KR20190007326A

KR20190007326A - Its 및 egf를 포함하는 소 수정란의 체외 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외 배양 방법

Info

Publication number: KR20190007326A
Application number: KR1020170088639A
Authority: KR
Inventors: 공일근
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2017-07-12
Filing date: 2017-07-12
Publication date: 2019-01-22
Also published as: KR102193814B1

Abstract

본 발명은 기존의 소 태아 혈청(fetal bovine serum)을 대체할 수 있는 물질로 ITS (Insulin-transferrin-sodium selenite) 및 EGF (Epidermal growth factor)가 첨가된 소 수정란의 체외 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 소 수정란의 체외배양 방법에 관한 것이다. 본 발명의 ITS 및 EGF를 첨가한 체외 배양용 배지 조성물은 소의 수정란의 생산 효율 및 동결저항성을 향상시키며, 영양배엽의 침투능력을 증가시키는 등의 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 배지 조성물 및 이를 이용한 체외 배양 방법은 수정란의 질을 향상시키고, 궁극적으로 수정란 이식에 의한 수태율 향상에 크게 기여할 수 있다.

Description

ITS 및 EGF를 포함하는 소 수정란의 체외 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외 배양 방법{Culture medium comprising ITS and EGF, and method for in vitro culture of bovine embryo}

본 발명은 기존의 소 태아 혈청(fetal bovine serum)을 대체할 수 있는 물질로 ITS (Insulin-transferrin-sodium selenite) 및 EGF (Epidermal growth factor)가 첨가된 소 수정란의 체외 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 소 수정란의 체외배양 방법에 관한 것이다.

혈청은 배아영양조절인자(embryotrophic factor)들을 포함하고 있어 배양 배지에 널리 사용되어왔다. 혈청은 배 발달에 이상성 효과(biphasic effect)를 나타낸다. 즉, 혈청은 조기 분할(early cleavage)을 억제하지만, compaction의 시작부터 존재할 경우 발달을 가속화시킨다. 혈청은 항산화제, 성장인자, 중금속 킬레이터와 같은 배 발달에 유용한 물질들을 함유하고 있지만, 반대로 미성숙한 포배형성(blastulation), 과도한 지방 방울(lipid droplet) 축적 및 유전자 발현 변화를 유도함으로써 배의 질에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 혈청은 LOS (large offspring syndrome)에 기여하는 것으로 추정된다. 혈청은 화학적으로 명확히 정의되지 않은 첨가물(supplement)로, 곰팡이, 박테리아, 바이러스 및 마이코플라즈마에 의해 감염될 수 있다. 또한, 무혈청 상태에서 생산된 소의 배반포(blastocyst)는 혈청의 존재 하에 생산된 것보다 더 성공적으로 저온 보존(cryopreserved)되었다. 이러한 결과들은 배(embryo)의 배양 조건이 결과물인 배반포(blastocyst)의 질을 결정하는 중요한 요인이라는 점을 보여준다. 또한, 배아 냉동보존(embryo cryopreservation)의 효율은, 예를 들면 배지로부터 혈청을 제거하는 것과 같이, in vitro culture (IVC) 시스템을 변형함으로써 개선될 수 있다.

인슐린(Insulin)은 글루코스와 아미노산의 흡수를 촉진하는 폴리펩티드 호르몬이며, 유사분열 촉진 효과(mitogenic effects)를 나타낼 수 있다. 다수의 포유동물 종들의 착상 전 배아(preimplantation embryos)에 대한 in vitro 연구에 따르면 난관(oviduct)과 자궁(uterus)은 세포 증식과 착상 전 배아의 분화를 자극하는 성장 인자를 포함한다. 인슐린 및 인슐린-유사 성장 인자들은 배의 성장 및 대사에 중요한 역할을 한다. 트랜스퍼린(Transferrin)은 철 운반 단백질이며, 배지로부터 금속을 제거하는 해독 단백질(detoxifying protein)이기도 하다. 철은 필수 미량 원소(trace element)이지만, 자유 형(free form)에서는 독성을 나타낼 수 있다. 배양 중 세포에 영양을 공급하기 위해서는 혈청 내 트랜스퍼린에 결합되어 제공되어야 한다. 셀레늄(Selenium (Se))은 여러 생리작용을 위한 필수 미량 원소이며, 일반적으로 아셀렌산나트륨(sodium selenite)의 형태로 배양 배지에 첨가되어, 자유라디칼 생산을 감소시키고 지질 과산화를 억제함으로써 산화적 손상으로부터 세포를 보호하는 역할을 한다. 인슐린-트랜스퍼린-아셀렌산나트륨(Insulin-transferrin-sodium selenite; ITS)은 복합(complex) 및 비-복합 배지에 모두 사용될 수 있다. 일반적으로 ITS는 여러 포유류 종들의 배아 및 줄기세포의 in vitro 배양을 위한 첨가물로 사용된다.

표피성장인자수용체(Epidermal growth factor receptor; EGFR)는 여러 종들에서 체세포 분열 유도(mitogenesis), 발달 및 착상을 향상시킨다. 하기 7개의 리간드들이 포유류의 EGFR에 결합하여 이를 활성화시킨다: epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor-α (TGF-α), heparin-binding EGF-like growth factor, betacellulin, amphiregulin, epiregulin 및 epigen. 설치류의 배아에서 EGFR, 및 이의 리간드들 중 EGF 및 TGF-α의 기능적 역할이 잘 알려져 왔다. 마우스의 배아에서 EGF 및 TGF-α는 단백질 합성, 세포 수, cavitation 및 배 반포 확장(blastocyst expansion)의 비율을 증가시켰다. 또한, EGF 및 EGFR은 랫 및 마우스 배아의 착상 개시 시부터 관련되어 있었다.

축산업 분야에서 in vitro 배아 생산과 결합된 OPU (Ovum pick-up) 기술은 점점 더 상업화가 이루어져 가고 있다. 따라서 OPU-유래 배아의 착상율을 증가시키는 것은 성공적인 보조생식기술(assisted reproductive technology (ART))의 중요한 목표이다. 태반 발달(placental development)의 최초 단계는 착상(implantation) 과정에서 태아의 배반포의 영양외배엽(trophectoderm (TE)) 세포가 수용적인 모계의 자궁벽에 붙어서 침입할 때 일어난다. TE 세포가 모계의 자궁벽을 완전히 침입할 수 있는 능력에 결함이 발생한 것을 착상 실패의 주된 이유로 보고 있다. EGF는 소의 태반에서 발현되며 이러한 세포의 특성을 조절하는 것으로 보인다.

배아 냉동보존은 ART의 중요한 측면이며, 해동(thawing) 이후 배아의 높은 생존율을 보장하는 것을 목표로 한다. 배아 냉동보존 기술의 3개의 주요 카테고리는 완만동결(slow freezing), 급속동결(ultra-rapid freezing), 및 유리화(vitrification)이다. 완만동결은 세포 외부 및 내부 공간 사이의 유체의 교환으로 인해 평형동결(equilibrium freezing)로 알려져 있으며, 세포에 심각한 삼투 현상이나 변형을 일으키지 않는 안전한 방법이다. in vivo- 및 in vitro-유래 소 배아 모두에서 세포내 지질 함량은 낮은 해동 후(post-thaw) 생존율의 원인이 되기 때문에 냉동보존의 성공률은 세포질의 지질 함량과 밀접하게 관련되어 있는 것으로 보인다.

정의된(defined) 배지 첨가물들은 일부 세포 유형에 대해 상업적으로 이용가능하다. 하지만, 기업들은 그 제제(formulation)에 관해 제한된 정보만을 제공하므로, 이러한 첨가물들은 완전히 정의되기 어렵다.

이에 본 발명자들은 IVC 배지, modified synthetic oviduct fluid-bovine embryo 1 (SOF-BE1)에 ITS 및/또는 EGF를 첨가하여 그것들이 소 배아 발달에 미치는 유용한 효과를 in vitro로 실험하였다. 이를 위해, ITS, EGF, ITS+EGF, 또는 fetal bovine serum (FBS)을 첨가한 SOF-BE1 배지를 아무것도 첨가하지 않은 SOF-BE1 배지와 비교하였다. 그 결과 ITS 및 EGF를 첨가한 경우 배아 발달에 가장 유용한 효과를 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허공보 10-2005-0111086

Fields SD, et al. Fibroblast growth factor requirements for in vitro development of bovine embryos. Theriogenology. 2011;75(8):1466-75.

본 발명의 목적은 기존의 소 태아 혈청을 대체하는 효과를 나타내는 ITS (Insulin-transferrin-sodium selenite) 및 EGF (Epidermal growth factor)를 포함하는 소 수정란의 체외 배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 ITS 및 EGF를 포함하는 소 수정란의 체외 배양용 배지 조성물을 이용한 소 수정란의 체외 배양 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ITS (Insulin-transferrin-sodium selenite) 및 EGF (Epidermal growth factor)를 포함하는 소 수정란의 체외 배양용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지 조성물은 SOF-BE1 (modified synthetic oviduct fluid-bovine embryo 1) 배지를 기본배지로 하고, 여기에 ITS 및 EGF가 첨가된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 일반적으로 사용되는 체외 배양(IVC) 배지 또는 그 변형을 적절히 선택하여 기본배지로 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 ITS (Insulin-transferrin-sodium selenite) 및 EGF (Epidermal growth factor)를 포함하는 체외 배양용 배지는 FBS (fetal bovine serum)를 포함한 배지에 비하여 더 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였으므로, 상기 배지 조성물은 FBS (fetal bovine serum)를 포함하지 않는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지 조성물의 ITS는 인슐린이 5 μg/mL, 트랜스퍼린이 5 μg/mL 및 아셀렌산나트륨이 5 ng/mL의 농도로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 EGF는 배지 조성물에 100 ng/mL의 농도로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지 조성물은 영양막세포(trophoblast)의 침투 능력을 향상시키고, 배아의 세포질 내 지질 함량을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지 조성물은 MMP2, MMP9, ACSL3, ACADL, HMGCR, 및 IGF2R 의 발현을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지 조성물은 냉동 후 해동된(frozen-thawed) 배반포에서 SIRT1, SOD2, TFAM 및 BCL2 의 발현을 증가시키고, BAX 의 발현을 감소시킬 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 ITS (Insulin-transferrin-sodium selenite) 및 EGF (Epidermal growth factor)를 포함하는 소 수정란의 체외 배양용 배지 조성물에서 소의 체외 수정란을 체외 배양하는 것을 특징으로 하는 소 수정란의 체외 배양 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지 조성물은 SOF-BE1 (modified synthetic oviduct fluid-bovine embryo 1) 배지를 기본배지로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지 조성물의 ITS는 인슐린이 5 μg/mL, 트랜스퍼린이 5 μg/mL, 아셀렌산나트륨이 5 ng/mL의 농도로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 EGF는 100 ng/mL의 농도로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 체외 배양 방법에 사용되는 수정란은, 냉동 후 해동된(frozen-thawed) 소의 정자를 체외 수정(IVF) 배지에 희석시키는 단계; 상기 체외 수정 배지에 체외 성숙된 난자-난구세포 복합체(cumulus-oocyte complexes; COCs)를 첨가하는 단계; 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 체외 수정 방법에 의해 생산된 것일 수 있다.

본 발명의 ITS 및 EGF를 첨가한 체외 배양용 배지 조성물은 소의 수정란의 생산 효율 및 동결저항성을 향상시키며, 영양배엽의 침투능력을 증가시키는 등의 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 배지 조성물 및 이를 이용한 체외 배양 방법은 수정란의 질을 향상시키고, 궁극적으로 수정란 이식에 의한 수태율 향상에 크게 기여할 수 있다.

도 1은 8일째 소 배아를 Hoechst 33342로 염색하여 총 세포수를 측정하고, TUNEL을 수행하여 자가사멸 세포(apoptotic cells)를 관찰한 결과이다. 대응되는 이미지들을 결합하였다(merged). 배아는 (A-C) SOF+ITS+EGF 및 (A`-C`) SOF+FBS 그룹에서 배양하였다. Scale bar, 100 μm. 자가사멸세포를 흰색 화살로 표시하였다. (D) Hoechst 33342 염색으로 측정한 평균 총 세포수. (E) TUNEL에 의해 측정한 평균 총 자가사멸세포 수. 별표는 유의차를 나타낸다(P < 0.05).
도 2는 TE에 위치하는 CDX2 단백질(적색)을 나타내는 8일째 배반포의 면역형광 염색 결과이다. 핵은 DAPI로 파랗게 염색되었다. 배아는 (A-C) SOF+ITS+EGF 및 (A`-C`) SOF+FBS 그룹에서 배양하였다. 이미지는 공초점 현미경으로 찍었다. Scale bar, 100 μm.
도 3은 8일째 배반포에서 지질 염색의 형광 강도를 나타낸다. (A-C) SOF+ITS+EGF 및 (A`-C`) SOF+FBS 그룹에서 8일째 배반포의 NR 염색 결과. Scale bar, 100 μm. (C) ImageJ software로 분석된 배반포 당 지질 염색의 integrated optical density의 평균값. 별표는 유의차를 나타낸다(P < 0.05).
도 4는 배반포에서 미토콘드리아 염색의 형광 강도를 나타낸 것이다. (A-C) SOF+ITS+EGF 및 (A`-C`) SOF+FBS 그룹의 8일째 배반포의 MitoTracker Green 염색. (D) 배반포 당 미토콘드리아 염색의 integrated optical density의 평균값. 별표는 유의차를 나타낸다(P < 0.05).
도 5는 해동 후 24시간째 배아의 생존 및 부화율을 나타낸 것이다. (A) SOF+ITS+EGF 및 (A`) SOF+FBS 그룹에서의 생존 및 부화율을 보여주는 밝은 영역의 이미지(Bright field images). (B) 생존 및 부화율의 평균값. 별표는 유의차를 나타낸다(P < 0.05).
도 6은 영양막세포의 침투 및 이동 능력을 나타낸 결과이다. (A) SOF+ITS+EGF 및 (A`) SOF+FBS 그룹에서 침투 영역을 나타내는 밝은 영역의 이미지(Bright field images). (B) SOF+ITS+EGF 및 (B`) SOF+FBS 그룹에서 Hoechst 33342로 염색된 이동된 세포들. Scale bar, 100 μm. (C) 평균 침투 영역. (D) 이동된 세포 수의 평균. 별표는 유의차를 나타낸다(P < 0.05).
도 7은 배반포에서 여러 유전자들의 상대적인 mRNA 수준을 RT-qPCR로 측정한 결과이다. 8일째 배반포에서 (A) MMP2, (B) MMP9, (C) ACADL, (D) ACSL3, (E) HMGCR, 및 (F) IGF2R 의 상대적인 mRNA 수준. 냉동 후 해동된(frozen-thawed) 배반포에서 (G) SIRT1, (H) SOD2, (I) TFAM, (J) BCL2, 및 (K) BAX 의 상대적인 mRNA 수준. 별표는 유의차를 나타낸다(P < 0.05).
도 8은 침투 분석(invasion assay) 방법을 나타내는 그림이다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

실험 재료 및 방법

<1- 1> 시약

달리 기재하지 않는 한 모든 화합물 및 시약은 Sigma-Aldrich (St, Louis, MO, USA)에서 구입한 것을 사용하였다.

<1-2> 난모세포 수집

도살장에서 한우로부터 얻은 난소들을 수집하여 약 35℃에서 생리 식염수(0.9% NaCl)에 넣고, 도살 후 2시간 이내에 실험실로 옮겼다. 난소들을 신선한 Dulbecco’s phosphate-buffered saline (D-PBS)으로 세척하고, 진공펌프에 부착된 18-gauge 바늘을 이용하여 직경 2-8 mm의 여포(follicles)로부터 난자-난구세포 복합체(cumulus-oocyte complexes; COCs)를 회복시켰다. 흡출액(aspirated fluid)을 TL-HEPES 배지(114 mM sodium chloride, 3.2 mM potassium chloride, 2.0 mM sodium bicarbonate, 0.34 mM sodium biphosphate, 10 mM sodium lactate, 0.5 mM magnesium chloride, 2.0 mM calcium chloride, 10 mM HEPES, 1 μL/mL phenol red, 100 IU/mL penicillin 및 0.1 mg/mL streptomycin)가 담긴 접시에 분출시키고 입체현미경으로 관찰하였다. 체외 성숙(in vitro 성숙)을 위해, 세 겹(layers) 이상의 밀집 난구세포(compact cumulus cells)층을 갖는 class 1 및 class 2 COCs 및 균일 세포질(homogeneous cytoplasm)을 선별하였다. 상기 COCs를 TL-HEPES 배지에서 3회 세척하였다.

<1-3> 체외 성숙( In Vitro Maturation, IVM)

10% (v/v) FBS (Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, NY, USA), 1 μg/mL estradiol-17ß, 10 μg/mL follicle-stimulating hormone, 10 ng/mL EGF, 0.6 mM cysteine 및 0.2 mM sodium pyruvate를 첨가한 체외 성숙(in vitro maturation) (IVM) 배지(TCM-199)에서 상기 COCs를 3회 세척하였다[Mesalam A, Khan I, Lee K-L, Song S-H, Chowdhury MMR, Uddin Z, et al. 2-Methoxystypandrone improves in vitro-produced bovine embryo quality through inhibition of IKBKB. Theriogenology. 2017;99:10-20]. 50개까지 그룹을 이룬 COCs를 500μl의 IVM 배지가 담긴 4-well 접시(dish) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 옮긴 후 38.5℃에서 22-24시간 동안 5% CO₂농도로 습기찬 공기에서(humidified atmosphere of 5% CO₂in air) 배양하였다.

<1-4> 체외 수정( In Vitro Fertilization, IVF)

In vitro-성숙된 COCs를, 이전 연구에서 IVF용으로 실험되었던[상기 Mesalam A, et al. 2017. 참조], 냉동 후 해동된(frozen-thawed) 소의 정자로 수정시켰다. 냉동된 한우 수컷의 정액을 39℃의 수조에서 1분간 해동시키고, 운동성이 있는 정자를 D-PBS에서 원심분리(750×g, 실온에서 5분간)하여 수득하였다. 바닥으로부터 수집한 펠렛을 in vitro fertilization (IVF) 배지[6 mg/mL bovine serum albumin (BSA), 22 μg/mL sodium pyruvate, 100 IU/mL penicillin 및 0.1 mg/mL streptomycin이 첨가된 Tyrode lactate solution]에서 준비된 500 μl의 헤파린(heparin) (20 μg/mL)에 재현탁(re-suspended)하고, 38.5℃에서 15분간 5% CO₂ 농도로 습기찬 공기에서(humidified atmosphere of 5% CO₂in air) 배양하여, 수정능 획득(capacitation)을 촉진하였다. 이어서 정자를 적절한 부피의 IVF 배지에 희석시켜서 최종 농도를 1×10⁶sperm/mL 로 만들었다. 정자를 포함하는 IVF 배지 500μl 가 담긴 4-well 접시에, 50개까지 그룹을 이룬, 성숙된 COCs를 옮기고, 38.5℃에서 18-20시간 동안 5% CO₂농도로 습기찬 공기에서(humidified atmosphere of 5% CO₂in air) 배양하였다.

<1-5> 체외 배양( In Vitro Culture, IVC)

20분간 정자와 공동배양한 후에 피펫팅(pipetting)으로 난구세포(cumulus cell)들을 제거하고, 50개까지 그룹을 이룬 접합자(presumed zygote)들을 세척한 후, 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin 및 5 ng/mL sodium selenite 가 첨가되거나(SOF+ITS group), 100 ng/mL EGF가 첨가되거나(SOF+EGF group), ITS 및 EGF의 조합(combination)이 첨가되거나(SOF+ITS+EGF group), 또는 ITS 및 EGF 어느 것도 첨가되지 않은(SOF 및 SOF+FBS groups), 500 μl의 SOF-BE1 배지[Fields SD, Hansen PJ, Ealy AD. Fibroblast growth factor requirements for in vitro development of bovine embryos. Theriogenology. 2011;75(8):1466-75]가 담긴 4-well 접시로 처음 3일간 이동시켰다. 그 후 접합자(presumed zygote)들을 배 발달 8일째까지 같은 조성의 배지에서 배양하였으며, 위 배지는 SOF+FBS 그룹에서 BSA 가 10% (v/v) FBS로 대체된 것을 제외하고는, 모든 그룹에 대해 동일하였다. 8일째 배반포(blastocysts)를 TL-HEPES에서 3회 세척하고, 고정액(fixative)[1 M PBS에서 준비된 4% (v/v) paraformaldehyde]으로 옮긴 후, 세포를 셀 때까지 4℃에 저장하였다. mRNA 추출 및 유전자 발현 분석을 위해, 8일째 배반포(blastocysts)를 1.5-mL 에펜도르프 튜브에 옮기고(5 blastocysts/tube), 바로 액체질소에 동결(snap-frozen)시킨 후 mRNA 추출시까지 -80℃에 보관하였다.

<1-6> Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL)

In Situ Cell Death Detection Kit (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN, USA)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)을 수행하였다. 간략히 설명하면, 고정된 배아(n=30)를 1 M PBS에서 준비한 0.3% (w/v) polyvinylpyrrolidone (PVP) (PVP-PBS)로 두 번 세척하고, 실온에서 30분간 permeabilization시켰다[0.5% (v/v) Triton X-100 및 0.1% (w/v) sodium citrate]. permeabilization 후에 PVP-PBS로 배아를 두 번 세척하고, 암 조건에서 fluorescently conjugated terminal deoxynucleotide transferase dUTP와 함께 37℃로 1시간 동안 배양하였다. 그 후 TUNEL-염색된 배아를 PVP-PBS로 세척하고 10 μg/mL Hoechst 33342를 함유한 PVP-PBS에서 10분간 배양하였다. PVP-PBS로 세척한 후에, 배반포를 유리 슬라이드에 마운트하고(mounted) 핵의 배치(nuclear configuration)를 분석하였다. 수은 램프가 구비된 형광 현미경(epifluorescence microscope) (Olympus IX71, Tokyo, Japan)으로 Hoechst-염색된 세포들의 수를 세어 배반포 당 세포의 수를 측정하였다. TUNEL-양성 세포들은 선홍색(bright red)을 나타냈고, 이는 세포자멸사(apoptosis)가 일어났음을 의미한다.

<1-7> TE 및 ICM (Inner Cell Mass) 세포 수의 측정

8일째 소 배아(n=30)를 신선하게 준비된 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 용액에 실온에서 15분간 고정시켰다. 배아를 1 M PBS에서 준비된 ice-cold 0.2% (w/v) PVP로 3회 세척하고, 1 M PBS에서 준비된 0.25% (v/v) Triton X-100으로 실온에서 20분간 permeabilization시킨 후, 세척 버퍼[1 M PBS에서 준비된 0.1% (v/v) Tween 20 및 0.1% (w/v) BSA]로 세척하였다. 그 후, 배아를 실온에서 1시간 동안 blocking buffer (1 M PBS에서 준비된 5% BSA)와 함께 배양하고, 항-CDX2 항체와 함께 배양시켰다(4℃, overnight). 배아를 세척 버퍼에서 3회 세척한 후 tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC)-conjugated anti-mouse IgG [1 M PBS에서 준비된 0.1% (v/v) Tween 20 및 1% (w/v) BSA에서 1:100]와 함께 암 조건에서 실온으로 1시간 동안 배양하였다. 배아를 세척 버퍼에서 3회 세척한 후 핵 염색(nuclear stain) 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:100 [v/v] in D-PBS)과 함께 5분간 배양하였다. Prolong anti-fade 시약(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)과 함께 염색된 배아들을 유리 슬라이드 위에 마운트시키고, 공초점 레이저-스캐닝 Olympus Fluoview FV1000 현미경으로 관찰하였다.

<1-8> 세포질 내 지질 함량

세포내 지질에 특이적인 형광 염료인 Nile red (NR)를 사용하여 8일째 배반포의 지질 함량을 측정하였다(그룹당 30개의 배반포). 간략히 설명하면, dimethyl sulfoxide에서 1 mg/mL의 NR 스톡(stock) 용액을 준비하여 암 조건에서 실온으로 보관하였다. 고정된 8일째 배반포를 D-PBS로 3회 세척(각각 15분)한 후, 1 mg/mL PVP를 함유한 생리식염수(physiological saline) (0.9% NaCl)에 녹인 10 μg/mL NR로 3시간 동안 실온에서 암 조건으로 염색하였다. 그 후, 배아를 PVP-PBS로 세척하고, 10 μg/mL Hoechst 33342를 함유한 PVP-PBS에서 10분간 배양하였다. 그리고 나서, 배반포를 PBS로 2회 세척하고, 유리 슬라이드에 마운트하고 커버슬립(coverslips)을 덮었다. 공초점 레이저-스캐닝 Olympus Fluoview FV1000 현미경을 사용하여 지방 친화성(lipophilic) 형광 염료 NR을 여기(excite)시켰다(485 nm). 이미지 분석을 위해, 각각의 실험군 이미지로부터 배경 강도(background intensity)를 빼서 정규화한 후에 ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij)를 이용하여 적색 형광(lipids)의 강도를 측정하였다. 위 소프트웨어는 평균 픽셀 강도를 계산하였다. 데이터는 각각의 투사(projection)에 대해 두 개의 배경 영역의 평균에 대해 정규화하였다. 통계 분석을 위해 평균 강도가 고려되었다.

<1-9> 미토콘드리아 활성 분석

미토콘드리아 활성은 상용화된 키트(MitoTracker Green FM; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 분석하였다. 8일째 배반포(그룹당 30개의 배반포)를 125 nM MitoTracker Green FM 과 함께 5분간 배양하였다. 그 후, 배아를 PVP-PBS로 세척하고, 10 μg/mL Hoechst 33342를 함유한 PVP-PBS에서 10분간 배양하였다. 그 후 배아를 PBS-PVA로 두 번 세척하고, 유리 슬라이드에 마우트시키고, 공초점 레이저-스캐닝 Olympus Fluoview FV1000 현미경으로 조사하였다. 형광 여기 파장(fluorescence excitation wavelength)은 594 nm였고, 방출(emission)은 608 nm에서 읽었다. 이미지 분석을 위해, 각각의 실험군 이미지로부터 배경 강도(background intensity)를 빼서 정규화(normalization) 한 후에 ImageJ software를 이용하여 녹색 형광(미토콘드리아 활성)의 강도를 측정하였다.

<1-10> 침투 분석(Invasion Assay)

침투(invasion) 정량을 위하여, 8일째 배반포를 24-well tissue culture plates (Corning Costar Co., Cambridge, MA, USA)에서 8 μm-diameter pores를 가진 polyethylene terephthalate membranes을 포함하는 Matrigel invasion chamber inserts (6.4 mm; Corning Incorporated Life Sciences, Tewksbury, MA, USA)에 위치시켰다. 필터의 상부면(upper surface)을 Matrigel (20 μg/filter; Collaborative Research Co., Bedford, MA, USA)로 코팅한 후에 37℃에서 2시간 동안 배양하여 건조시켰다. 배반포(배아 생산시 사용된 배지와 동일한 배지에 현탁된 culture insert 당 3개의 배반포)를 Matrigel 로 코팅된 필터에 첨가하고, 37℃에서 72시간 동안 5% CO₂농도로 습기찬 공기에서(humidified atmosphere of 5% CO₂in air) 배양한 후에, 배양액의 바닥에 있는 배양배지[Shahbazi MN, Jedrusik A, Vuoristo S, Recher G. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nat Cell Biol. 2016;18(6):700-8]를 IVC1으로부터 IVC2로 바꾸고 매일 새롭게(refreshed) 하였다(도 8). 배양 후 10일이 지나서 위상차(phase-contrast) Olympus IX71 현미경으로 영양막세포(trophoblast)의 침투 영역을 조사하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 그 후 상기 chamber insert membrane의 상부면을 면봉으로 3회 문질렀다. 상기 문질러진 막의 하부면의 세포들은 4% 포르말린(formalin)으로 15분간 실온에서 고정된 후에 10 μg/mL Hoechst 33342로 10분간 염색되었다. 상기 막을 횡단하는 세포들의 수를 위상차 Olympus IX71 현미경(총 배율 100X) 아래에서 세었다.

<1-11> 배아 냉동보존(Cryopreservation) 및 해동(Thawing)

7일째 배반포를 1 M PBS (BSA-PBS)에서 준비된 0.5% (w/v) BSA로 3회 세척한 후에, 0.1 M sucrose 및 0.5% BSA와 함께 동결 방지제(cryoprotectant)로 1.8 M ethylene glycol을 사용하여 배아를 천천히 냉동시켰다. 배아를 냉동 용액(freezing solution)에서 10분간 유지시켜 균형을 맞춘 후, CL-8800i freeze control system (CryoLogic, Blackburn, Victoria, Australia)을 사용하여 0.25 mL straw에서 -6℃부터 -32℃까지 (-0.3℃/min) 천천히 냉동시켰다. 완만 동결(slow freezing)이 종료된 후에 위 straw를 액체질소에 위치시켰다. 배아를 해동하기 위하여, 위 straw를 공기에 약 10초간 노출시킨 후 37℃ 수조에 20초간 넣었다. 배반포 재확장(re-expansion)에 따른 생존율을 계산하기 위하여, 냉동 후 해동된(frozen-thawed) 배아를 38.5℃에서 24시간 동안 5% CO₂농도로 습기찬 공기에서(humidified atmosphere of 5% CO₂in air) 배양하였다.

<1-12> mRNA 추출 및 cDNA 역전사

Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit (Arcturus, Foster, CA, USA)를 제조사의 지시에 따라 사용하여, 8일째 배반포(blastocysts)/냉동 후 해동된 배반포(frozen-thawed blastocysts) (n = 30)의 4번의 생물학적 반복(four biological replicates)으로부터 총(Total) RNA를 추출하였다. RNA 농도 및 순도는 NANO DROP 2000c machine (Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 확인하였다. RNA 샘플은 즉시 사용되거나 사용될 때까지 -80℃에 보관되었다. mRNA 샘플은 Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA)의 키트를 제조사의 지시에 따라 사용하여 first-strand complementary DNA (cDNA)로 역전사하였다. cDNA 샘플은 qPCR에 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다.

<1-13> Quantitative Reverse Transcription PCR (RT-qPCR) 분석

GenBank에서 이용할 수 있는 선별된 유전자들의 mRNA 서열에 기초하여(표 1), Primer3plus 소프트웨어(http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)를 사용하여 qPCR 프라이머를 제작했다. cDNA 샘플들의 정량적 분석은 CFX98 장비(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 샘플들 사이에서 상대적인 GAPDH 발현이 크게 다르지 않다는 것을 확인한 후에, 독립적인 qPCR 분석을 통해 모든 전사체(transcripts)를 정량하였다. 결과의 재현성(reproducibility)을 향상시키기 위하여, 동일한 cDNA 출처로부터의 샘플들은 각각의 PCR 반응을 중복으로 수행하였다. 타겟 유전자들은 CFX manager V1.1 소프트웨어(Bio-Rad Laboratories , Hercules, CA, USA)를 사용하여 ΔΔc(t) 방법으로 정량하였다. qPCR에 의해 프로파일(profiled)된 모든 유전자들에 대해, 공식 “SD/mean × 100”에 따라 intra 및 inter-assay variance의 변동계수를 계산하였다. GAPDH를 참조 유전자로 사용하여 정규화(normalization)를 하였다.

<1-14> 통계분석

SPSS software v.18.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA)을 이용하여 통계분석을 수행하였다. 실험들은 6반복으로 진행되었고, 각각의 반복(replicate)은 같은 날 성숙한 난모세포를 사용하여 수행하였다. 총 세포, 세포자멸사(apoptosis) 세포 수 및 면역형광 염색은 각각의 그룹으로부터 임의로 선택된 배반포(각각의 반복당 약 5개의 배아)를 사용하여 측정하였다. one-way ANOVA를 사용하여 배아 발달(cleavage 및 blastocyst rates), 배반포의 질에 관한 데이터(즉. TE, ICM, ICM:TE cell ratio) 및 실험 그룹들 사이의 다양한 유전자의 발현 수준을 비교하였다. Duncan’s multiple range test를 사용하여 처리군(treatment groups)을 비교하였다. 데이터는 평균(mean) ± SEM (standard error of mean) 으로 표시하였다. 통계적 유의성의 수준은 P < 0.05로 설정하였다.

모든 실험은 국립경상대학교 축산학과의 동물실험윤리위원회의 승인된 가이드라인 및 규정(Approval ID: GAR-110502-X0017)에 따라 수행하였다.

<실시예 2>

착상 전 배아의 분열 및 배반포로의 발달 능력 측정

배양 3일째 배아 분열율(percentage of cleaved embryos)을 측정하였다. 그 결과 SOF+ITS, SOF+EGF, SOF+FBS 및 SOF 그룹(각각, 81.12 ± 1.98%, 80.25 ± 1.60%, 80.00 ± 1.69%, 및 79.86 ± 1.60%)에 비하여 SOF+ITS+EGF 그룹 (86.24 ± 0.64%)에서 분열율이 훨씬 더 높게 나타난 것을 확인하였다(P < 0.05)(표 2).

8일째 배반포의 비율(percentage of day 8 blastocysts)은 SOF+ITS+EGF 그룹(41.42 ± 0.86%)이 다른 그룹에 비해 훨씬 높게 나타났으며(P < 0.05), 이어서 SOF+FBS 및 SOF+ITS 그룹(각각 37.28 ± 1.41% 및 36.00 ± 0.47%), SOF+EGF 그룹(31.28 ± 0.89%), 및 SOF 그룹(24.70 ± 1.61%) 순이었다(표 2).

부화율(hatching rate)은 SOF+EGF, SOF+FBS 및 SOF+ITS 그룹(각각, 27.73 ± 2.03%, 25.71 ± 1.46%, 및 25.52 ± 2.09%)에 비해 SOF+ITS+EGF 그룹(43.76 ± 2.46%)에서 훨씬 더 높았고(P < 0.05), SOF 그룹(8.82 ± 2.66%)이 가장 낮았다(표 2).

상기 ITS + EGF 첨가에 의한 발달(development)의 향상이 배반포의 질(quality)에 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 배반포에서 총 세포수 및 apoptotic nuclei의 빈도를 측정하였다. 8일째 배반포에서 세포의 총 개수는 SOF+FBS 그룹(150.50 ± 15.35)에 비해 SOF+ITS+EGF 그룹(209.17 ± 17.07)에서 훨씬 더 높았다(P < 0.05). 반대로, 자가사멸 세포(apoptotic cell)의 빈도는 양 그룹간에 큰 차이가 없었다(도 1 참조).

<실시예 3>

TE 및 ICM (Inner Cell Mass) 세포의 수

배반포 당 총 세포 및 TE 세포의 수는 SOF+FBS 그룹(각각 169.67 ± 7.40 및 129.56 ± 4.42)에 비해 SOF+ITS+EGF 그룹(각각 210.08 ± 4.26 및 156.67 ± 6.59)이 상당히 높았다(P < 0.05) (표 3 및 도 2).

하지만, ICM (inner cell mass) 세포의 수는 두 그룹 사이에 큰 차이가 없었다(P > 0.05). The ICM:TE 세포 비율은 SOF+ITS+EGF 그룹(0.36 ± 0.06)이 SOF+FBS 그룹(0.31 ± 0.02)에서보다 더 높았으나, 유의적인 차이는 없었다.

<실시예 4>

지질 함량 및 미토콘드리아 활성

NR로 염색한 소 배아의 공초점 이미지는 지방 방울(lipid droplets)이 배반포 전체에 걸쳐 분포되어 있다는 것을 보여준다. ImageJ 소프트웨어에 의해 측정된 통합된 광학 강도(integrated optical intensity)는 SOF+FBS 그룹에서보다 SOF+ITS+EGF 그룹에서 배아의 세포질 내 지질 함량의 수준이 상당히 감소(P < 0.05)했다는 것을 보여준다(도 3).

그러나, 배반포의 미토콘드리아 형광 강도는 SOF+FBS 그룹에서보다 SOF+ITS+EGF 그룹에서 훨씬 더 높게 나타났다(P < 0.05) (도 4).

< 실시예 5>

IVP 유리화 소 배반포의 해동 후 생존율(Post-thaw Survival)

배반포의 해동 후 생존율(post-thaw survival rate)은 SOF+FBS 그룹에서 보다 SOF+ITS+EGF 그룹에서 훨씬 더 높았다(96.50% ± 7.00% vs. 46.00% ± 10.42%) (P < 0.05). 또한, 배반포 회복(recovery) 후 24시간째 부화율은 SOF+FBS 그룹(29.50% ± 4.12%)에서 보다 SOF+ITS+EGF 그룹(41.00% ± 8.29%)에서 훨씬 더 높았다(P < 0.05) (도 5).

<실시예 6>

영양막세포(Trophoblasts)의 침투 및 이동 능력

ImageJ 소프트웨어로 측정한 영양막세포의 침투 영역은 SOF+FBS 그룹에 비해 SOF+ITS+EGF 그룹이 훨씬 더 넓었다(242.22 ± 68.17 vs. 63.01 ± 17.92 × 10⁴μm²) (P < 0.05).

이와 유사하게, 이동한(migrated) 영양막세포의 수는 SOF+FBS 그룹에 비해 SOF+ITS+EGF 그룹이 훨씬 더 많았다(1,005.80 ± 90.40 vs. 262.80 ± 69.87) (P < 0.05) (도 6).

<실시예 7>

후보 유전자들의 mRNA 발현

정량적 역전사 PCR (Quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR)) 을 수행하여 여러 타겟 유전자[즉, matrix metalloproteinase-2 (MMP2), matrix metalloproteinase-9 (MMP9), acyl-coenzyme A dehydrogenase long-chain (ACADL), acyl-CoA synthetase long-chain family member 3 (ACSL3), hydroxymethylglutaryl-CoA reductase (HMGCR), insulin-like growth factor 2 receptor (IGF2R), sirtuin 1 (SIRT1), superoxide dismutase 2 (SOD2), transcription factor A mitochondrial (TFAM), B-cell lymphoma 2 (BCL2), 및 BCL2 associated X apoptosis regulator (BAX)]의 mRNA 발현 수준을 정량하였다. 상기 유전자들의 수준을 하우스키핑(housekeeping) 유전자인 GAPDH 에 대해 정규화하였다. 8일째 배반포에서 MMP2, MMP9, ACSL3, ACADL, HMGCR, 및 IGF2R 의 mRNA 수준은 SOF+FBS 그룹에 비해 SOF+ITS+EGF 그룹에서 훨씬 더 높았다(P < 0.05).

이와 유사하게, 냉동 후 해동된(frozen-thawed) 배반포에서 SIRT1, SOD2, TFAM 및 BCL2 의 mRNA 수준은 SOF+FBS 그룹에 비해 SOF+ITS+EGF 그룹에서 훨씬 더 높았으나(P < 0.05), BAX 의 mRNA 수준은 훨씬 더 낮았다(도 7).

상기 결과들은 IVC 배지에 FBS의 대체물로 ITS+EGF를 첨가할 경우, 영양막세포(trophoblast)의 침투 능력을 향상시키고, 지질 함량 감소를 통해 IVP 배아의 저온 내성(cryo-tolerance)을 증가시킴으로써 성공적으로 소 배아 발달을 유도할 수 있다는 것을 보여준다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

ITS (Insulin-transferrin-sodium selenite) 및 EGF (Epidermal growth factor)를 포함하는 소 수정란의 체외 배양용 배지 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배지 조성물은 SOF-BE1 (modified synthetic oviduct fluid-bovine embryo 1) 배지에 ITS 및 EGF가 첨가된 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배지 조성물은 FBS (fetal bovine serum)를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배지 조성물은 영양막세포(trophoblast)의 침투 능력을 향상시키고, 배아의 세포질 내 지질 함량을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배지 조성물은 MMP2, MMP9, ACSL3, ACADL, HMGCR, 및 IGF2R 의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배지 조성물은 냉동 후 해동된(frozen-thawed) 배반포에서 SIRT1, SOD2, TFAM 및 BCL2 의 발현을 증가시키고, BAX 의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
ITS (Insulin-transferrin-sodium selenite) 및 EGF (Epidermal growth factor)를 포함하는 소 수정란의 체외 배양용 배지 조성물에서 소의 체외 수정란을 체외 배양하는 것을 특징으로 하는 소 수정란의 체외 배양 방법.
제7항에 있어서,
상기 수정란은, 냉동 후 해동된(frozen-thawed) 소의 정자를 체외 수정(IVF) 배지에 희석시키는 단계; 상기 체외 수정 배지에 체외 성숙된 난자-난구세포 복합체(cumulus-oocyte complexes; COCs)를 첨가하는 단계; 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 체외 수정 방법에 의해 생산된 것을 특징으로 하는 방법.