CN115074313B

CN115074313B - 蟛蜞菊内酯在制备促进胚胎发育产品中的应用

Info

Publication number: CN115074313B
Application number: CN202210752882.1A
Authority: CN
Inventors: 金南衡; 王薪钦; 刘容萍; 王晶; 许永男; 李英花
Original assignee: Wuyi University
Current assignee: Wuyi University
Priority date: 2022-06-29
Filing date: 2022-06-29
Publication date: 2023-10-17
Anticipated expiration: 2042-06-29
Also published as: CN115074313A

Abstract

本发明公开了蟛蜞菊内酯在制备促进胚胎发育产品中的应用，属于动物医药技术领域。将蟛蜞菊内酯应用于制备促进胚胎发育药物中，由于蟛蜞菊内酯具有增强囊胚发育和抗氧化的能力，以及抑制自噬等功能，使得其能够提高胚胎发育；本发明通过在体外培养基中添加蟛蜞菊内酯，证明了其可促进卵母细胞孤雌激活后发育到囊胚阶段，减弱了发育中自噬的表达，提高了胚胎的抗氧化功能和囊胚的形成率，从而增强了猪胚胎发育能力，并抑制体外发育过程中的所产生氧化应激和过渡自噬的问题。

Description

蟛蜞菊内酯在制备促进胚胎发育产品中的应用

技术领域

本发明涉及动物医药技术领域，尤其是涉及蟛蜞菊内酯在制备促进胚胎发育产品中的应用。

背景技术

随着1978年世界第一例试管婴儿的诞生，辅助生殖技术在全球进入了高速发展的时期。辅助生殖技术是对卵子、精子或受精卵发育的胚胎等，在体内外进行操作形成新生命的技术。由于体内外操作差异，以及环境污染、母体生育年龄上升，该技术面临着严峻的挑战，包括配子发生和成熟率下降、胚胎发育不良、胎儿缺陷率增多等问题，从而导致不良出生或子代健康等问题。

在哺乳动物胚胎的体外发生过程中，顺利发育到囊胚是非常关键的一步。囊胚具有紧密排列的滋养层和松散排列的内细胞团，一般在卵母细胞受精后的第5至7天才形成囊胚，只有质量最好的胚胎才能发育成为囊胚，使用囊胚移植能更好的提高胚胎植入率。然而，相比于体内动态平衡的微环境，体外培养胚胎受到渗透压、pH、湿度、氧气、氨基酸和微量元素等理化因素的影响。

蟛蜞菊内酯是一种天然的植物提取药物，属于香豆醚化合物。即7-甲氧基-5,11,12-三羟基香豆素，其具有如下分子式：

蟛蜞菊内酯是一种从中药材墨旱莲中分离得到，具有许多药理活性的成分。然而，蟛蜞菊内酯对胚胎发育的影响以及相关机制仍不清楚。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了蟛蜞菊内酯在制备促进胚胎发育产品中的应用，该成分能够有效促进胚胎发育。

根据本发明的第一方面，提出了蟛蜞菊内酯在制备促进胚胎发育产品中的应用。

根据本发明的一些实施方式，所述产品为试剂盒、培养基或药物。

本发明还提出了蟛蜞菊内酯在制备促进胚胎囊胚形成的产品中的应用。

本发明还提出了蟛蜞菊内酯在制备增强胚胎抗氧化能力的产品中的应用。蟛蜞菊内酯可以增强卵母细胞的GSH水平，从而提高其抗氧化能力，利于卵母细胞存活，从而促进早期胚胎发育。

本发明还提出了蟛蜞菊内酯在制备抑制胚胎自噬的产品中的应用。蟛蜞菊内酯可以降低LC3的表达水平，从而抵制胚胎过度自噬，进而促进胚胎发育。

根据本发明的第二方面，还提出了一种促进胚胎发育的产品，所述产品的原料包括蟛蜞菊内酯。

根据本发明的一些实施方式，所述培养基用于培养猪孤雌激活胚胎的早期发育，包括2-细胞、4-细胞、8-细胞、16-细胞、桑葚胚，最后发育到囊胚。

根据本发明的一些实施方式，所述培养基的原料还包括以下成分中的至少一种：氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、碳酸氢钠、丙酮酸钠、乳酸钙、谷氨酰胺、亚牛磺酸、氨基酸、庆大霉素或牛血清白蛋白。

根据本发明的一些实施方式，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

根据本发明的第三方面，还提出了蟛蜞菊内酯在体外促进猪卵母细胞胚胎发育中的用途。

根据本发明的一些实施方式，所述蟛蜞菊内酯的浓度为0.25nmol/L～25nmol/L；优选为2.5nmol/L。

根据本发明的第四方面，还提出了一种体外促进猪卵母细胞胚胎发育的方法，包括如下步骤：将蟛蜞菊内酯与卵母细胞接触。

根据本发明的一些实施方式，所述方法具体包括如下步骤：

S1、取成熟的卵母细胞进行孤雌生殖激活；

S2、取经步骤S1处理后的卵母细胞置于含有蟛蜞菊内酯的胚胎培养液中培养，形成囊胚。

根据本发明的一些实施方式，所述方法还包括制备成熟卵母细胞的步骤。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

本发明方案发明蟛蜞菊内酯可以通过抑制胚胎发生过程中的氧化应激和过度自噬等作用以增强囊胚的发育能力，并提升囊胚的形成率，其对胚胎发育具有良好的促进作用，对于卵母细胞体外培养具有重要意义，可用于制备促进胚胎发育的药物、培养基或试剂盒等，具有良好的工业应用前景。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是本发明中实施例1中不同添加量蟛蜞菊内酯及空白对照组中囊胚发育情况及囊胚形成率统计结果图；

图2是本发明中实施例2中添加2.5nM蟛蜞菊内酯及空白对照组的细胞内CMF₂HC的相对荧光强度检测结果图；

图3是本发明中实施例3中添加2.5nM蟛蜞菊内酯及空白对照组的细胞内自噬体蛋白LC3B表达量的检测结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1一种体外促进猪卵母细胞胚胎发育的方法。

一种体外促进猪卵母细胞胚胎发育的方法，具体包括如下步骤：

1)卵母细胞采集和体外成熟

取青春期猪卵巢(取自当地屠宰场)，并在补充有青霉素G和硫酸链霉素的0.9wt％无菌盐水溶液(9g NaCl溶于1L灭菌后的超纯水中)中运送到实验室。使用安装在一次性10mL注射器上的18号针头从卵巢中3-8mm的卵泡中吸出卵丘-卵母细胞复合物(COCs)。将抽吸出的卵泡溶液分配到15mL玻璃管中并沉淀。然后，去除上清液并用100ml含台氏缓冲液(Tyrode’s solution)的乳酸4-羟乙基哌嗪乙磺酸(TL-HEPES)培养基(100mL TL-HEPES培养基含有100ml超纯水、30mg CaCl₂·2H₂O(sigma，C7902)、23.5mg氯化钾(sigma，P5405)、10mg六水氯化镁(sigma，M2393)、4.08mg磷酸二氢钠(sigma，S5011)、0.1868ml聚乳酸(sigma，L7900)、666mg氯化钠(sigma，S5886)、16.8mg碳酸氢钠(sigma，S5761)、238mg缓冲液(sigma，H3784)、2.2mg丙酮酸钠(sigma，P4562)、100mg聚乙烯醇(sigma，P8136)、0.0065g青霉素(sigma，P3032)、2.5mg庆大霉素(sigma，G1264)、1mg酚红(sigma，P3532))中洗涤三次，然后转移至0.5mL体外卵母细胞成熟(in vitro maturation，IVM，每10mL IVM培养基含有9.97ml TCM199(gibco，11150059)、10μl表皮生长因子(sigma，E4127)、10μl垂体促卵泡素(宁波第二激素厂，JY4894110)、10μl垂体促黄体素(宁波第二激素厂，JY84949685))培养液在4孔培养板中覆盖矿物油，并在38.5℃、5％CO₂和100％相对湿度的气氛中孵育45小时左右(44-46小时)。

2)孤雌激活和胚胎体外培养

在经体外卵母细胞成熟培养液培养后，通过在1.5mL离心管中用0.1wt％透明质酸酶移液约30次将卵母细胞和卵丘细胞与COCs分离。在含有0.5mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸，氢离子缓冲剂)、0.05mM CaCl₂·2H₂O、0.1mM MgSO₄·7H₂O和0.01wt％聚乙烯醇的300mM甘露醇中，使用120V直流脉冲持续60μs对卵丘耗尽的卵母细胞进行孤雌生殖激活。

3)胚胎体外培养

用7.5mg/mL细胞松弛素B处理激活后的胚胎，并置于38.5℃、5％CO₂和100％相对湿度的培养箱中，培养3小时。随后，大约40个卵母细胞用IVC培养基(每100ml IVC培养基含有97ml超纯水、632.1mg氯化钠(sigma，S5886)、74.6mg氯化钾(sigma，P5405)、4.8mg磷酸二氢钾(sigma，P5655)、9.9mg硫酸镁(sigma，M2643)、210.6mg碳酸氢钠(sigma，S5761)、2.2mg丙酮酸钠(sigma，P5280)、61.7mg乳酸钙(sigma，C8356)、29.2mg谷胱甘肽(sigma，G8540)、54.6mg亚牛磺酸(sigma，H1384)、2ml必需氨基酸(sigma，B6766)、1ml非必需氨基酸(sigma，M7145)、5mg庆大霉素(sigma，B6766)、400mg牛血清白蛋白(sigma，A8806))彻底清洗，转移到含有蟛蜞菊内酯的4孔培养板(覆盖有矿物油的500mL IVC培养基)中，并在38.5℃、5％CO₂和100％相对湿度的气氛中培养7天，用显微镜观察囊胚发育情况，并计算囊胚形成率。

为探究蟛蜞菊内酯不同添加量对囊胚形成率的影响，同时进行了不同添加量的促进实验，其中，添加2.5nM及25nM蟛蜞菊内酯后及空白对照组中囊胚发育情况及囊胚形成率统计结果图如图1所示(上述实验平行进行4次，并计算其平均值)。从图1中可以看出，添加2.5nM蟛蜞菊内酯的囊胚形成率显著优于其他组。其相对于未添加蟛蜞菊内酯的空白组，囊胚形成率可提升约10％。

实施例2蟛蜞菊内酯在制备增强胚胎抗氧化能力产品中的应用。

取上述实施例1中培养得到的四细胞期的胚胎，通过细胞内谷胱甘肽(GSH)水平的测定以验证其是否具有增强胚胎抗氧化能力。将四细胞期胚胎在1mL含有10mM 4-氯甲基-6,8-二氟-7-羟基香豆素(CMF₂HC，购自Invitrogen公司，Rochester，NY，USA)的PBS-PVA培养液(PBS-PVA培养液指0.1g聚乙烯醇(PVA，sigma，P1763)溶解于100mL磷酸盐缓冲液(PBS，gibco，C10010500BT)中)中处理，在38.5℃、5％CO₂和100％相对湿度的气氛中1小时。用PBS-PVA培养液洗涤4次后，将染色的胚胎放入5μL PBS-PVA培养液液滴中，用倒置荧光显微镜拍照，用Image J软件分析细胞内CMF₂HC的相对荧光强度。添加2.5nM蟛蜞菊内酯及空白对照组的检测结果如图2。从图2中可以看出，添加2.5nM蟛蜞菊内酯的细胞内GSH水平显著增高，由此表明蟛蜞菊内酯在制备增强胚胎抗氧化能力产品中具有良好的应用前景。

实施例3蟛蜞菊内酯在制备抑制胚胎自噬产品中的应用。

取上述实施例1中培养得到的胚胎(囊胚)，通过免疫荧光染色测定自噬体蛋白LC3B表达量以验证其是否具有抑制胚胎自噬能力。收集第7天的胚胎，用含3.7wt％多聚甲醛的PBS-PVA固定30分钟，然后用含0.1wt％TritonX-100的PBS-PVA在室温(25摄氏度)下透化30分钟。之后，将胚胎在含有3wt％牛血清白蛋白(BSA)的PBS-PVA中室温孵育1小时，然后与一抗LC3B抗体(货号ab48394，1:200稀释；Abcam，Cambridge，MA，USA)在4℃下孵育14小时。用PBS-PVA洗涤三次后，将细胞与山羊抗兔IgG(货号ab150077，1:500稀释；Abcam)孵育1小时，然后在室温下与10mg/mL的荧光染料Hoechst 33342孵育10分钟标记细胞核。最后，将胚胎用PBS-PVA洗涤四次并安装在载玻片上。使用倒置荧光显微镜(Ti2eU；Nikon)检测微管相关蛋白1轻链3(LC3B)斑点的数量，并用ImageJ软件(NIH)分析荧光强度。添加2.5nM蟛蜞菊内酯及空白对照组的检测结果如图3所示。从图3中可以看出，蟛蜞菊内酯有效的减弱了猪孤雌胚胎的自噬能力。由此表明蟛蜞菊内酯在制备抑制胚胎自噬产品中具有良好的应用前景。

上述统计结果表示为平均值±标准偏差(SD)。学生t检验用于比较两组数据。单因素方差分析(ANOVA，Tukey-Kramer检验)用于分析三个或更多平均值。所有统计分析均按*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001进行。所有统计分析均使用SPSS 22.0版(IBM Corp.，Chicago，IL，USA)进行。

综上所述，本发明证明了蟛蜞菊内酯可促进卵母细胞孤雌激活后发育到囊胚阶段，减弱了发育中自噬的表达，提高了胚胎的抗氧化功能和囊胚的形成率，从而增强了猪早期胚胎发育能力，并抑制体外发育过程中的所产生氧化应激和过渡自噬的问题。蟛蜞菊内酯在制备促进胚胎发育产品中，具有良好的市场应用前景。

Claims

1.蟛蜞菊内酯在制备体外促进猪卵母细胞发育的培养基中的应用，其特征在于，所述蟛蜞菊内酯的浓度为2.5nmol/L。