CN117442738A - 一种联合用药物组合物在制备预防或治疗t细胞淋巴瘤的药物中的应用 - Google Patents
一种联合用药物组合物在制备预防或治疗t细胞淋巴瘤的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种联合用药物组合物在制备预防或治疗T细胞淋巴瘤的药物中的应用，所述联合用药物组合物包括HDAC抑制剂和PI3K抑制剂。本发明开发了一种T细胞淋巴瘤的新的预防或治疗方式，是将HDAC抑制剂和PI3K抑制剂进行联用，本发明研究发现HDAC抑制剂联合PI3K抑制剂在抑制T细胞淋巴瘤时不仅可以降低HDAC抑制剂或PI3K抑制剂的用药剂量，提高用药安全性，还具有比单一使用HDAC抑制剂或PI3K抑制剂更显著地抑制T细胞淋巴瘤的效果，达到协同促进的效果。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种T细胞淋巴瘤的新的预防或治疗方式，具体涉及一种联合用药物组合物在制备预防或治疗T细胞淋巴瘤的药物中的应用。
背景技术
T细胞淋巴瘤约占非霍奇金淋巴瘤10％-15％，在我国比例更高。它是一种由T淋巴细胞恶性转化引起的恶性造血肿瘤。其T细胞的异常增殖、分化紊乱和细胞凋亡抑制与T-ALL的发病机制和复发有关。2008年世界卫生组织(WHO)将T细胞淋巴瘤分为不同的病理亚型：T细胞、NK细胞淋巴瘤/白血病。
目前治疗T细胞淋巴瘤的方法是CHOP方案，其总有效率(ORR)为60％-70％，但5年生存率(OS)仅为25％-35％，且无进展生存率(PFS)更低。后又以CHOP方案为基础衍生出许多治疗方案，如CHOP治疗后进行大剂量化疗和干细胞移植巩固。然而，大多数患者要么没有完全缓解(CR)，要么在治疗结束后复发，对于患者生存状况改善甚微。即使了解了一些T细胞淋巴瘤背后的病因，针对肿瘤发生的初始触发因素的治疗也不能改善结果，因此，需要新的治疗方法。
皮肤T细胞淋巴瘤(Cutaneous T-cell lymphoma，CTCL)是原发于皮肤的，由T淋巴细胞克隆性增生造成的疾病，由一组临床表现、组织学特征、及病程预后各不相同的疾病组成。皮肤T细胞淋巴瘤占所有原发性皮肤淋巴瘤的75％-80％，蕈样肉芽肿(MF)和塞泽里综合征(SS)是皮肤T细胞淋巴瘤最主要的2种亚型。皮肤T细胞淋巴瘤的常规诊断是以临床表现和组织病理检查为基础。但因其疾病具有多样性及复杂性，特别是早期病例及罕见病例，临床表现多种多样，病理上常需要反复的活组织检查，有时要待病情进一步发展才能确诊。因此CTCL与良性淋巴增殖性疾病或皮肤炎症性疾病之间难以鉴别。
急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia，ALL)是由B细胞或T细胞来源的淋巴母细胞的恶性克隆扩增形成的疾病。急性成淋巴细胞性白血病是15岁以下病人最常见的肿瘤，比AML发病高5倍，占这个年龄组所有肿瘤的1/4和白血病的76％。虽然大多数急性淋巴细胞白血病是B谱系，但T-ALL占儿童病例的10-15％和成人病例的25％。急性T淋巴细胞白血病具有高度异质性，其治疗方案主要包括诱导治疗、支持治疗、化疗、及靶向治疗等。化疗是治疗急性T淋巴细胞白血病的主要治疗方案，能够清除体内的残留白血病细胞，防止白血病细胞的进一步繁殖，适用于高危、难治的急性T淋巴细胞白血病患者。解决T-ALL一直很困难，因为与B-ALL不同，T-ALL患者不能根据复发性细胞遗传学异常进行风险分层和治疗干预。
HDAC抑制剂以HDAC为靶标，通过抑制HDAC活性，调节组蛋白的乙酰化状态，促进抗肿瘤转录因子的转录和表达，调控相关信号通路，发挥抗肿瘤的生物效应。研究显示，HDAC抑制剂能通过促进细胞分化，阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是一种参与细胞内信号转导的脂质激酶，分为三类，I类PI3K包括四种不同的异构体，存在于人类细胞中：α、β、δ和γ。PI3K-δ和PI3K-γ在白细胞中优先表达，在正常白细胞功能中起重要作用。PI3K-δ和PI3K-γ是适应性和先天免疫系统利用的信号转导级联的近端，包括B细胞和T细胞受体、生长因子受体以及趋化因子和细胞因子受体途径，这些亚型也有助于血液系统恶性肿瘤的发展和维持。并且PI3K-δ和PI3K-β介导的多种途径通过肿瘤细胞自主作用也有促进恶性造血细胞的生存、增殖和分化的作用。
PI3K抑制剂能否用于T细胞淋巴瘤的预防和治疗，尤其是与HDAC抑制剂联用能否用于T细胞淋巴瘤的预防和治疗，以及对T细胞淋巴瘤相关细胞株的作用机制尚不清楚。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种T细胞淋巴瘤的新的预防或治疗方式，具体涉及一种联合用药物组合物在制备预防或治疗T细胞淋巴瘤的药物中的应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种联合用药物组合物在制备预防或治疗T细胞淋巴瘤的药物中的应用，所述联合用药物组合物包括HDAC抑制剂和PI3K抑制剂。
本发明开发了一种T细胞淋巴瘤的新的预防或治疗方式，是将HDAC抑制剂和PI3K抑制剂进行联用，本发明研究发现HDAC抑制剂联合PI3K抑制剂在抑制T细胞淋巴瘤时不仅可以降低HDAC抑制剂或PI3K抑制剂的用药剂量，提高用药安全性，还具有比单一使用HDAC抑制剂或PI3K抑制剂更显著地抑制T细胞淋巴瘤的效果，达到协同促进的效果。
本发明首先通过T细胞淋巴瘤细胞株(具体而言为急性T细胞白血病细胞株Jurkat细胞、Molt4细胞和皮肤T细胞淋巴瘤细胞株Hut-78细胞)，证明该联用方式能够显著抑制T细胞淋巴瘤细胞增殖以及诱导其发生凋亡；通过线粒体膜电位检测证明其能够诱导线粒体膜电位增加引起肤T细胞淋巴瘤(CTCL)和急性T细胞白血病(T-ALL)细胞发生凋亡；通过细胞Western blot实验证明其能够抑制皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)和急性T细胞白血病(T-ALL)细胞的Caspase3和ATF4的表达；通过CDX小鼠模型证明该联用方式能够抑制小鼠成瘤进程，改善小鼠存活率。本发明为T细胞淋巴瘤的改善或治疗提供了有效的药物联用策略，具有十分显著的意义。
优选地，所述HDAC抑制剂选自西达本胺或其在药学上可接受的盐、异构体、溶剂化物、代谢产物中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述PI3K抑制剂具有PI3K亚基的抑制活性，选自度维利塞或其在药学上可接受的盐、异构体、溶剂化物、代谢产物中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述T细胞淋巴瘤包括皮肤T细胞淋巴瘤和/或急性T细胞白血病。
优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
优选地，上述联合用药物组合物可单独给药也可以与辅料搭配做成适当的剂型进行给药，所述药学上可接受的辅料包括载体、稀释剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述联合用药物组合物为单一的复方制剂或两种单独的制剂的组合。
优选地，所述联合用药物组合物为两种单独的制剂的组合，两种单独的制剂同时施用或依次施用。
上述联合用药物组合物可以为单一的复方制剂形式，也可以为两种单独的制剂的组合；当为两种单独的制剂的组合时，其用药方式可以为同时施用，也可以为交叉施用或依次施用。
优选地，所述制剂为药剂学上可接受的任意一种剂型，例如片剂、散剂、混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、灌肠剂、乳剂等。
第二方面，本发明提供一种预防或治疗T细胞淋巴瘤的联合用药物组合物，所述联合用药物组合物包括西达本胺或其药学上可接受的盐，以及度维利塞或其药学上可接受的盐。
本发明开发了一种新的药物联用方式，是将HDAC抑制剂和PI3K抑制剂进行联用，该联合用药物组合物具有优异的抑制T细胞淋巴瘤的效果，本发明研究发现HDAC抑制剂联合PI3K抑制剂在抑制T细胞淋巴瘤时不仅可以降低HDAC抑制剂或PI3K抑制剂的用药剂量，提高用药安全性，还具有比单一使用HDAC抑制剂或PI3K抑制剂更显著地抑制T细胞淋巴瘤的效果，达到协同促进的效果。
优选地，所述T细胞淋巴瘤包括皮肤T细胞淋巴瘤和/或急性T细胞白血病。
优选地，所述联合用药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
优选地，所述联合用药物组合物可单独给药也可以与辅料搭配做成适当的剂型进行给药，所述药学上可接受的辅料包括载体、稀释剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述联合用药物组合物为单一的复方制剂或两种单独的制剂的组合。
优选地，所述联合用药物组合物为两种单独的制剂的组合，两种单独的制剂同时施用或依次施用。
所述联合用药物组合物可以为单一的复方制剂形式，也可以为两种单独的制剂的组合；当为两种单独的制剂的组合时，其用药方式可以为同时施用，也可以为交叉施用或依次施用。
优选地，所述制剂为药剂学上可接受的任意一种剂型。
第三方面，本发明提供根据第二方面所述的联合用药物组合物在制备T细胞淋巴瘤细胞的增殖抑制剂或T细胞淋巴瘤细胞的凋亡促进剂中的应用。
根据本发明的研究结果，所述联合用药物组合物具有显著地抑制T细胞淋巴瘤细胞增殖和诱导T细胞淋巴瘤细胞凋亡的作用，因此，该结果表明所述联合用药物组合物可以作为一种体外实验用试剂用于科研领域，例如研究T细胞淋巴瘤细胞生长、凋亡和代谢机制或行为，筛选治疗T细胞淋巴瘤的药物等。本发明所要求保护的增殖抑制剂或凋亡促进剂并不是用于消除病因或病灶，即是一种以非治疗为目的地在制备T细胞淋巴瘤细胞的增殖抑制剂或T细胞淋巴瘤细胞的凋亡促进剂中的应用。
优选地，所述T细胞淋巴瘤细胞包括Jurkat细胞、Molt4细胞或Hut-78细胞中的任意一种或至少两种的组合。
第四方面，本发明提供根据第二方面所述的联合用药物组合物在制备T细胞淋巴瘤细胞HDAC家族表达抑制剂中的应用。
根据本发明的研究结果，所述联合用药物组合物具有显著地抑制T细胞淋巴瘤细胞HDAC家族表达的作用，因此，该结果表明所述联合用药物组合物可以作为一种体外实验用试剂用于科研领域，例如研究T细胞淋巴瘤细胞生长、凋亡和代谢机制或行为，筛选治疗T细胞淋巴瘤的药物等。本发明所要求保护的HDAC家族表达抑制剂并不是用于消除病因或病灶，即是一种以非治疗为目的地在制备T细胞淋巴瘤细胞HDAC家族表达抑制剂中的应用。
优选地，所述T细胞淋巴瘤细胞包括Jurkat细胞、Molt4细胞或Hut-78细胞中的任意一种或至少两种的组合。
第五方面，本发明提供根据第二方面所述的联合用药物组合物在制备T细胞淋巴瘤细胞ATF4表达抑制剂中的应用。
根据本发明的研究结果，所述联合用药物组合物具有显著地抑制T细胞淋巴瘤细胞ATF4表达的作用，因此，该结果表明所述联合用药物组合物可以作为一种体外实验用试剂用于科研领域，例如研究T细胞淋巴瘤细胞生长、凋亡和代谢机制或行为，筛选治疗T细胞淋巴瘤的药物等。本发明所要求保护的ATF4表达抑制剂并不是用于消除病因或病灶，即是一种以非治疗为目的地在制备T细胞淋巴瘤细胞ATF4表达抑制剂中的应用。
优选地，所述T细胞淋巴瘤细胞包括Jurkat细胞、Molt4细胞或Hut-78细胞中的任意一种或至少两种的组合。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明开发了一种T细胞淋巴瘤的新的预防或治疗方式，是将HDAC抑制剂和PI3K抑制剂进行联用，本发明研究发现HDAC抑制剂联合PI3K抑制剂在抑制T细胞淋巴瘤时不仅可以降低HDAC抑制剂或PI3K抑制剂的用药剂量，提高用药安全性，还具有比单一使用HDAC抑制剂或PI3K抑制剂更显著地抑制T细胞淋巴瘤的效果，达到协同促进的效果。
本发明首先通过T细胞淋巴瘤细胞株(具体而言为急性T细胞白血病细胞株Jurkat细胞、Molt4细胞和皮肤T细胞淋巴瘤细胞株Hut-78细胞)，证明该联用方式能够显著抑制T细胞淋巴瘤细胞增殖以及诱导其发生凋亡；通过线粒体膜电位检测证明其能够诱导线粒体膜电位增加引起肤T细胞淋巴瘤(CTCL)和急性T细胞白血病(T-ALL)细胞发生凋亡；通过细胞Western blot实验证明其能够抑制皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)和急性T细胞白血病(T-ALL)细胞的Caspase3和ATF4的表达；通过CDX小鼠模型证明该联用方式能够抑制小鼠成瘤进程，改善小鼠存活率。本发明为T细胞淋巴瘤的改善或治疗提供了有效的药物联用策略，具有十分显著的意义。
附图说明
图1A是西达本胺联合度维利塞处理72h后对于Jurkat细胞增殖的抑制率结果图；
图1B是西达本胺联合度维利塞处理72h后对于Molt4细胞增殖的抑制率结果图；
图1C是西达本胺联合度维利塞处理72h后对于Hut-78细胞增殖的抑制率结果图；
图2A是西达本胺联合度维利塞处理72h后对于Jurkat细胞凋亡水平的流式检测结果图；
图2B是西达本胺联合度维利塞处理72h后对于Molt4细胞凋亡水平的流式检测结果图；
图2C是西达本胺联合度维利塞处理72h后对于Hut-78细胞凋亡水平的流式检测结果图；
图3A是西达本胺联合度维利塞处理72h后对于Jurkat细胞的凋亡率统计结果图；
图3B是西达本胺联合度维利塞处理72h后对于Molt4细胞的凋亡率统计结果图；
图3C是西达本胺联合度维利塞处理72h后对于Hut-78细胞的凋亡率统计结果图；
图4A是施加凋亡抑制剂Z-VAD后西达本胺联合度维利塞处理48h后对于Jurkat细胞凋亡水平的流式检测结果图；
图4B是施加凋亡抑制剂Z-VAD后西达本胺联合度维利塞处理48h后对于Molt4细胞凋亡水平的流式检测结果图；
图4C是施加凋亡抑制剂Z-VAD后西达本胺联合度维利塞处理48h后对于Hut-78细胞凋亡水平的流式检测结果图；
图5A是施加凋亡抑制剂Z-VAD后西达本胺联合度维利塞处理48h后对于Jurkat细胞的凋亡率统计结果图；
图5B是施加凋亡抑制剂Z-VAD后西达本胺联合度维利塞处理48h后对于Molt4细胞的凋亡率统计结果图；
图5C是施加凋亡抑制剂Z-VAD后西达本胺联合度维利塞处理48h后对于Hut-78细胞的凋亡率统计结果图；
图6A是西达本胺联合度维利塞处理48h后对于Jurkat细胞线粒体膜电位的流式检测结果图；
图6B是西达本胺联合度维利塞处理48h后对于Molt4细胞线粒体膜电位的流式检测结果图；
图6C是西达本胺联合度维利塞处理48h后对于Hut-78细胞线粒体膜电位的流式检测结果图；
图7A是西达本胺联合度维利塞处理48h后对于Jurkat细胞线粒体膜电位的检测结果统计图；
图7B是西达本胺联合度维利塞处理48h后对于Molt4细胞线粒体膜电位的检测结果统计图；
图7C是西达本胺联合度维利塞处理48h后对于Hut-78细胞线粒体膜电位的检测结果统计图；
图8A是西达本胺联合度维利塞处理48h后对于Jurkat细胞周期的流式检测结果图；
图8B是西达本胺联合度维利塞处理48h后对于Molt4细胞周期的流式检测结果图；
图9A是西达本胺联合度维利塞处理48h后对于Jurkat细胞周期的检测结果统计图；
图9B是西达本胺联合度维利塞处理48h后对于Molt4细胞周期的检测结果统计图；
图10是西达本胺联合度维利塞联合处理Jurkat/Molt4/Hut-78细胞48h后的凋亡通路/组蛋白去乙酰酶的蛋白表达水平的Western blot结果图；
图11A是西达本胺联合度维利塞处理CDX小鼠模型皮下瘤解剖外观的结果图；
图11B是西达本胺联合度维利塞处理CDX小鼠模型皮下瘤最终重量的结果图；
图11C是西达本胺联合度维利塞处理CDX小鼠模型皮下瘤最终体积的结果图；
图11D是西达本胺联合度维利塞处理CDX小鼠模型皮下瘤肿瘤体积变化的结果图；
图11E是西达本胺联合度维利塞处理CDX小鼠模型小鼠体重变化的结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。各实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另有说明，本说明书中使用的全部专业术语和科学用语的含义均与本发明所属技术领域的技术人员一般理解的含义相同。但如有冲突，以包含定义的本说明书为准。
下述实施例所涉及的药物西达本胺由深圳微芯生物公司提供；药物度维利塞由上海陶术生物科技有限公司提供；凋亡抑制剂Z-VAD由美国APExBIO公司提供。
T-ALL细胞株(Jurkat细胞、Molt4细胞)和CTCL细胞株(Hut-78细胞)由厦门大学医学院血液学研究所提供。
CB-17SCID小鼠采购自厦门大学实验动物中心，并且由实验动物中心饲养。
实施例1
联合施药对T-ALL细胞株和CTCL细胞株增殖的抑制作用
操作方法为：取处于对数生长期的数量为5×104的T-ALL细胞株(包括Jurkat、Molt4)和CTCL细胞株(Hut-78细胞株)接种于96孔板。设置空白对照组、西达本胺单药组、度维利塞单药组、西达本胺联合度维利塞施药组。
西达本胺单药组的施药浓度分别为①0.1nM、②0.2nM、③0.4nM、④0.8nM和⑤1.6nM；度维利塞单药组的施药浓度分别为①1nM、②2nM、③4nM、④8nM和⑤12nM；西达本胺联合度维利塞施药组的施药浓度分别为①0.1nM+1nM、②0.2nM+2nM、③0.4nM+4nM、④0.8nM+8nM、⑤1.6nM+12nM(前者为西达本胺，后者为度维利塞)；其中空白对照组细胞施加相同体积的DMSO。将DMSO或者药物施加进96孔细胞培养板中的细胞，轻轻振荡混匀。将其静置于细胞培养箱(Thermo)中培养72h，再用CCK8试剂盒(MCE，上海)检测细胞的增殖水平。
实验结果：施药后所得的细胞活力结果如图1A(Jurkat)、图1B(Molt4)、图1C(Hut-78)所示。通过图1A、图1B、图1C显示的结果可以得知，在T-ALL的两种细胞株和CTCL细胞株中，相比于西达本胺单药组(如1.6nM)和度维利塞(如12nM)单药组，西达本胺联合度维利塞施药组(如0.8nM+8nM)对细胞增殖水平有更好的抑制效果。同时计算西达本胺与度维利塞的联用指数(CI)，结果显示，0.8nM+8nM联用方式下：CI＝0.21624(Jurkat)、CI＝0.49562(Molt4)、CI＝0.35413(Hut-78)；1.6nM+12nM联用方式下：CI＝0.11840(Jurkat)、CI＝0.28901(Molt4)、CI＝0.15518(Hut-78)。
实施例2
联合施药对T-ALL细胞株和CTCL细胞株的诱导凋亡作用
操作方法为：取处于对数生长期的数量为1.25×105的T-ALL细胞株(包括Jurkat、Molt4)和CTCL细胞株(Hut-78细胞株)接种于24孔板。设置空白对照组、西达本胺单药组、度维利塞单药组、西达本胺联合度维利塞施药组。
西达本胺单药组的施药浓度分别为①0.1nM、②0.2nM、③0.4nM、④0.8nM和⑤1.6nM；度维利塞单药组的施药浓度分别为①1nM、②2nM、③4nM、④8nM和⑤12nM；西达本胺联合度维利塞施药组的施药浓度分别为①0.1nM+1nM、②0.2nM+2nM、③0.4nM+4nM、④0.8nM+8nM、⑤1.6nM+12nM(前者为西达本胺，后者为度维利塞)；其中空白对照组细胞施加相同体积的DMSO。将DMSO或者药物施加进24孔细胞培养板中的细胞，轻轻振荡混匀。将其静置于细胞培养箱(Thermo)中培养72h。培养72h后，将细胞300g离心5min，用Annexin V/PI(Thermofisher，USA)对细胞进行染色，并用流式法对细胞凋亡水平进行检测，并对细胞凋亡率进行统计。
实验结果：流式法对细胞凋亡水平检测的结果如图2A(Jurkat)、图2B(Molt4)、图2C(Hut-78)所示；对细胞凋亡率的统计结果如图3A(Jurkat)、图3B(Molt4)、图3C(Hut-78)所示。通过上图显示的结果可以得知，在T-ALL的两种细胞株和CTCL细胞株中，相比于西达本胺单药组(如1.6nM)和度维利塞(如12nM)单药组，西达本胺联合度维利塞施药组(如0.8nM+8nM)可以更好地促进细胞凋亡，且凋亡的效果随着药物浓度的增加而逐渐上升。
实施例3
凋亡抑制剂对于联合施药后的T-ALL细胞株和CTCL细胞株的回补作用
操作方法为：取处于对数生长期的数量为1.25×105的T-ALL细胞株(包括Jurkat、Molt4)和CTCL细胞株(Hut-78细胞株)接种于24孔板。设置两大组：对照组与施加凋亡抑制剂Z-VAD组；每大组分为四小组，分别为空白对照组、西达本胺单药组、度维利塞单药组、西达本胺联合度维利塞施药组。
VAD组的施加浓度为1:500；西达本胺单药组的施药浓度为1.6nM；度维利塞单药组的施药浓度为12nM；西达本胺联合度维利塞施药组的施药浓度分别为1.6nM+12nM(前者为西达本胺，后者为度维利塞)；其中空白对照组细胞施加相同体积的DMSO。将DMSO或者药物施加进24孔细胞培养板中的细胞，轻轻振荡混匀。将其静置于细胞培养箱(Thermo)中培养48h。培养48h后，将细胞300g离心5min，用Annexin V/PI(Thermofisher，USA)对细胞进行染色，并用流式法对细胞凋亡水平进行检测，并对细胞凋亡率进行统计。
实验结果：流式法对细胞凋亡水平检测的结果如图4A(Jurkat)、图4B(Molt4)、图4C(Hut-78)所示；对细胞凋亡率的统计结果如图5A(Jurkat)、图5B(Molt4)、图5C(Hut-78)所示。通过上图显示的结果可以得知，在T-ALL的两种细胞株和CTCL细胞株中，Z-VAD组的细胞凋亡率明显低于未施加Z-VAD组，证明了西达本胺联合度维利塞对于细胞的促进凋亡作用。
实施例4
联合施药对T-ALL细胞株和CTCL细胞株的线粒体膜电位作用
操作方法为：取处于对数生长期的数量为1.25×105的T-ALL细胞株(包括Jurkat、Molt4)和CTCL细胞株(Hut-78细胞株)接种于24孔板。设置空白对照组、西达本胺单药组、度维利塞单药组、西达本胺联合度维利塞施药组。
西达本胺单药组的施药浓度为1.6nM；度维利塞单药组的施药浓度为12nM；西达本胺联合度维利塞施药组的施药浓度分别为1.6nM+12nM(前者为西达本胺，后者为度维利塞)；其中空白对照组细胞施加相同体积的DMSO。将DMSO或者药物施加进24孔细胞培养板中的细胞，轻轻振荡混匀。将其静置于细胞培养箱(Thermo)中培养48h。培养48h后，将细胞300g离心5min，用JC-1试剂盒对细胞进行染色，并用流式法对细胞凋亡水平进行检测，并对细胞凋亡率进行统计。
实验结果：流式法对细胞线粒体膜电位变化的检测结果如图6A(Jurkat)、图6B(Molt4)、图6C(Hut-78)所示；对细胞凋亡率的统计结果如图7A(Jurkat)、图7B(Molt4)、图7C(Hut-78)所示。通过上图显示的结果可以得知，在T-ALL的两种细胞株和CTCL细胞株中，相比于西达本胺单药组和度维利塞单药组，西达本胺联合度维利塞施药组可以更好地使细胞线粒体膜电位去极化，且作用效果远远大于单药组。
实施例5
联合施药对T-ALL细胞株的周期作用
操作方法为：取处于对数生长期的数量为5×105的T-ALL细胞株(包括Jurkat、Molt4细胞株)接种于24孔板。设置空白对照组、西达本胺单药组、度维利塞单药组、西达本胺联合度维利塞施药组。
西达本胺单药组的施药浓度为0.4nM；度维利塞单药组的施药浓度为4nM；西达本胺联合度维利塞施药组的施药浓度分别为0.4nM+4nM(前者为西达本胺，后者为度维利塞)；其中空白对照组细胞施加相同体积的DMSO。将DMSO或者药物施加进24孔细胞培养板中的细胞，轻轻振荡混匀。将其静置于细胞培养箱(Thermo)中培养48h。培养48h后，加入Edu(1:1000)，培养箱中孵育1h。将细胞300g离心5min，加入1mL福尔马林固定15min。BSA洗一次后，用0.3％的TritonX-100通透15min。BSA洗一次后，Click染色液染色30min。BSA洗一次后，PI染色30min。用流式法对细胞周期的改变进行检测，并对细胞周期的分布率进行统计。
实验结果：流式法对细胞周期的改变的检测结果如图8A(Jurkat)、图8B(Molt4)所示；对细胞周期的分布率的统计结果如图9A(Jurkat)、图9B(Molt4)所示。通过上图的显示的结果可以得知，在T-ALL的细胞株中，相比于西达本胺单药组和度维利塞单药组，西达本胺联合度维利塞施药组可以更好地使细胞周期停滞在G1期，并且减少处于S期的细胞的比例，二者协同的作用效果远远大于单药组。
实施例6
联合施药对HDAC等蛋白表达的抑制作用
操作方法为：取处于对数生长期的数量为1×106的T-ALL细胞株(包括Jurkat、Molt4)和CTCL细胞株(Hut-78细胞株)接种于12孔板。设置空白对照组、西达本胺单药组、度维利塞单药组、西达本胺联合度维利塞施药组。
西达本胺单药组的施药浓度为0.8nM；度维利塞单药组的施药浓度为8nM；西达本胺联合度维利塞施药组的施药浓度分别为0.8nM+8nM(前者为西达本胺，后者为度维利塞)；其中空白对照组细胞施加相同体积的DMSO。将DMSO或者药物施加进24孔细胞培养板中的细胞，轻轻振荡混匀。将其静置于细胞培养箱(Thermo)中培养48h。然后收取细胞g＝300离心5min，用PBS洗一次。加入150μL RIPA裂解液(Thermo，USA)，4℃裂解1h，对细胞内的总蛋白进行提取。用提取所得的蛋白进行Western blot实验，以检测组蛋白去乙酰酶的蛋白、与凋亡相关的蛋白等蛋白质的表达水平是否改变。
实验结果：图10为Western blot的检测结果。由图10可以得到西达本胺联合度维利塞，可以抑制T-ALL细胞株或CTCL细胞株中组蛋白去乙酰酶的蛋白，以及凋亡相关蛋白的表达，且比西达本胺单药组或度维利塞单药组具有更显著的抑制效果。
实施例7
联合施药对T-ALL成瘤进程的影响
具体操作方法如下：
(1)将CB-17SCID小鼠(体重15.8-17.3g)分为四组，每组4只，分别为空白对照组、西达本胺单药组、度维利塞单药组、西达本胺联合度维利塞施药组。其中，西达本胺溶解在0.5％的羧甲基纤维素钠PBS溶液中，配制为悬浊液；度维利塞溶解在混合溶液(10％DMSO、40％PEG300、5％Tween80、45％PBS)中，配制为悬浊液，已备灌胃使用。
(2)构建CDX小鼠模型
取处于对数生长期的2×107个Molt4细胞，通过皮下注射的方式打入到CB-17SCID小鼠中形成皮下瘤，建立CDX小鼠模型。
(3)在注射Molt4细胞的7天后开始以灌胃的方式给药，西达本胺的剂量为5mg/kg/天，度维利塞剂量为10mg/kg/天。连续给药14天，通过测量皮下肿瘤的大小来实时检测小鼠肿瘤的形成进展，将给药起始日记为第1天，14天后取材。
实验结果：各组小鼠的肿瘤解剖外观如图11A所示；各组小鼠肿瘤最终重量统计结果如图11B所示；肿瘤最终体积统计结果如图11C所示；肿瘤体积变化情况如图11D所示；小鼠体重变化情况如图11E所示。由以上结果可以得到，西达本胺联合度维利塞相较于单用西达本胺或单用度维利塞可以更好地抑制T-ALL的CDX模型的成瘤进程。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的技术方案，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种联合用药物组合物在制备预防或治疗T细胞淋巴瘤的药物中的应用，其特征在于，所述联合用药物组合物包括HDAC抑制剂和PI3K抑制剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述HDAC抑制剂选自西达本胺或其在药学上可接受的盐、异构体、溶剂化物、代谢产物中的任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PI3K抑制剂具有PI3K亚基的抑制活性，选自度维利塞或其在药学上可接受的盐、异构体、溶剂化物、代谢产物中的任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述T细胞淋巴瘤包括皮肤T细胞淋巴瘤和/或急性T细胞白血病；
优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料；
优选地，所述药学上可接受的辅料包括载体、稀释剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述联合用药物组合物为单一的复方制剂或两种单独的制剂的组合；
优选地，所述联合用药物组合物为两种单独的制剂的组合，两种单独的制剂同时施用或依次施用；
优选地，所述制剂为药剂学上可接受的任意一种剂型。
6.一种预防或治疗T细胞淋巴瘤的联合用药物组合物，其特征在于，所述联合用药物组合物包括西达本胺或其药学上可接受的盐，以及度维利塞或其药学上可接受的盐。
7.根据权利要求6所述的联合用药物组合物，其特征在于，所述T细胞淋巴瘤包括皮肤T细胞淋巴瘤和/或急性T细胞白血病；
优选地，所述联合用药物组合物还包括药学上可接受的辅料；
优选地，所述药学上可接受的辅料包括载体、稀释剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述联合用药物组合物为单一的复方制剂或两种单独的制剂的组合；
优选地，所述联合用药物组合物为两种单独的制剂的组合，两种单独的制剂同时施用或依次施用；
优选地，所述制剂为药剂学上可接受的任意一种剂型。
8.根据权利要求6或7所述的联合用药物组合物在制备T细胞淋巴瘤细胞的增殖抑制剂或T细胞淋巴瘤细胞的凋亡促进剂中的应用；
优选地，所述T细胞淋巴瘤细胞包括Jurkat细胞、Molt4细胞或Hut-78细胞中的任意一种或至少两种的组合。
9.根据权利要求6或7所述的联合用药物组合物在制备T细胞淋巴瘤细胞HDAC家族表达抑制剂中的应用；
优选地，所述T细胞淋巴瘤细胞包括Jurkat细胞、Molt4细胞或Hut-78细胞中的任意一种或至少两种的组合。
10.根据权利要求6或7所述的联合用药物组合物在制备T细胞淋巴瘤细胞ATF4表达抑制剂中的应用；
优选地，所述T细胞淋巴瘤细胞包括Jurkat细胞、Molt4细胞或Hut-78细胞中的任意一种或至少两种的组合。
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