CN112972462B - 帕比司他在制备预防、缓解和/或治疗多发性硬化症药物中的应用 - Google Patents

帕比司他在制备预防、缓解和/或治疗多发性硬化症药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了帕比司他在制备预防、缓解和/或治疗多发性硬化症药物中的应用。在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎模型上，帕比司他显示了很好的治疗作用，其可有效地治疗疾病的病理变化和疾病的进展。其治疗作用是通过抑制中枢神经系统内小胶质细胞的增殖。

Description

帕比司他在制备预防、缓解和/或治疗多发性硬化症药物中的 应用
技术领域
本发明涉及帕比司他在制备预防、缓解和/或治疗多发性硬化症药物中的应用，属于医药技术领域。
背景技术
多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)是一种以中枢神经系统炎性脱髓鞘病变为主要特征的自身免疫性疾病，其具有高复发、易致残的特点。临床多表现为瘫痪、麻木、痛性痉挛、失语、视力障碍等。流行病学研究显示，每100000万人中有50-300人患有多发性硬化症，全球有230万人患有多发性硬化症，主要集中在欧美国家。多发性硬化症患病率随所处的纬度增加而增高，且女性发病率是男性的两倍(Neurology.2014；83(11):1022-1024)。多发性硬化症的病因尚不明确，可能与遗传、环境、感染等多种因素相关。根据患者的临床表现，多发性硬化症可分为四种类型：复发缓解型，表现为复发缓解交替，病情无明显进展；原发进展型，即起病后不断恶化；继发进展型，以复发缓解型起病继以不断恶化；进展复发型，发病后病情逐渐进展伴有复发(Neurology.2014；83(3):278-286)。目前，临床上的治疗药物多针对的是复发缓解型的病人。多发性硬化症的病理变化较为复杂，主要包括局部炎症反应、免疫系统失调、胶质细胞增生、髓鞘脱失、神经元及轴索损伤等(Neuron.2018；97(4):742-768)。
多发性硬化症的发病机制尚未完全阐明，其中公认的机制是由自身反应性T淋巴细胞介导的免疫应答。外周中的T细胞被抗原提呈细胞提呈的抗原激活，分化为Th1和Th17细胞亚群,并分泌各种炎症性细胞因子，这些细胞和炎性反应因子渗入中枢神经系统，破坏血脑屏障，并募集大量的免疫细胞到中枢神经系统。自身免疫性T细胞在中枢神经系统中被再度活化、分化和增殖，产生大量的炎性反应因子，破坏神经元和少突胶质细胞，造成局部脱髓鞘和轴索损伤，最终导致神经功能障碍(Lancet.2018；391(10130):1622-1636)。
过去二十多年，随着人们对多发性硬化症发病机制认识的不断深入，研究人员开发出了多种针对该疾病特殊生理途径的药物。目前，用于治疗多发性硬化症的药物主要分为五大类：免疫调节剂、激素类、单克隆抗体、干扰素类和神经修复剂。这些药物可以缓解疾病进展，控制患者的症状，但对于修复受损神经元无效，对患者的功能型残疾无改善作用，且长期应用有严重的毒副作用。
实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimentally allergic encephalomyelitis,EAE)模型是一种经典的多发性硬化症动物模型，由髓鞘自身抗原特异性激活脑部辅助T细胞，使中枢神经系统发生炎性浸润，髓鞘脱失，其生化、免疫及病理特征都与多发性硬化症非常相似。
帕比司他是一种口服去乙酰化酶抑制剂(HDAC)，于2015年2月23日由FDA批准用于治疗多发性骨髓瘤。帕比司他作为非选择性组蛋白去乙酰化酶抑制剂(泛HDAC抑制剂)，是市场上最有效的HDAC抑制剂。帕比司他可抑制I类(HDAC 1,2,3,8)，II类(HDAC 4,5,6,7,9,10)和IV类(HDAC 11)蛋白。帕比司他主要通过表观遗传调控和抑制蛋白质代谢发挥抗肿瘤活性。帕比司他还与硼替佐米表现出细胞毒性协同作用，硼替佐米是一种同时用于治疗多发性骨髓瘤的蛋白酶体抑制剂。
本发明是经过大量动物实验研究获得的新的发现。新的发明内容主要涉及，为临床提供治疗多发性硬化症的药物。目前有关帕比司他在多发性硬化症的直接或间接治疗作用尚没有报道。
在中国专利CN 103608012A(公开号)中记载了“在癌症如骨髓增殖性肿瘤治疗中的帕比司他与鲁索利替尼的组合”。其中，涉及了帕比司他及其药学上可接受的盐类和鲁索利替尼及其药学上可接受的盐类的组合用于增生性疾病如骨髓增值性肿瘤的治疗。
在中国专利CN 106974908A(公开号)中记载了“含有hdac抑制剂和ire1抑制剂的药物组合物及用途”。其中，涉及了帕比司他和STF-083010联合作用在制备治疗食管癌、肺癌及肝癌中的应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供帕比司他在制备预防、缓解和/或治疗多发性硬化症药物中的应用。
为解决本发明的技术问题，本发明提供如下技术方案：
本发明技术方案的第一方面是提供了如式(I)所示的帕比司他在制备预防、缓解和/或治疗多发性硬化症药物中的应用，
所述多发性硬化症包括复发缓解型多发性硬化症、原发进展型多发性硬化症、继发进展型多发性硬化症和进展复发型多发性硬化症。
采用雌性C57BL/6小鼠，建立EAE模型。检测帕比司他对动物体重、疾病评分、神经运动功能评分的影响；通过悬挂实验观察动物四肢力量，观察治疗情况。应用H&E染色和LFB染色检测帕比司他对实验动物脊髓内炎性细胞浸润和髓鞘脱失的改善作用，应用Iba-1免疫荧光染色检测脊髓内小胶质细胞的数量，据此判定帕比司他在制备预防、缓解和/或治疗多发性硬化症药物中的作用。
本发明技术方案的第二方面是提供了一种药物组合物在制备预防、缓解和/或治疗多发性硬化症药物中的应用，其特征在于，所述的药物组合物含有有效剂量的如式(I)所示的帕比司他，及药用赋形剂，
其中，所述的药物组合物除含有帕比司他作为药物活性成分外，还含有其他活性成分。所述的药物组合物包括如下的剂型：溶液、混悬液、冻干粉针、乳剂、丸剂、胶囊、粉末、控制释放、持续释放制剂及微粒体给药系统的形式。所述的药用赋形剂包括淀粉、糊精、多甲基纤维素钠、硬脂酸镁、滑石粉。所述的产品选自药品、保健品。
本发明因此还涉及以本发明化合物帕比司他作为活性成份的药物组合物在预防、缓解和/或治疗多发性硬化症药物中的应用。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。
本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。
有益技术效果
1.本发明的化合物可预防、缓解和/或治疗多发性硬化症。该用途是首次公开。拓宽该化合物的临床应用领域，尤其是该类疾病在临床尚没有明显有效的药物。该化合物为临床应用提供了药物选择。
2.目前在国际和国内，本发明的化合物在预防、缓解和/或治疗多发性硬化症药物中的应用为首次公开。未见相关论文及专利发表。
3.本发明的化合物小量用药即可达到治疗及预防的效果。药物安全可靠。作为药物进行开发，具有明显的优益。
附图说明
图1.帕比司他对EAE小鼠体重的影响。本实验中，发病后EAE模型组小鼠体重明显低于正常组。而给药后，与模型组相比，给药后期的帕比司他治疗组小鼠体重显著升高。
图2.帕比司他对EAE小鼠疾病评分的影响。本实验中，发病后EAE模型组小鼠疾病评分显著高于正常对照组，而给药后，给药后期的帕比司他治疗组小鼠的疾病评分显著低于EAE模型组。
图3.帕比司他对EAE小鼠神经运动功能评分的影响。本实验中，EAE模型组小鼠的神经运动功能评分显著低于正常对照组。帕比司他给药组动物的神经运动功能评分与模型组相比显著增加。###P＜0.001vs.正常对照组，**P＜0.01vs.EAE模型组。
图4.帕比司他对EAE小鼠悬挂时间的影响。本实验中，与正常对照组相比，EAE模型组小鼠的在铁丝网上的悬挂时间显著降低，而帕比司他可以延长模型小鼠的悬挂时间。###P＜0.001vs.正常对照组，*P＜0.05vs.EAE模型组。
图5.帕比司他对EAE小鼠悬挂分级的影响。##P＜0.01，###P＜0.001vs.正常对照组，*P＜0.05，**P＜0.01vs.EAE模型组。
图6.帕比司他对EAE小鼠脊髓炎性细胞浸润的影响。本实验中，与正常对照组相比，EAE模型组小鼠脊髓炎症细胞浸润显著，而30mg/kg帕比司他可以显著降低炎性细胞的浸润面积。
图7帕比司他对EAE小鼠脊髓髓鞘脱失的影响。本实验中，LFB染色后，与正常对照组相比，EAE模型组小鼠脊髓呈现脱髓鞘病灶，面积较大。而帕比司他可以使脊髓白质区域泛白面积减小，有效地改善脱髓鞘情况。###P＜0.001vs.正常对照组，***P＜0.001vs.EAE模型组。
图8帕比司他对动物脊髓小胶质细胞数量的影响。本实验中，与正常对照组相比，EAE模型组小鼠脊髓中Iba-1阳性细胞的数量显著增加，而30mg/kg帕比司他可以显著降低Iba-1阳性细胞的数量。###P＜0.001vs.正常对照组，***P＜0.001vs.EAE模型组。
具体实施方式
下面结合本发明进一步说明帕比司他在预防、缓解和/或治疗多发性硬化症中的药理作用。
下述实施例更详细地举例说明本发明，并不是对本发明的任何限制
实施例1：帕比司他对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠行为学的改善作用
1.1实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型的建立及给药情况
实验原理
C57BL/6小鼠用MOG35-55诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimentallyallergic encephalomyelitis,EAE)模型。
实验方法
雌性C57BL/6小鼠，6-8周龄，体重18-20g，适应性喂养1周后，对其皮下注射MOG35- 55300μg并腹腔注射百日咳毒素600ng，建立实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型(EAE)。设置正常对照组，n＝10。建模11天后动物开始发病，出现不同程度的肢体瘫痪。选择出现肢体瘫痪的小鼠为实验性自身免疫性脑脊髓炎模型。
于建模第13天将雌性C57BL/6小鼠随机分为2组，EAE对照组(n＝9)和30mg/kg帕比司他给药组(n＝8)。分组后，每日一次灌胃给药。正常对照组和EAE模型组给予同体积0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)。帕比司他连续给药至建模第28天。每天测体重和疾病评分，记录动物死亡情况。于免疫后第7天、14天、21天和28天测定动物的悬挂分级，28天测定动物的神经运动功能评分以及在铁丝网上的悬挂时间。
实验结果
免疫后第11天动物开始发病，出现体重减轻、神经功能评分降低。
1.2帕比司他对EAE小鼠体重影响
实验方法
体重是反应动物能量利用平衡情况，生长情况的重要指标。本实验中每天观察并记录动物的活动状态、毛发等一般情况，每天监测动物体重。
实验结果
本实验中，发病后EAE模型组小鼠体重明显低于正常组。而给药后，与模型组相比，给药后期的帕比司他治疗组小鼠体重显著升高。结果见图1。
1.3帕比司他对EAE小鼠疾病评分的影响
实验方法
实验小鼠在建模后每天进行疾病评分，评分标准如下：0分：正常小鼠；0.5分：尾部无力；1分：尾部完全瘫痪；1.5分：一后肢无力；2分：两后肢均无力；2.5分：一后肢瘫痪，另一后肢无力；3分：两后肢均瘫痪；3.5分：部分前肢无力；4分：部分前肢瘫痪；4.5分：前肢完全瘫痪；5分：死亡。
实验结果
本实验中，发病后EAE模型组小鼠疾病评分显著高于正常对照组，而给药后，给药后期的帕比司他治疗组小鼠的疾病评分显著低于EAE模型组。结果见图2。
1.4帕比司他对EAE小鼠神经运动功能评分的影响
实验方法
建模后第28天，测定动物的神经运动功能评分，评分标准如下：
实验结果
本实验中，EAE模型组小鼠的神经运动功能评分显著低于正常对照组。帕比司他给药组动物的神经运动功能评分与模型组相比显著增加。结果见图3及表1。
表1帕比司他对MOG诱导的EAE小鼠神经运动功能的影响
Mean±SD(n＝8～10).
###P＜0.001vs.正常对照组，**P＜0.01vs.EAE模型组。
1.5帕比司他对EAE小鼠悬挂时间的影响
实验方法
建模后第28天，测定小鼠从180°铁丝网上的掉落时间，时间＞120s按120s算，每只老鼠重复三次。
实验结果
本实验中，与正常对照组相比，EAE模型组小鼠的在铁丝网上的悬挂时间显著降低，而帕比司他可以延长模型小鼠的悬挂时间。结果见图4及表2。
表2帕比司他对MOG诱导的EAE小鼠悬挂时间的影响
Mean±SD(n＝8～10).
###P＜0.001vs.正常对照组，*P＜0.05vs.EAE模型组。
1.6帕比司他对EAE小鼠悬挂分级的影响
实验方法
建模后第7、14、21和28天，将小鼠前爪悬挂于距地面30cm的平衡绳上，观察小鼠在平衡绳上的肢体悬挂状态并进行评分，分级标准如下：5分：抓住绳子并能用后肢拉，尾巴紧绕绳子；4分：抓住绳子并能用后肢拉，尾巴抬起但不能绕绳；3分：抓住绳子并能用后肢拉，尾巴下垂；2分：抬起后肢，抓住绳子但不能拉；1分：抬起后肢，但不能抓住绳子；0分：不能抬起后肢。结果见图5及表3。
实验结果
在本实验中，与正常对照组相比，EAE模型组小鼠发病之后悬挂评分显著降低，而给药之后，与EAE模型组相比，药物治疗组的悬挂评分显著增加，且呈时间依赖性。
表3帕比司他对MOG诱导的EAE小鼠悬挂分级的影响
Mean±SD(n＝8～10).##P＜0.01，###P＜0.001vs.正常对照组，
*P＜0.05，**P＜0.01vs.EAE模型组。
实施例2：帕比司他对EAE模型小鼠脊髓炎性细胞浸润及脱髓鞘的影响
2.1EAE小鼠模型的建立及给药情况
实验原理、实验方法、实验结果同实施例1.1。
2.2帕比司他对EAE小鼠脊髓内炎性细胞浸润情况的影响
实验方法
建模后第28天，每组取3只小鼠用4％水合氯醛进行麻醉。先用生理盐水进行灌流，待肝脏颜色发白，再用4％多聚甲醛灌流至动物肢体发硬。断头，取脊髓腰膨大部分置于4％多聚甲醛中固定。脊髓腰膨大部分制作石蜡切片，进行苏木素-伊红(H&E)染色，观察脊髓炎性细胞浸润情况。
实验结果
本实验中，与正常对照组相比，EAE模型组小鼠脊髓炎症细胞浸润显著，而30mg/kg帕比司他可以显著降低炎性细胞的浸润面积。结果见图6。
2.3帕比司他对EAE小鼠脊髓内髓鞘脱失情况的影响
实验方法
建模后第28天，每组取3只小鼠用4％水合氯醛进行麻醉。先用生理盐水进行灌流，待肝脏颜色发白，再用4％多聚甲醛灌流至动物肢体发硬。断头，取脊髓腰膨大部分置于4％多聚甲醛中固定。脊髓腰膨大部分制作石蜡切片，进行固蓝染色(LFB)染色，观察脊髓内髓鞘脱失情况。
实验结果
本实验中，LFB染色后，与正常对照组相比，EAE模型组小鼠脊髓呈现脱髓鞘病灶，面积较大。而帕比司他可以使脊髓白质区域泛白面积减小，有效地改善脱髓鞘情况。结果见图7和表4。
表4帕比司他对MOG诱导的EAE小鼠脊髓脱髓鞘情况的影响
Mean±SD(n＝3).
###P＜0.001vs.正常对照组，***P＜0.001vs.EAE模型组。
2.4帕比司他对EAE小鼠脊髓内小胶质细胞增殖的影响
实验方法
建模后第28天，每组取3只小鼠用4％水合氯醛进行麻醉。先用生理盐水进行灌流，待肝脏颜色发白，再用4％多聚甲醛灌流至动物肢体发硬。断头，取脊髓腰膨大部分置于4％多聚甲醛中固定。脊髓腰膨大部分制作石蜡切片，进行免疫荧光染色，观察脊髓内Iba-1阳性细胞的数量。
实验结果
本实验中，与正常对照组相比，EAE模型组小鼠脊髓中Iba-1阳性细胞的数量显著增加，而30mg/kg帕比司他可以显著降低Iba-1阳性细胞的数量。结果见图8和表5。
表5帕比司他对MOG诱导的EAE小鼠脊髓小胶质细胞增殖的影响
Mean±SD(n＝3).
###P＜0.001vs.正常对照组，***P＜0.001vs.EAE模型组。

Claims (2)

1.如式 （I）所示的帕比司他在制备预防、缓解和/或治疗多发性硬化症药物中的应用；
（I）。
2.根据权利要求 1 的应用，其特征在于，所述多发性硬化症选自复发缓解型多发性硬化症、原发进展型多发性硬化症、继发进展型多发性硬化症和进展复发型多发性硬化症。
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