CN112451522A - β3-肾上腺素能受体激动剂在制备治疗脑损伤的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及β3‑肾上腺素能受体激动剂在制备治疗或预防脑损伤的药物中的应用。本发明通过研究发现，β3‑肾上腺素能受体激动剂能够使脑出血模型小鼠脑内的Ly6C^low单核细胞和表达替代激活标志物(CD206和PD‑L2)的巨噬细胞增加，脑组织浸润的中性粒细胞和淋巴细胞减少；促进Ly6C^low单核细胞髓内造血，促进Ly6C^low单核细胞和巨噬细胞表达IL‑10，有效可抑制脑出血后局灶性脑部炎症和水肿，对于治疗脑出血后的脑损伤具有重要的临床应用价值。本发明还公开了一种药物组合物，所述药物组合物包括β3‑肾上腺素能受体激动剂，可以作为脑出血引发的脑损伤的治疗药物。

Description

β3-肾上腺素能受体激动剂在制备治疗脑损伤的药物中的 应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及β3-肾上腺素能受体激动剂在制备治疗 或预防脑损伤的药物中的应用，特别涉及米拉贝隆在制备治疗或预防脑损伤 的药物中的应用。

背景技术

脑出血(intracranial hemorrhage,ICH)是指非外伤性脑实质内血管破裂 引起的出血，占全部脑卒中的20％～30％，急性期病死率为30％～40％。在 我国，脑出血发病率为60～80/(10万人·年)，患病率为112/10万人，该数 据远高于西方国家和其他亚洲国家。有报道，脑出血后1个月的死亡率为 40％，幸存者中多数留有不同程度的运动障碍、认知障碍、言语吞咽障碍、 偏瘫等后遗症。另有资料显示，脑出血幸存者复发率为20％。可见，脑出血 具备“高发病率、高复发率、高致残率及高死亡率”的特点。

目前，普遍认为脑出血既可以由血肿的机械作用引起原发性脑损伤，也 可以是脑出血后的继发性脑损伤。脑出血后血液成分包括红细胞、白细胞、 巨噬细胞和血浆蛋白(如凝血酶)立即进入脑实质，导致炎症反应。脑出血 后炎症反应导致组织损伤、血-脑屏障破坏和大量神经细胞死亡，是引起脑 出血后继发性脑损伤进而导致神经功能恶化的一个主要因素。脑水肿是脑出 血病情加重的主要原因之一，减轻脑水肿是脑出血的治疗关键。随着研究的 深入，认为炎症因子在脑出血后脑水肿形成过程中扮演了重要角色。

目前，除了开颅手术作为重症患者的救命措施外，对于脑出血还缺少有 效的外科或公认的药物治疗方法。因此，进一步研究脑出血的病理机制，开 发可供临床选择的脑出血后脑损伤的治疗药物，对于改善患者预后，提高患 者生存率和生存质量，具有重要意义。

发明内容

发明要解决的问题

鉴于现有技术中存在的技术问题，例如，对于脑出血引发的原发性脑损 伤和继发性脑损伤，缺少有效治疗手段的问题。为此，本发明提供了β3-肾 上腺素能受体激动剂在制备治疗或预防脑损伤的药物中的应用。

用于解决问题的方案

(1)β3-肾上腺素能受体激动剂在制备治疗或预防脑损伤的药物中的应 用。

(2)根据(1)所述的应用，其中，所述脑损伤为由脑出血引发的脑损 伤；可选地，所述脑损伤包括由脑出血引发的原发性脑损伤和/或继发性脑损 伤。

(3)根据权利要求(1)或(2)所述的应用，其中，所述脑损伤包括 由脑出血引发的脑水肿、血肿扩大、血肿周围损伤、脑内炎症反应和/或神经 功能损伤。

(4)根据(1)-(3)任一项所述的应用，其中，所述β3-肾上腺素能 受体激动剂为米拉贝隆。

(5)根据(1)-(4)任一项所述的应用，其中，所述药物还包括一种 或多种药学上可接受的载体；可选地，所述药学上可接受的载体包括溶剂、 增溶剂、助溶剂、乳化剂、矫味剂、矫嗅剂、着色剂、粘合剂、崩解剂、填 充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、pH调节剂、稳定剂、稀释剂、助 流剂、表面活性剂和/或防腐剂。

(6)根据(1)-(5)任一项所述的应用，其中，所述药物还包括一种 或多种脑损伤的治疗药物。

(7)根据(1)-(6)任一项所述的应用，其通过包括以下各项在内的 途径中的一种施用所述药物：静脉内施用、腹膜内施用、冠状动脉内施用、 动脉内施用、皮内施用、皮下施用、透皮递送、气管内施用、关节内施用、 心室内施用、吸入、脑内、经脐、口服、眼内、肺部施用、导管注入、通过 栓剂以及直接注射到组织中。

(8)一种药物组合物，其用于治疗或预防脑损伤，其中，所述药物组 合物包括β3-肾上腺素能受体激动剂。

(9)根据(8)所述的药物组合物，其中，所述β3-肾上腺素能受体激 动剂为米拉贝隆。

(10)根据(8)或(9)所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还 包括一种或多种脑损伤的治疗药物；可选地，所述药物组合物还包括一种或 多种药学上可接受的载体。

发明的效果

本发明通过研究发现，β3-肾上腺素能受体激动剂能够使脑出血模型小 鼠脑内的Ly6C^low单核细胞和表达替代激活标志物(CD206和PD-L2)的巨 噬细胞增加，脑组织浸润的中性粒细胞和淋巴细胞减少；促进Ly6C^low单核 细胞髓内造血，促进Ly6C^low单核细胞和巨噬细胞表达IL-10，有效可抑制脑 出血后局灶性脑部炎症和水肿，对于治疗脑出血后的脑损伤具有重要的临床 应用价值。

附图说明

图1示出了α-catulinGFP系小鼠脑出血后骨髓造血干细胞的计数结果；

图2示出了Fgd5-CreER/tdTomato系小鼠示踪实验显示的脑出血后 Ly6C^low单核细胞、Ly6C^high单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞， 以及CLP、MDP、GMP、CMP、HSC的细胞计数结果；

图3示出了Adrb3基因敲除后ICH诱导的HSC、Ly6C^low单核细胞、 Ly6C^high单核细胞、巨噬细胞生成及脑内的浸润的技术结果；

图4示出了Adrb3基因敲除后ICH诱导的骨髓造血干细胞Cdc42的表 达结果；

图5示出了给药组小鼠和对照组小鼠采集股骨骨髓中的造血干细胞计数 结果；

图6示出了给药组小鼠和对照组小鼠骨髓中髓系和淋巴系祖细胞的计数 结果；

图7示出了给药组小鼠和对照组小鼠骨髓中的髓系细胞(中性粒细胞、 Ly6C^low单核细胞、Ly6C^high单核细胞)计数结果；

图8示出了IL-10在给药组小鼠和对照组小鼠骨髓Ly6C^low单核细胞中 的表达结果；

图9示出了给药组小鼠和对照组小鼠中渗透免疫细胞亚群(中性粒细胞、 Ly6C^low单核细胞、Ly6C^high单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞)的计 数结果；

图10示出了IL-10在给药组小鼠和对照组小鼠脑中浸润的Ly6C^low单核 细胞中的表达结果；

图11示出了IL-10、CD206和PDL2在给药组小鼠和对照组小鼠脑中浸润 的巨噬细胞中的表达结果；

图12示出了给药组小鼠和对照组小鼠脑出血(ICH)后各时间点用mNSS 和圆柱体试验评定神经功能缺损程度；

图13示出了给药组小鼠和对照组小鼠在脑出血后第1天和第2天用MRI 测量血肿周围水肿体积；

图14示出了给药组小鼠和对照组小鼠脑出血后3天同侧大脑半球的脑含 水量。

具体实施方式

以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用 的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性” 所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的 具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以 实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和 步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

如无特殊声明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发 明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的 系统性误差。

本说明书中，如没有特别说明，则“％”均表示质量百分含量。

本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行 某种处理两方面的含义。

本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/ 优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定 要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实 施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。 另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

首先，本发明提供了β3-肾上腺素能受体激动剂在制备治疗或预防脑损 伤的药物中的应用。

本发明在研究中发现，β3-肾上腺素能受体激动剂可以提高脑出血模型 小鼠脑内Ly6C^low单核细胞数量，促进Ly6C^low单核细胞的骨髓造血。 Ly6C^low单核细胞可归巢至炎症部位并表达IL-10，并促进表达IL-10、 CD206以及PDL2的巨噬细胞浸润，减少脑组织浸润的中性粒细胞和 淋巴细胞，进而促进Ly6C^low单核细胞的骨髓造血，并抑制脑出血后局 灶性脑部炎症和水肿，有效改善由脑出血引发的脑损伤。

在本发明中，术语“肾上腺素能受体”在接受交感神经节后纤维支配的各 种器官中存在着与肾上腺素、去甲肾上腺素起反应的受体。肾上腺素能受体 可以分为三个亚型，分别为β1受体、β2受体和β3受体。β1受体主要分布于心 脏，占肾上腺素能受体总量的75％-80％，功能上β1受体与心肌收缩力和速率 的增加以及房室结传导速率有关。β2受体主要分布于肝脏、肺脏、子宫和肾 脏外周血管。β3受体主要分布于白色脂肪和棕色脂肪上，在小肠、胆囊、尿 道括约肌和膀胱中，在前列腺和胃中也有表达。

在本发明中，术语“β3-肾上腺素能受体激动剂”是能够选择性激活β3- 肾上腺素能受体的激动剂。目前，选择性β3-肾上腺素能受体激动剂正在被 开发用于治疗II型糖尿病、肥胖症和膀胱过度活动症。关于β3-肾上腺素能受 体激动剂在脑出血后脑损伤方面的研究还未见报道。

在本发明中，术语“造血干细胞”(Hematopoietic stem cells，HSCs)是 一群数量极少、具有自我更新能力和可生成各种血细胞及免疫细胞的起始细 胞，多数以静息状态存在于骨髓中。HSCs分化出的血细胞可以分成两大群 系：骨髓群系(myeloid lineage)和淋巴群系(lymphoid lineage)。骨髓群系 的细胞包含有：单核球、巨噬细胞、嗜中性白血细胞、嗜碱性白血细胞、嗜 酸性白血细胞、红血细胞、巨核细胞和血小板。

在本发明中，术语“单核细胞”是血液中最大的血细胞，单核细胞来源 于骨髓中的造血干细胞，并在骨髓中发育，目前认为它是巨噬细胞和树突状 细胞的前身。术语“巨噬细胞”是一种位于组织内的白血球，源自单核细胞， 是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。单核细胞和巨噬细胞 是重要的炎症调控细胞，具有促炎和抑炎的双向功能。

在本发明中，术语“Ly6C”是一种14kD的细胞表面蛋白，在50％的骨髓 细胞和外周少量T淋巴细胞中表达。最近的研究表明，巨噬细胞亚群的特征 在于差异性Ly6C表达，因此，Ly6C被认为是鉴定单核细胞和巨噬细胞亚群 的重要表面标志物。“Ly6C^low单核细胞”为Ly6C低表达的单核细胞， “Ly6C^high单核细胞”为Ly6C高表达的单核细胞。

在本发明中，术语“IL-10”为白细胞介素10，也称为细胞因子合成抑制 因子(CSIF)，是一种多效性细胞因子。IL-10能通过下调单核细胞表面主要 组织相容性抗原Ⅱ的表达，降低其抗原呈递作用，下调T淋巴细胞活性,抑制 炎性细胞的激活、迁移和粘附；同时，IL-10也能抑制炎症因子的合成与释放， 从而起到抗炎的作用。IL-10的单核细胞可有效调节单核/巨噬细胞功能。作 为细胞介导免疫反应的负调节物，IL-10能抑制前列腺素E2和产炎性细胞因 子包括TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8的产生。

在本发明中，术语“治疗”被定义为向受试者或来自受试者的分离的组 织或细胞系施加或施用治疗剂。所述受试者一般患有疾病或病症、存在疾病 或病症的症状或对疾病或病症具有易感性。确切地说，如本文所用的治疗是 针对已经患有脑出血的受试者。治疗的目的一般是医治、治愈、缓和、减轻、 救治、缓解或改善所述疾病、病症或症状。如本文所用的“经过治疗”指的 是疾病或病症被医治、治愈、缓和、减轻、救治、缓解或改善。

在一些具体的实施方案中，所述脑损伤为由脑出血引发的脑损伤。进一 步的，脑损伤包括由脑出血引发的原发性脑损伤和/或继发性脑损伤。示例性 的，脑损伤包括由脑出血引发的脑水肿、血肿扩大、血肿周围损伤、脑内炎 症反应和/或神经功能损伤。

在一些具体的实施方案中，所述β3-肾上腺素能受体激动剂为米拉贝隆。 米拉贝隆是第一个用于治疗膀胱过度活动症的β3-肾上腺素能受体激动剂类 药物。米拉贝隆的结构如下所示：

在一些具体的实施方案中，所述药物还包括一种或多种药学上可接受的 载体。在一些更为具体的实施方案中，所述药物包括治疗有效量的β3-肾上 腺素能受体激动剂和一种或多种药学上可接受的载体。

在本发明中，术语“药学上可接受的载体”是指适于与人体或动物体的 细胞、组织或器官相容，且不会诱发毒性、刺激性、变态反应性等毒副作用 的辅料成分。示例性的，药学上可接受的载体是本领域所熟知的，包括溶剂、 增溶剂、助溶剂、乳化剂、矫味剂、矫嗅剂、着色剂、粘合剂、崩解剂、填 充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、pH调节剂、稳定剂、表面活性剂和 /或防腐剂。

在本发明中，术语“有效量”指的是足以提供所需的作用但不存在毒性 或存在可接受的毒性的化合物的量。该量在受试者之间可能有所不同，取决 于受试者的物种、年龄以及身体状况、正在治疗的疾病的严重度、所使用的 具体化合物、它的施用方式等。合适的有效量可以由本领域的普通技术人员 确定。

在本发明中，术语“治疗有效量”用于指示活性化合物或药物制剂引 起所指示的生物反应或药物反应的量。这种反应可以出现在由研究人员、兽 医、内科医生或其他临床医师所试图治疗的组织、系统(包括人类在内的动 物)中。

在一些具体的实施方案中，所述药物还包括一种或多种脑损伤的治疗药 物。示例性的，β3-肾上腺素能受体激动剂可以与临床上用于治疗脑损伤的 一种或多种药物联合使用，例如，将β3-肾上腺素能受体激动剂与甘露醇和 高渗盐水联合应用。

在一些具体的实施方案中，通过包括以下各项在内的途径中的一种施用 所述药物：静脉内施用、腹膜内施用、冠状动脉内施用、动脉内施用、皮内 施用、皮下施用、透皮递送、气管内施用、关节内施用、心室内施用、吸入、 脑内、经脐、口服、眼内、肺部施用、导管注入、通过剂以及直接注射到组 织中。

其次，本发明还提供了一种药物组合物在制备治疗或预防脑损伤的药物 中的应用，其中，所述药物组合物包括β3-肾上腺素能受体激动剂。作为优 选，β3-肾上腺素能受体激动剂为米拉贝隆。

药物组合物中由于包含β3-肾上腺素能受体激动剂，可以对造血系统进 行调节，减轻脑出血中脑内的炎症反应，减轻脑水肿以及神经功能的损伤。

在一些实施方案中，药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体。 该药物组合物可根据本领域公知的方法制备：可通过将本公开的化合物或其 药学上可接受的盐与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅 剂组合，制成适于人或动物使用的任何剂型。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶 液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括O/W型、W/O型和复乳)、混 悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽 剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、 泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、 散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体 剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

为了将包含β3-肾上腺素能受体激动剂的药物组合物制成片剂，可以广 泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、 润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、 山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以 是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖 溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、 聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交 联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼 酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以 是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包 衣片，或双层片和多层片。

为了将包含β3-肾上腺素能受体激动剂的药物组合物制成胶囊剂，可以 将含有治疗有效量的β3-肾上腺素能受体激动剂与稀释剂、助流剂混合，将 混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将含有治疗有效量的β3-肾上腺素 能受体激动剂先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊 或软胶囊中。用于制备β3-肾上腺素能受体激动剂的各稀释剂、黏合剂、润 湿剂、崩解剂、助流剂品种，也可用于制备β3-肾上腺素能受体激动剂的胶 囊剂。

为将包含β3-肾上腺素能受体激动剂的药物组合物制成注射剂，可以用 水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的 增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛 沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐 酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、 醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味 剂或其它添加剂。

为达到用药目的，增强治疗效果，本公开的药物或药物组合物可用任何 公知的给药方法给药。

实施例

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术 人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范 围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

下述实施例中涉及小鼠购自美国缅因州巴尔港杰克逊实验室。

实施例1：检测脑出血模型小鼠的细胞(Ly6C^low、HSCs)及蛋白(Cdc42)变化

1、实验动物：

B6.Cg-Gt(ROSA)26S、Fgd5-CreERT2、α-catulin^GFP、Adrb3-/-小鼠， 3-4月龄，雄性。

2、模型建立：

Fgd5-CreERT2小鼠与B6.Cg-Gt(ROSA)26S小鼠杂交，获得 Fgd5-CreER-tdTomato小鼠。所有突变小鼠都回交到B6背景至少12代。

在小鼠腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪麻醉后，将小鼠头置于立体定位仪中。消 毒暴露颅骨后，在颅骨右侧钻孔，孔径需能插入30g的针，坐标为右侧2.3mm， 前方0.5mm。对于自体血液模型，麻醉后从小鼠角膜静脉抽出非肝素化血 液。然后用30g针头的微量注射器注射血液。将针插入到深3.7mm的孔中。 15min后，以1μl/min的速度向脑实质内注入30μL自体血。注射完毕后，将 针头留在孔内15min，以避免溢出，然后慢慢退出。胶原酶模型为相同部位 注射0.03U胶原酶Ⅳ(Thermo Fisher)。假手术组小鼠注射等体积生理盐水。 注射完成后，用5-0Ethicon丝线缝合切口。

3、实验方法：

流式分析：采用异氟醚麻醉处死小鼠，灌注冷磷酸盐缓冲盐水(PBS) 后，采集脑和股骨骨髓标本。将全脑组织切碎，37℃胶原酶孵育30min；PBS 洗涤后，30％Percoll离心除去髓鞘碎屑，1％牛血清白蛋白(BSA)重悬成 单个细胞后进行抗体染色。股骨经PBS冲洗出骨髓，用裂解缓冲液去除红细 胞。将单个细胞重悬在1％BSA缓冲液中进行抗体染色。细胞内染色需在表 面标志物染色后在固定缓冲液中固定20min后进行。在渗透缓冲液中洗涤两次后，将细胞与染色缓冲液中的抗体孵育45min。然后，将细胞洗涤后再悬 浮在流式细胞仪缓冲液中。用FACSAria^TMIII型流式细胞仪收集数据，用Flow Jo软件进行分析。

4、实验结果：

图1显示了α-catulin-GFP系小鼠显示脑出血后骨髓造血干细胞生成增加。 以α-catulin^GFP系小鼠模型(其中GFP的表达仅限于HSCs)量化ICH对骨 髓HSCs的影响，结果显示在α-catulin^GFP系小鼠模型中，脑出血后骨髓HSC 数目显著增加，提示脑出血后骨髓造血增加。

图2显示了Fgd5-CreER/tdTomato系小鼠示踪实验显示脑出血后骨髓 Ly6C^low单核细胞生成增加，并迁徙至脑内，促进脑内替代激活的巨噬细胞 增加。在转基因Fgd5-CreER/tdTomato系小鼠中进行谱系追踪发现，Ly6C^low单核细胞迁徙到脑出血的脑内，是造成脑内表达IL-10的单核细胞和替代激 活的巨噬细胞(表达替代激活标志物CD206和PDL2)浸润的主要原因。

图3显示了Adrb3基因敲除阻断了ICH诱导的骨髓Ly6C^low细胞生成及 其向脑内的浸润，图4显示了Adrb3基因敲除可阻断ICH诱导的骨髓造血干 细胞Cdc42的表达。对于不含β3-肾上腺素受体的Adrb3-/-小鼠模型，ICH 诱导的HSC计数增加和增殖减少。下游髓系细胞如IL-10⁺Ly6C^low单核细胞 的骨髓产生减少，伴随脑浸润表达IL-10的单核细胞和替代激活的巨噬细胞 减少。此外，脑出血小鼠HSCs的小Rho-GTPase Cdc42(细胞分裂周期蛋白42)显著上调。流式细胞仪还显示脑出血后3天造血干细胞中GTP结合的 Cdc42活性形式显著增加。而从Adrb3-/-小鼠获得的骨髓造血干细胞中，cdc42 活性形式的水平显著降低。这些结果提示CdC42活性是由β3-肾上腺素能神 经支配决定的。

上述结果提示β3-肾上腺素能神经支配在脑出血诱导的造血干细胞向髓 系偏向分化和Ly6C^low单核细胞的产生中起关键作用。

实施例2：脑出血模型小鼠以米拉贝隆给药后的血细胞及脑损伤变化检测

1、实验动物：

C57BL/6小鼠，3-4月龄，雄性，随机分为米拉贝隆给药组和对照组。

2、模型建立：

在腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪麻醉后，将小鼠头置于立体定位仪中。消毒暴 露颅骨后，在颅骨右侧钻孔，孔径需能插入30g的针，坐标为右侧2.3mm， 前方0.5mm。对于自体血液模型，麻醉后从小鼠角膜静脉抽出非肝素化血 液。然后用30g针头的微量注射器注射血液。将针插入到深3.7mm的孔中。 15min后，以1μl/min的速度向脑实质内注入30μL自体血。注射完毕后，将 针头留在孔内15min，以避免溢出，然后慢慢退出。胶原酶模型为相同部位 注射0.03U胶原酶Ⅳ(Thermo Fisher)。对照组小鼠注射等体积生理盐水。 注射完成后，用5-0Ethicon丝线缝合切口。

3、给药方式

米拉贝隆(Medchem,Monmouth Junction,NJ,USA)溶于DMSO/PBS (1:9)中，按2mg/kg体重灌胃给药，对照组给予PBS。米雷贝隆治疗在模 型诱导后即刻开始，直至实验结束。脑出血诱导后立即腹腔注射重组IL-3(加 拿大温哥华干细胞技术公司)，剂量为600ng/只，直至实验结束。

4、实验方法

(1)流式分析：采用异氟醚麻醉处死小鼠，灌注冷磷酸盐缓冲盐水(PBS) 后，采集脑和股骨骨髓标本。将全脑组织切碎，37℃胶原酶孵育30min；PBS 洗涤后，30％Percoll离心除去髓鞘碎屑，1％牛血清白蛋白(BSA)重悬成 单个细胞后进行抗体染色。股骨经PBS冲洗出骨髓，用裂解缓冲液去除红细 胞。将单个细胞重悬在1％BSA缓冲液中进行抗体染色。细胞内染色需在表 面标志物染色后在固定缓冲液中固定20min后进行。在渗透缓冲液中洗涤两 次后，将细胞与染色缓冲液中的抗体孵育45min。然后，将细胞洗涤后再悬 浮在流式细胞仪缓冲液中。用FACSAria^TMIII型流式细胞仪收集数据，用Flow Jo软件进行分析。

(2)水肿体积的评估：使用7TMRI扫描仪(Bruker)在脑出血后第3 天获得的图像上进行量化。采用脂肪抑制快速采集，松弛增强(REARE)序 列(重复时间4000ms，回声时间60ms，层厚0.5mm)采集脑部T2加权图 像，测量病灶体积。扫描磁敏感加权图像(SWI，重复时间21.0ms；回声时 间8.0ms；厚度0.3mm)测量血肿体积。T2像测量病灶体积，J像测量血肿体积，血肿周围水肿用病灶体积减去血肿体积计算。

(3)脑组织含水量评估：在脑出血手术后第3天评估脑水含量。简而言 之，在不灌注的情况下解剖小鼠的大脑，分别称重对侧大脑半球、同侧大脑 半球和小脑的湿重。分离的脑组织在100℃烘干24h后，再称量各部分的干 重。计算脑组织含水量，计算各部位从湿到干的失重百分比。

(4)神经功能评估：由两名不知治疗分组的研究人员独立执行。采用改 良神经学量表评分(MNSS)评价小鼠的神经功能缺损程度，通过一系列测 试综合评价小鼠的运动、感觉、反射和平衡功能。一只老鼠的分数在0～18 分之间，13～18分表示严重损伤，7～12分表示中度损伤，1～6分表示轻度损 伤。采用气缸试验评价精细感觉运动功能。将小鼠放入一个透明的玻璃圆筒 内，饲养20次，记录饲养过程中最先接触圆柱壁的前肢。偏侧指数按(右- 左)/(右+左+双侧)计算，偏侧度越高，左侧偏瘫越严重。

5、实验结果

图5示出了米拉贝隆给药组小鼠骨髓中造血干细胞数量较对照组明显增 多；图6示出了米拉贝隆给药组小鼠骨髓中髓系和淋巴系祖细胞较对照组明 显增多；图7示出了米拉贝隆给药组骨髓中的Ly6C^low单核细胞较对照组 明显增多，中性粒细胞、Ly6C^high单核细胞较对照组明显减少；图8 示出了IL-10在米拉贝隆给药组小鼠骨髓Ly6C^low单核细胞中的表达量 较对照组明显增多；图9示出了米拉贝隆给药组小鼠中Ly6C^low单核细胞、 巨噬细胞的细胞数量较对照组明显增多，中性粒细胞、Ly6C^high单核 细胞的细胞数量较对照组明显减少；图10示出了IL-10在米拉贝隆给药组小 鼠的Ly6C^low单核细胞中的表达较对照组明显增多；图11示出了IL-10、 CD206和PDL2在米拉贝隆给药组小鼠的巨噬细胞的表达较对照组小鼠脑 明显增多；图12示出了给药组小鼠和对照组小鼠脑出血(ICH)后各时间点 用mNSS和圆柱体试验评定神经功能缺损程度，米拉贝隆给药组小鼠神经功 能缺损较对照组明显减轻；图13示出了给药组小鼠和对照组小鼠在脑出血后 第1天和第2天用MRI测量血肿周围水肿体积，米拉贝隆给药组小鼠血肿周围 水肿体积较对照组明显减小；图14示出了给药组小鼠和对照组小鼠脑出血后 3天同侧大脑半球的脑含水量，米拉贝隆给药组小鼠同侧大脑半球含水量较 对照显著减低。

与PBS对照组相比，米拉贝隆组小鼠造血干细胞数量较对照组明显增多， 髓系细胞增多偏向较对照组更加明显，循环中及脑内的Ly6C^low单核细胞数 量及表达IL-10的Ly6C^low单核细胞比例明显升高，循环中Ly6C^high单核细胞 和中性粒细胞减少，脑中浸润的巨噬细胞表达IL-10和替代激活标志物 CD206和PDL2水平较对照组升高，神经功能缺损较对照组明显减轻，脑出 血后3天后血肿周围水肿体积较对照组明显减小，同侧大脑半球的脑含水量 显著减低。

以上结果表明，米拉贝隆可通过对造血系统的调节，减轻脑出血中脑内 的炎症反应，减轻脑水肿，减少神经功能损伤。

本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对 本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明 的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的 实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替 换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.β3-肾上腺素能受体激动剂在制备治疗或预防脑损伤的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述脑损伤为由脑出血引发的脑损伤；可选地，所述脑损伤包括由脑出血引发的原发性脑损伤和/或继发性脑损伤。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述脑损伤包括由脑出血引发的脑水肿、血肿扩大、血肿周围损伤、脑内炎症反应和/或神经功能损伤。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其中，所述β3-肾上腺素能受体激动剂为米拉贝隆。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其中，所述药物还包括一种或多种药学上可接受的载体；可选地，所述药学上可接受的载体包括溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、矫味剂、矫嗅剂、着色剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、pH调节剂、稳定剂、稀释剂、助流剂、表面活性剂和/或防腐剂。

6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其中，所述药物还包括一种或多种脑损伤的治疗药物。

7.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其通过包括以下各项在内的途径中的一种施用所述药物：静脉内施用、腹膜内施用、冠状动脉内施用、动脉内施用、皮内施用、皮下施用、透皮递送、气管内施用、关节内施用、心室内施用、吸入、脑内、经脐、口服、眼内、肺部施用、导管注入、通过栓剂以及直接注射到组织中。

8.一种药物组合物，其用于治疗或预防脑损伤，其中，所述药物组合物包括β3-肾上腺素能受体激动剂。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中，所述β3-肾上腺素能受体激动剂为米拉贝隆。

10.根据权利要求8或9所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包括一种或多种脑损伤的治疗药物；可选地，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体。

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