CN112322576A - 一种黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法 - Google Patents

一种黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112322576A
CN112322576A CN202011109260.4A CN202011109260A CN112322576A CN 112322576 A CN112322576 A CN 112322576A CN 202011109260 A CN202011109260 A CN 202011109260A CN 112322576 A CN112322576 A CN 112322576A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ovary
culturing
separating
culture medium
granular cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011109260.4A
Other languages
English (en)
Inventor
陈祥
敖叶
周志楠
洪磊
唐文
杨沛方
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guizhou University
Original Assignee
Guizhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guizhou University filed Critical Guizhou University
Priority to CN202011109260.4A priority Critical patent/CN112322576A/zh
Publication of CN112322576A publication Critical patent/CN112322576A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法，包括以下步骤：将成年经产的纯种黔北麻羊颈部放血处死，取出卵巢，冲去血污，带回无菌室，经酒精浸泡、酒精‑生理盐水‑灭菌PBS冲洗，用针头刺破卵泡，释放卵巢颗粒细胞，再用10％完全培养基冲洗，离心后，取沉淀继续用灭菌PBS缓冲液冲洗后，加入10％完全培养基吹打混匀，恒温培养箱中培养。经本发明可以分离出较纯的卵巢颗粒细胞，且操作简便，稳定可靠，可重复性好。

Description

一种黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及一种黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法。
背景技术
黔北麻羊是贵州优良地方山羊品种，具有耐粗饲、抗病力强、性温顺、肉质好、羔皮质量好、繁殖率较贵州其他地方品种高等优点，是培育多羔品系的良种素材。
颗粒细胞作为卵巢的主要功能细胞，从原始卵泡的生成到成熟卵泡的排出这整个发有过程中都起着重要作用。颗粒细胞可以作为媒介通过间隙连接来弥补卵母细胞对小分子物质摄取能力的不足。同时颗粒细胞的生长分化是原始卵泡启动、生长的关键。而当颗粒细胞发生调亡就会引起卵泡的闭锁,卵泡一旦闭锁就无法正常发育。所以为明确卵泡颗粒细胞增殖和凋亡的分子机制对卵泡发育的调控机制，就需对颗粒细胞进行分离培养就显得尤为重要。
目前，在卵巢颗粒细胞分离过程中，无论是卵巢的处理还是细胞的离心后处理，其清洗的次数均没有明确的规定，清洗次数过少，细胞污染概率较大，清洗次数过多，会降低细胞的存活数。
发明内容
有鉴于此，本发明针对上述问题，提供了一种黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法，操作简便，提高了卵巢颗粒细胞的分离的准确率和活细胞数目。
为实现上述目的，本发明公开了一种黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法，包括以下步骤：
(1)将成年经产的纯种黔北麻羊母羊进行颈部放血处死，分离卵巢及卵泡，依次采用75％酒精和含双抗溶液的灭菌PBS缓冲液冲去血污后，冲洗3-5次后转移至盛有预冷灭菌后的PBS缓冲液的烧杯中，4-5h内迅速转移至无菌室；
(2)取出经步骤(1)处理所得的卵巢及卵泡，置于75％酒精中浸泡30s，按75％酒精-生理盐水-灭菌PBS缓冲液(含双抗溶液)-DME/F12培养基的顺序冲洗3-5次；
(3)将经步骤(2)处理过的卵巢及卵泡放于盛有100ml10％完全培养基的培养皿中，挑选出最大的卵泡用灭菌后的注射器针头刺破后，使颗粒细胞释放出来，并用10％完全培养基冲洗，得冲洗液；
(4)将步骤(3)所得的的冲洗液置于离心管中，1500-2000rpm离心10-15 min，弃上清；
(5)将步骤(4)所剩的沉淀用含双抗溶液的灭菌PBS缓冲液漂洗3-4次；
(6)将步骤(5)漂洗后的沉淀，加入10％完全培养基吹打混匀，转移到细胞培养瓶中，置于恒温培养箱中培养，每24h更换培养基。
进一步地，上述步骤中PBS缓冲液的灭菌条件：温度是110-120℃，压力 80-100Kpa，时间是20-35min。
进一步地，上述步骤中PBS缓冲液的灭菌条件：温度是120℃，压力100Kpa，时间是20min。
进一步地，上述双抗溶液具体为：比例为1：1的青、链霉素混合液。
进一步地，上述步骤(1)中PBS缓冲液预冷至4℃。
进一步地，上述步骤(1)中卵巢转移的温度保持在4-8℃。
进一步地，上述步骤(3)和步骤(6)中10％完全培养基由为体积比为10：90：1的澳洲源胎牛血清，DMEM/F12培养基，青、链霉素混合液配制而成。
进一步地，上述步骤中所述青、链霉素混合液中青霉素含量为10ku/ml，链霉素含量为10mg/ml，溶剂为0.9％的NaCl溶液。
进一步地，上述步骤步骤(6)中，培养条件为：温度为35-40℃，CO2浓度为3-8％。
与现有技术比，本发明具有以下有益效果：
本发明操作简便，通过卵巢摘除后酒精浸泡、冲洗以及细胞离心后清洗次数的精确控制，使最终所分离的颗粒细胞单一，无杂质无污染，可以提高后续实验的准确性。
本发明对黔北麻羊颗粒细胞进行分离，经免疫荧光鉴定后发现所分离出的颗粒细胞形态，大小均一，呈圆形或椭圆形，且结构完整，表明细胞处于健康状态，死细胞少。同时发现FSHR抗体与颗粒细胞发生特异性结合，FSHR阳性细胞呈红色，所有细胞核呈蓝色，且A和B能完全重合，表明培养的原代细胞为黔北麻羊卵巢颗粒细胞。
附图说明
图1黔北麻羊卵巢原代颗粒细胞的显微照片：分别是培养24h和48h的显微照片
图2黔北麻羊卵巢颗粒细胞免疫荧光(FSHR)鉴定图片:
A(细胞DAPI特异性荧光)
B(细胞核染荧光)
C(细胞DAPI特异性荧光和细胞核染荧光完全重合)
图3分离细胞后PBS洗涤2次的结果
图4酒精杀菌没有浸泡30s
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本范围仅限于下述实施例。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售试剂，实施例中所用的段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
仪器与试剂
仪器
Figure RE-GDA0002835465420000041
试剂
Figure RE-GDA0002835465420000042
Figure RE-GDA0002835465420000051
实施例1
该黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法，包括以下步骤：
(1)将成年经产的纯种黔北麻羊母羊进行颈部放血处死，分离卵巢及卵泡，依次采用75％酒精和经过110℃，100kPa条件下灭菌35min并加入1：1的青、链霉素混合溶液的PBS缓冲液冲去血污后，冲洗3次后转移至盛有预冷至4℃的PBS 缓冲液的烧杯中，4h内迅速转移至无菌室，转移过程中温度保持在4℃；
(2)取出经步骤(1)处理所得的卵巢及卵泡，置于75％酒精中浸泡30s，按75％酒精-生理盐水-灭菌PBS缓冲液(含1：1青、链霉素溶液)-DME/F12培养基的顺序冲洗3次；
(3)将经步骤(2)处理过的卵巢及卵泡放于盛有100ml10％完全培养基的培养皿中，其中培养基由体积比为10：90：1的澳洲源胎牛血清，DMEM/F12培养基，青、链霉素混合液(青、链霉素混合液中青霉素含量为10ku/ml，链霉素含量为 10mg/ml，溶剂为0.9％的NaCl溶液)配制而成，挑选出最大的卵泡用灭菌后的注射器针头刺破后，使颗粒细胞释放出来，并用10％完全培养基冲洗，得冲洗液；
(4)将步骤(3)所得的的冲洗液置于离心管中，2000rpm离心10min，弃上清；
(5)将步骤(4)所剩的沉淀用含双抗溶液的灭菌PBS缓冲液漂洗3次；
(6)将步骤(5)漂洗后的沉淀，加入10％完全培养基吹打混匀，转移到细胞培养瓶中，置于温度为35℃，CO2浓度为8％的恒温培养箱中培养，每24h更换培养基。
实施例2
该黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法，包括以下步骤：
(1)将成年经产的纯种黔北麻羊母羊进行颈部放血处死，分离卵巢及卵泡，依次采用75％酒精和经过120℃，100kPa条件下灭菌20min并加入1：1的青、链霉素混合溶液的PBS缓冲液冲去血污后，冲洗3次后转移至盛有预冷至4℃的PBS 缓冲液的烧杯中，5h内迅速转移至无菌室，转移过程中温度保持在8℃；
(2)取出经步骤(1)处理所得的卵巢及卵泡，置于75％酒精中浸泡30s，按75％酒精-生理盐水-灭菌PBS缓冲液(含1：1青、链霉素溶液)-DME/F12培养基的顺序冲洗5次；
(3)将经步骤(2)处理过的卵巢及卵泡放于盛有100ml10％完全培养基的培养皿中，其中培养基由体积比为10：90：1的澳洲源胎牛血清，DMEM/F12培养基，青、链霉素混合液(青、链霉素混合液中青霉素含量为10ku/ml，链霉素含量为 10mg/ml，溶剂为0.9％的NaCl溶液)配制而成，挑选出最大的卵泡用灭菌后的注射器针头刺破后，使颗粒细胞释放出来，并用10％完全培养基冲洗，得冲洗液；
(4)将步骤(3)所得的的冲洗液置于离心管中，2000rpm离心15min，弃上清；
(5)将步骤(4)所剩的沉淀用含双抗溶液的灭菌PBS缓冲液漂洗4次；
(6)将步骤(5)漂洗后的沉淀，加入10％完全培养基吹打混匀，转移到细胞培养瓶中，置于温度为37℃，CO2浓度为5％的恒温培养箱中培养，每24h更换培养基。
实施例3
该黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法，包括以下步骤：
(1)将成年经产的纯种黔北麻羊母羊进行颈部放血处死，分离卵巢及卵泡，依次采用75％酒精和经过115℃，90kPa条件下灭菌30min并加入1：1的青、链霉素混合溶液的PBS缓冲液冲去血污后，冲洗3次后转移至盛有预冷至4℃的PBS 缓冲液的烧杯中，4.8h内迅速转移至无菌室，转移过程中温度保持在7℃；
(2)取出经步骤(1)处理所得的卵巢及卵泡，置于75％酒精中浸泡30s，按75％酒精-生理盐水-灭菌PBS缓冲液(含1：1青、链霉素溶液)-DME/F12培养基的顺序冲洗5次；
(3)将经步骤(2)处理过的卵巢及卵泡放于盛有100ml10％完全培养基的培养皿中，其中培养基由体积比为10：90：1的澳洲源胎牛血清，DMEM/F12培养基，青、链霉素混合液(青、链霉素混合液中青霉素含量为10ku/ml，链霉素含量为 10mg/ml，溶剂为0.9％的NaCl溶液)配制而成，挑选出最大的卵泡用灭菌后的注射器针头刺破后，使颗粒细胞释放出来，并用10％完全培养基冲洗，得冲洗液；
(4)将步骤(3)所得的的冲洗液置于离心管中，1800rpm离心12min，弃上清；
(5)将步骤(4)所剩的沉淀用含双抗溶液的灭菌PBS缓冲液漂洗4次；
(6)将步骤(5)漂洗后的沉淀，加入10％完全培养基吹打混匀，转移到细胞培养瓶中，置于温度为36℃，CO2浓度为7％的恒温培养箱中培养，每24h更换培养基。
实施例4
该黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法，包括以下步骤：
(1)将成年经产的纯种黔北麻羊母羊进行颈部放血处死，分离卵巢及卵泡，依次采用75％酒精和经过112℃，95kPa条件下灭菌33min并加入1：1的青、链霉素混合溶液的PBS缓冲液冲去血污后，冲洗3次后转移至盛有预冷至4℃的PBS 缓冲液的烧杯中，4.5h内迅速转移至无菌室，转移过程中温度保持在6℃；
(2)取出经步骤(1)处理所得的卵巢及卵泡，置于75％酒精中浸泡30s，按75％酒精-生理盐水-灭菌PBS缓冲液(含1：1青、链霉素溶液)-DME/F12培养基的顺序冲洗4次；
(3)将经步骤(2)处理过的卵巢及卵泡放于盛有100ml10％完全培养基的培养皿中，其中培养基由体积比为10：90：1的澳洲源胎牛血清，DMEM/F12培养基，青、链霉素混合液(青、链霉素混合液中青霉素含量为10ku/ml，链霉素含量为10mg/ml，溶剂为0.9％的NaCl溶液)配制而成，挑选出最大的卵泡用灭菌后的注射器针头刺破后，使颗粒细胞释放出来，并用10％完全培养基冲洗，得冲洗液；
(4)将步骤(3)所得的的冲洗液置于离心管中，1600rpm离心12min，弃上清；
(5)将步骤(4)所剩的沉淀用含双抗溶液的灭菌PBS缓冲液漂洗3次；
(6)将步骤(5)漂洗后的沉淀，加入10％完全培养基吹打混匀，转移到细胞培养瓶中，置于温度为38℃，CO2浓度为4％的恒温培养箱中培养，每24h更换培养基。
实施例5
该黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法，包括以下步骤：
(1)将成年经产的纯种黔北麻羊母羊进行颈部放血处死，分离卵巢及卵泡，依次采用75％酒精和经过110℃，85kPa条件下灭菌28min并加入1：1的青、链霉素混合溶液的PBS缓冲液冲去血污后，冲洗4次后转移至盛有预冷至4℃的PBS 缓冲液的烧杯中，4.2h内迅速转移至无菌室，转移过程中温度保持在5℃；
(2)取出经步骤(1)处理所得的卵巢及卵泡，置于75％酒精中浸泡30s，按75％酒精-生理盐水-灭菌PBS缓冲液(含1：1青、链霉素溶液)-DME/F12培养基的顺序冲洗5次；
(3)将经步骤(2)处理过的卵巢及卵泡放于盛有100ml10％完全培养基的培养皿中，其中培养基由体积比为10：90：1的澳洲源胎牛血清，DMEM/F12培养基，青、链霉素混合液(青、链霉素混合液中青霉素含量为10ku/ml，链霉素含量为 10mg/ml，溶剂为0.9％的NaCl溶液)配制而成，挑选出最大的卵泡用灭菌后的注射器针头刺破后，使颗粒细胞释放出来，并用10％完全培养基冲洗，得冲洗液；
(4)将步骤(3)所得的的冲洗液置于离心管中，1800rpm离心11min，弃上清；
(5)将步骤(4)所剩的沉淀用含双抗溶液的灭菌PBS缓冲液漂洗3次；
(6)将步骤(5)漂洗后的沉淀，加入10％完全培养基吹打混匀，转移到细胞培养瓶中，置于温度为39℃，CO2浓度为7％的恒温培养箱中培养，每24h更换培养基。
细胞形态观察
在细胞接种后，每天在倒置显微镜下观察细胞形态，并照相。每个时间段用显微镜详细观察、记录细胞形态及生长情况。
颗粒细胞免疫荧光鉴定
①细胞培养24h后，吸取培养基，用PBS洗3次/2min，再用4％的多聚甲醛 4℃固定90min，PBS洗3次/2min；
②5％BSA(配制：100ml双蒸水加入5gBSA粉末)室温封闭30min，吸取5％BSA，用1:100稀释的FSHR抗体，4℃过夜；
③回收一抗并用PBS洗3次/2min，用1:100稀释的二抗，室温孵育30min (避光)，PBS洗3次/2min，加入1:200稀释的SABS-Cy3室温避光孵育30min；
④用PBS洗干净后在避光条件下加入浓度为1μg/μL的DAPI，37℃孵育 15min，PBS洗3次/2min，拍照保存。
实验结果
原代培养的黔北麻羊卵巢颗粒细胞的细胞学观察
在倒置显微镜下对卵巢颗粒细胞进行观察发现，刚分离出来的颗粒细胞呈椭圆饱满，透亮度好。培养24h的颗粒细胞贴壁良好，体积变大，培养48h基本已长满培养瓶(如图1)。
原代培养的黔北麻羊卵巢颗粒细胞DAPI核染。
DAPI核染后在荧光显微镜下观察，能清晰的看见细胞核呈蓝色(附图2B)
原代培养的卵巢卵泡颗粒细胞免疫荧光鉴定。
颗粒细胞中能够表达FSHR受体，并能与FSHR抗体异性结合，二抗孵育后镜检可以观测到DAPI荧光，且荧光在细胞核周围。FSHR受体为细膜受体，所以荧光在细胞核染所发出的荧光周围，显红色(图2A)，且2A和2B能完全重合(图 2C)。免疫荧光鉴定结果表明，分离培养的细为卵巢颗粒细胞。
为证实该发明分离的卵巢颗粒细胞准确率高，细胞存活率高，又做了几个对比实验。
对比例1
步骤(5)中，将步骤(4)所剩的沉淀用含双抗溶液的灭菌PBS缓冲液漂洗 2次，其他步骤与实施例2相同，培养24h后在倒置显微镜下观察如图3，杂质较多。
对比例2
步骤(5)中，将步骤(4)所剩的沉淀用含双抗溶液的灭菌PBS缓冲液漂洗 4次以上，其他步骤与实施例2相同，培养24h后在倒置显微镜下观察如图4，细胞数较少。
对比例3
步骤(2)中，没有浸泡酒精，其他步骤与实施例2相同，培养24h后在倒置显微镜下观察，细胞被污染。
对比例4
即为实施例2
经过结果的对比，实施例2的分离效果最优，分离前卵巢的处理，分离后对颗粒细胞的处理都尤为重要。

Claims (9)

1.一种黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将成年经产的纯种黔北麻羊母羊进行颈部放血处死，分离卵巢及卵泡，依次采用75％酒精和含双抗溶液的灭菌PBS缓冲液冲去血污后，冲洗3-5次后转移至盛有预冷灭菌后的PBS缓冲液的烧杯中，4-5h内迅速转移至无菌室；
(2)取出经步骤(1)处理所得的卵巢及卵泡，置于75％酒精中浸泡30s，按75％酒精-生理盐水-含双抗溶液灭菌PBS缓冲液-DME/F12培养基的顺序冲洗3-5次；
(3)将经步骤(2)处理过的卵巢及卵泡放于盛有100ml 10％完全培养基的培养皿中，挑选出最大的卵泡用灭菌后的注射器针头刺破后，使颗粒细胞释放出来，并用10％完全培养基冲洗，得冲洗液；
(4)将步骤(3)所得的的冲洗液置于离心管中，1500-2000rpm离心10-15min，弃上清；
(5)将步骤(4)所剩的沉淀用含双抗溶液的灭菌PBS缓冲液漂洗3-4次；
(6)将步骤(5)漂洗后的沉淀，加入10％完全培养基吹打混匀，转移到细胞培养瓶中，置于恒温培养箱中培养，每24h更换培养基。
2.根据权利要求1所述的一种黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法，其特征在于，所述PBS缓冲液的灭菌条件：温度是110-120℃，压力80-100Kpa，时间是20-35min。
3.根据权利要求2所述的一种黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法，其特征在于，所述PBS缓冲液的灭菌条件：温度是120℃，压力100Kpa，时间是20min。
4.根据权利要求1所述的一种黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法，其特征在于，所述双抗溶液具体为：比例为1：1的青、链霉素混合液。
5.根据权利要求1所述的一种黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中PBS缓冲液预冷至4℃。
6.根据权利要求1所述的一种黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中卵巢转移的温度保持在4-8℃。
7.根据权利要求1所述的一种黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤(3)和步骤(6)中10％完全培养基由体积比为10：90：1的澳洲源胎牛血清，DMEM/F12培养基，青、链霉素混合液配制而成。
8.根据权利要求4或7所述的一种黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法，其特征在于，所述青、链霉素混合液中青霉素含量为10ku/ml，链霉素含量为10mg/ml，溶剂为0.9％的NaCl溶液。
9.根据权利要求1所述的一种黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤(6)中，恒温培养箱的培养条件为：温度为35-40℃，CO2浓度为3-8％。
CN202011109260.4A 2020-10-16 2020-10-16 一种黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法 Pending CN112322576A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011109260.4A CN112322576A (zh) 2020-10-16 2020-10-16 一种黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011109260.4A CN112322576A (zh) 2020-10-16 2020-10-16 一种黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112322576A true CN112322576A (zh) 2021-02-05

Family

ID=74314064

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011109260.4A Pending CN112322576A (zh) 2020-10-16 2020-10-16 一种黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112322576A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113774010A (zh) * 2021-08-31 2021-12-10 塔里木大学 一种多浪羊卵巢颗粒细胞分离培养方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
敖叶等: "SMAD1基因对黔北麻羊卵巢颗粒细胞的影响及组织表达分析", 《畜牧兽医学报》 *
洪磊等: "黔北麻羊HSD3B1基因真核表达载体构建及其对卵巢颗粒细胞的影响", 《农业生物技术学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113774010A (zh) * 2021-08-31 2021-12-10 塔里木大学 一种多浪羊卵巢颗粒细胞分离培养方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105754932B (zh) 鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法
WO2010043076A1 (zh) 适于临床应用的人胎盘间质细胞库的建立方法
CN112322576A (zh) 一种黔北麻羊卵巢颗粒细胞分离及培养方法
CN110283777A (zh) 一种对虾细胞连续培养方法
CN106434536B (zh) 人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法
CN113462635A (zh) 一种绵羊卵巢颗粒细胞分离、培养及鉴定方法
CN107603944B (zh) 一种添加迷迭香酸的卵母细胞体外成熟培养液及其应用
CN108004204B (zh) 一种高通量筛选优质卵母细胞的方法
CN115074313B (zh) 蟛蜞菊内酯在制备促进胚胎发育产品中的应用
CN113604427B (zh) 一种含丙酮酸激酶的人卵母细胞体外成熟培养液及培养方法
CN112438252B (zh) 一种适用于小鼠心脏组织单细胞测序的组织冷冻及解冻方法
CN114438015B (zh) 一种来源于卵巢的人颗粒细胞系及其制备方法与应用
CN113774013A (zh) 一种鸡小黄卵泡外膜层细胞分离和培养方法
Aladjem et al. Morphologic characteristics of the normal term human trophoblast maintained in prolonged in vitro cultures
Smith et al. Generation of rat neural stem cells to produce different astrocyte phenotypes
CN108191953B (zh) 一种高效富集水牛细胞蛋白质的方法
Chiu et al. Establishing Bipotential Human Lung Organoid Culture System and Differentiation to Generate Mature Alveolar and Airway Organoids
CN104855321A (zh) 一种适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法
CN113373110B (zh) 一种nsc668394在制备提高猪精子授精能力的试剂中的应用
Graham et al. The monoxenic cultivation of Hymenolepis diminuta cysticercoids with rat fibroblasts
CN115896032B (zh) 一种牦牛卵巢卵丘细胞系及其构建方法和应用
CN115011549B (zh) 胆囊上皮细胞的建系方法、胆囊上皮细胞系及其应用
CN114426948B (zh) 一种自发永生化的胎猪肾小球系膜细胞系及其应用
CN104585163A (zh) 水牛卵母细胞玻璃化冷冻预处理方法
WO2022028150A1 (zh) 筛选靶细胞或细胞的方法及生物培养芯片

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20210205

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication