了健康鼠，PBS处理的EAE鼠，和米拉贝隆给药组的EAE鼠骨髓的HSC细胞，通过RT-PCR检测Eomes，CD44，Ncf4，Trem2，Bax等基因的开关表达水平。与健康鼠相比，EAE小鼠造血干细胞以上基因表达水平明显升高；与PBS对照组相比，米拉贝隆给药组小鼠造血干细胞以上基因表达水平明显降低。说明EAE明显激活了Eomes，CD44，Ncf4，Trem2，Bax等基因开关的表达，而米拉贝隆抑制了EAE对这些基因的激活作用。

如图7所示，通过流式细胞术分选了PBS处理的EAE鼠，和米拉贝隆给药的EAE鼠骨髓的HSC细胞，通过细胞内染色分析RhoGTPase的表达情况。与PBS处理组相比，发现，米拉贝隆给药组小鼠造血干细胞表达Cdc42，Rac1，Rac2,GATA1水平明显升高。说明米拉贝隆明显增加了活化形态的RhoGTPase(Cdc42，Rac1，Rac2,GATA1)表达，从而抑制HSC向淋巴及中性粒细胞方向分化。

以上结果表明，米拉贝隆分别在基因水平和蛋白水平上调控造血干细胞的活性，并减少其向淋巴细胞及中性粒细胞方向分化。

本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。

Claims (6)

1.β3-肾上腺素能受体激动剂在制备治疗或预防神经免疫性疾病的药物中的应用，所述β3-肾上腺素能受体激动剂为米拉贝隆，所述神经免疫性疾病为脑脊髓炎；

所述米拉贝隆减轻神经系统炎症，减少所述神经免疫性疾病的免疫细胞数目及免疫细胞向中枢神经系统的浸润。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述药物还包括一种或多种药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述药学上可接受的载体包括溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、矫味剂、矫嗅剂、着色剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、pH调节剂、稀释剂和/或防腐剂。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其中，所述药物还包括一种或多种神经系统疾病的治疗药物。

5.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其通过包括以下各项在内的途径中的一种施用所述药物：静脉内施用、腹膜内施用、动脉内施用、皮内施用、透皮递送、气管内施用、关节内施用、心室内施用、吸入、脑内、经脐、口服、眼内、肺部施用、导管注入、通过栓剂以及直接注射到组织中。

6.根据权利要求5所述的应用，其通过以下途径施用所述药物：冠状动脉内施用。

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