KR20240062255A - Lr-bsa를 포함하는 소 수정란의 체외 배양요 배지 조성물 및 이를 이용한 체외 배양 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 기존의 소 태아 혈청(fetal bovine serum)을 대체할 수 있는 물질로 LR-BSA (Lipid-rich bovine serum albumin)가 첨가된 소 수정란의 체외 배양용 배지 조성물 및 이를이용한 소 수정란의 체외배양 방법에 관한 것이다. 본 발명의 LR-BSA 를 첨가한 체외 배양용 배지 조성물은 소의 수정란의 생산 효율을 향상 시키며, 수정란의 질적 향상에 이롭게 작용하는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 배지 조성물 및 이를 이용한 체외 배양 방법은 수정란의 질을 향상시키고, 궁극적으로 수정란 이식에 의한 수태율 향상에 크게 기여할 수 있다.
Description
본 발명은 LR-BSA를 포함하는 소 수정란의 체외 배양요 배지 조성물 및 이를 이용한 체외 배양 방법에 관한 것이다.
국내 축산업에 있어서 한우의 개량을 위한 수단으로 우수 종모축을 이용한 인공수정을 이용한 번식과 선발 및 교배를 이용해 왔으나 이러한 기술은 종모축 중심의 개량이라는 한계를 가지고 있다. 수정란 이식은 우수 유전 형질을 보유하고 있는 종빈축로부터 다량의 수정란를 확보하고 다른 개체에 이식하여 종모축 뿐만 아니라 모계로부터 우수한 유전 형질을 물려받은 개체를 효과적으로 증식시킬수 있고 형질이 동일한 다수의 자축을 단시간내에 생산이 가능한 기술이다. 한우의 경우 번식기간이 길고 생산되는 자손이 한정되어 있어 전체 우군을 개량하기 위해 많은 시간이 소요되기 때문에 선발된 종모우와 함께 우수한 암소 우군을 이용한 수정란 이식 기술의 도입으로 개량을 효과적으로 향상시킬 수 있을 것이다.
소의 체외수정란 생산기술(in vitro embryo production, IVP)은 개발 이후 지속적으로 최적화되고 있으며, OPU(ovum pick-up) 기술과 함께 체외수정란 생산기술은 선발된 종빈우로부터 수정란의 생산성을 증가시킬 수 있다. 생산된 체외 수정란은 대리모에 이식하여 산자 생산에 이용 가능하여 세대 간격을 줄일 수 있어 가축 개량에 효과적인 기술로 평가되고 있다. 특히 성판별 정액(sexed semen, SS) 과 유전체 선발(genomic selection, GS) 기술을 수정란 생산에 이용함으로써 IVP 기술의 상업적 활용이 증가하고 있다. 또한 복제, 형질전환 동물 및 배아줄기세포 생산 등 다양한 연구에 필요한 배아를 생산하기 위해 체외수정란 생산 기술이 이용되고 있다.
소 체외수정란의 생산 기술은 지난 수십 년 동안 꾸준히 향상되었지만 배반포발육율 25~35% 수준이며 이식 후 임신율은 여전히 체내에서 생산된 수정란보다 낮은 실정이다. 체외수정란 생산을 위한 배양액은 시험관 내 배아 발달에 영향을 미치는 가장 중요한 요소 중 하나이며, mSOF, CR1aa 및 CR2, KSOM, CZB, G1 및 G2, BECM 등 다양한 배양액들이 소 체외수정란을 생산하기 위하여 개발되었다. 특히 mSOF(modified synthetic oviduct fluid medium)는 소 체외수정(IVF; in vitro fertilization) 유래 수정란의 체외배양에 가장 효과적인 배양액으로 알려져 있다.
소 태아 혈청(FBS)은 일반적으로 성장 인자 및 에너지원을 공급하기 위해 소 체외수정란 생산을 위한 배양액에 이용하고 있다. 많은 연구에서 FBS 첨가가 수정란의 체외 발육에 효과적이라고 보고하고 있으나, FBS의 조성이 명확히 알려져 있지 않고 배치마다 성분이 다를 수 있으며, 특히 거대산자증후군(large offspring syndrome, LOS)의 발병률을 증가시킬 수 있다는 단점을 가지고 있다. 지난 수 년간 serum-free 체외 배양액 개발을 위하여 많은 연구들이 진행되었다. 알부민은 pH 완충, 세포막 안정화, 계면활성제 작용, 영양원으로 아미노산 공급과 생존에 필요한 다양한 요소 및 화합물(아미노산, 비타민, 지방산, 호르몬, 성장 인자 등)을 운반함으로써 수정란의 발달에 중요한 역할을 가지고 있다. 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)과 ITS(insulin, transferrin and selenium)은 소 체외수정란 생산을 위한 배양액 내 혈청 보충을 위한 대체 물질로 이용하였으며,BSA 및 ITS가 포함된 mSOF 배양액으로 소 체외 수정란 생산이 가능한 것으로 확인되었다.
Knockout serum replacement (KSR)은 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC)를 배양하기 위한 배양액에 사용되는 FBS를 대체하기 위하여 개발되었으며, 배아줄기세포주 확립, 세포 동결 및 배반포 주입을 통한 키메라 생산 등 ESC을 활용하기 위한 다양한 방법에 이용할 수 있다.KSR에 다양한 유기분자들과 미량원소 및 3종의 단백질(insulin, transferrin, lipid-rich albumin)로 구성되어 있으며, FBS에 함유되어 있는 미지의 성장 인자나 분화 촉진 인자들은 포함되어 있지 않다. Hoelkeret al. (2009) 은 소 IVP 시스템에서 정의된 배양 배지(defined culture media)에 KSR의 첨가는 배반포기까지의 수정란발육을 방해하지 않기 때문에 FBS 대체물로 사용할 수 있음을 보고하였다.
이에 본 발명자들은 체외배양액에 LR-BSA를 첨가하여 소 배야 발달에 미치는 유용한 효과를 실험한 결과, LR-BSA를 첨가한 경우 배아 발달에 유용한 효과를 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 기존의 소 태아 혈청을 대체하는 효과를 내는 LR-BSA (Lipid-rich bovine serum albumin)을 포함하는 소 수정란의 체외 배양요 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 LR-BSA (Lipid-rich bovine serum albumin)를 포함하는 소 수정란의 체외 배양용 배지 조성물을 이용한 소 수정란의 체외 배양 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 LR-BSA (Lipid-rich bovine serum albumin)을 포함하는 소 수정란의 체외 배양용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 mSOFaa 배양액을 기본배지로 하고, 여기에 LR-BSA (Lipid-rich bovine serum albumin)가 첨가된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 일반적으로 사용되는 체외 배양(IVC) 배지 또는 그 변형을 적절히 선택하여 기본배지로 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 LR-BSA (Lipid-rich bovine serum albumin)를 포함하는 체외 배양용 배지는 FBS (fetal bovine serum)를 포함한 배지에 비하여 더 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였으므로, 상기 배지 조성물은 FBS (fetal bovine serum)를 포함하지 않는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 LR-BSA (Lipid-rich bovine serum albumin)는 배지 조성물에 2.5mg/ml의 농도로 첨가 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지 조성물은 배반포 생산성이 향상시키고, 세포수를 증가 시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지 조성물은 Oct4, Sox2 및 Plac8의 발현을 증가시킬 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 LR-BSA (Lipid-rich bovine serum albumin)을 포함하는 소 수정란의 체외 배양용 배지 조성물에서 소외 체외 수정란을 체외 배양하는 것을 특징으로 하는 소 수정란의 체외 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지 조성물은 mSOFaa 배양액을 기본 배지로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예 있어서, 상기 LR-BSA (Lipid-rich bovine serum albumin)는 배지 조성물에 2.5mg/ml의 농도로 첨가 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 LR-BSA를 첨가한 체외 배양용 배지 조성물은 배반포 생산성을 향상 시키고, 세포수를 증사키기고, 이로운 유전자의 발현을 증가시키는 효과가 있는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 배지 조성물 및 이를 이용한 체외 배양 방법은 수정란의 질을 향상시키고, 궁극적으로 수정란 이식에 의한 수태율 향상에 크게 기여할 수 있다.
도 1은 LR-BSA가 배반포의 부화율의 미치는 영향을 관찰한 결과이다. 부화율은 부화한 배반포 대 배반포의 비율로 계산하였다.
도 2는 IVC 8일째의 배반포에서 TUNEL을 수행하여 자가사멸 세포(apoptotic cells)를 관찰한 결과이다. 배반포에의 세포 사멸 세포는 TUNEL 키트와 DNA를 사용하여 분석되었으며, fragmented DNA는 각각 DAPI(파란색) 및 TdT(녹색)로 염색 되었다.
도 3은 소 배반포에서 총 세포 수(A) 및 세포 사멸 세포 지수(B)를 관찰한 결과이다. 배반포의 세포 사멸 세포는 TUNEL 키트를 사용하여 분석되었다.
도 4는 다른 배양 조건에서 유래된 소 배반포의 상대적 유전자 발현을 관찰한 결과이다.
도 2는 IVC 8일째의 배반포에서 TUNEL을 수행하여 자가사멸 세포(apoptotic cells)를 관찰한 결과이다. 배반포에의 세포 사멸 세포는 TUNEL 키트와 DNA를 사용하여 분석되었으며, fragmented DNA는 각각 DAPI(파란색) 및 TdT(녹색)로 염색 되었다.
도 3은 소 배반포에서 총 세포 수(A) 및 세포 사멸 세포 지수(B)를 관찰한 결과이다. 배반포의 세포 사멸 세포는 TUNEL 키트를 사용하여 분석되었다.
도 4는 다른 배양 조건에서 유래된 소 배반포의 상대적 유전자 발현을 관찰한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1] 실험 재료 및 방법
1.1 체외수정란 생산
1.1.1 난포란의 채취 및 성숙배양
도축장에서 도살된 암소의 난자를 회수하여 30-35℃의 생리식염수 용액에 넣어 실험실로 운반한 후 직경이 2-7mm의 난포로부터 미성숙 난자를 채취하고 난구세포와 세포질이 균질한것만을 선별하여 난자성숙에 이용하였다. 난포란(COCs)의 성숙배양은 TCM-199 배양액에 10% FBS(Gibco-BRL, NY, USA), 0.2mM Na-pyruvate, 50㎍/ml gentamycin(Sigma, ST Louis, MO, USA) 및 호르몬(FSH 0.02U/ml, LH 5㎍/ml 와 Estradiol 1㎍/ml; Sigma)이 함유된 성숙배양액으로, 5% CO2, 5% O2, 38.5℃ 조건으로 20-22시간 배양하였다.
1.1.2 체외 수정
성숙배양이 끝난 난자는 동결정액을 이용하여 체외수정을 실시하였으며, 기본 배양액으로 IVF100 medium (Research Institute for the Functional Peptides, Yamagata, Japan)을 변형하여 사용하였다. 동결정액은 37℃에서 45초 동안 융해하고 Percoll을 이용하여 800×g 에서 7분간 원심분리하여 세척하였다. 수정에 필요한 활성화 정자의 농도는 1×106개/ml로 조정하여 정자 pellet을 희석한 후, 체외 성숙란 1개당 활력이 우수한 정자의 수가 5~10×103개가 함유되도록 20㎕ 정자 부유액을 난자가 포함된 80㎕ 소적에 첨가하였다. 체외 수정시간은 18시간으로 조정하며 수정된 난자를 체외 배양하기 위하여 COCs를 300IU hyaluronidase를 이용하여 난구세포를 제거하였다.
1.1.3 체외 배양
체외수정을 실시한 후 난구세포가 제거된 난자를 실험설계에 따라 제조한 배양액에서 9일동안 5% CO2, 5% O2, 38.5℃ 조건으로 배양하였다.
1) 대조구: 5% FBS가 첨가된 mSOFaa 배양액
2) 1.0LR-BSA: 1.0mg/ml LR-BSA이 첨가된 mSOFaa 배양액
3) 2.5LR-BSA: 2.5mg/ml LR-BSA이 첨가된 mSOFaa 배양액
4) 5.0LR-BSA: 5.0mg/ml LR-BSA이 첨가된 mSOFaa 배양액
1.2 수정란 발육 효율 분석
수정 후 배양 3일, 5일 및 7일에 수정란의 발생단계를 난할율, 8세포기, 상실기 및 배반포 형성율을 분석하였으며, 배양 8일째에 배반포와 탈출 배반포 비율을 분석하였다.
1.3 수정란의 질적 분석
1.3.1 Apoptosis 분석 (TUNEL assay)
배양 6일차 배반포는 PBS로 세척 후 4% paraformaldehyde 액으로 4℃에서 24시간동안 고정하였다. 0.5% Triton X-100으로 permeabilization 후 in situ cell death detection kit (TMR red, Roche)으로 39℃ 조건에서 1시간 동안 반응시켜 apoptotic cell을 염색하였다. 이후 10?g/ml Hoechest 33342가 함유된 Prolong antifade Kit (Molecular Probes)을 이용하여 슬라이드에 고정하였으며, 전체 세포수와 apoptotic cell은 epifluorescent microscope를 이용하여 검사하였다.
1.3.2 수정란의 유전자 발현 양상 분석
배양 8일차에 생성된 배반포에 대하여 FastLane Cell cDNA Kit (Qiagen, Valencia, USA)을 이용하여 cDNA를 제공된 방법에 따라 준비한다. Real-Time RT-PCR은 Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit (Qiagen, USA) 및 Real-Time PCR System (Life Technologies, USA)를 이용하여 분석하였다. 특정 유전자의 발현을 분석하기 위하여 사용된 프라이머는 Table 1에 정리하였다. Real-Time RT-PCR의 증폭조건은 95℃에서 1분간 pre-incubation 과정을 거친 후 95℃에서 15초 동안 denaturation 후 60℃에서 1분간 annealing의 과정을 40회 반복하도록 조작하였다. 각 유전자에 대한 발현량은 2ΔΔCT 방법을 이용하여 비교하였다.
| Gene | Primer sequences (5' to 3') | Product size (bps) | References |
| Oct4 | F-CCACCCTGCAGCAAATTAGC | 68 | NM_174580 |
| R-CCACACTCGGACCACGTCTT | |||
| SOX2 | F-GGTTGACATCGTTGGTAATTTATAATAGC | 88 | NM_001105463 |
| R-CACAGTAATTTCATGTTGGTTTTTCA | |||
| PLAC8 | F-CGGTGTTCCAGAGGTTTTTCC | 163 | NM_016619 |
| R-AAGATGCCAGTCTGCCAGTCA | |||
| 18S rRNA | R-AAGATGCCAGTCTGCCAGTCA | 87 | AF176811.1 |
| R-GCTGCTGGCACCAGACTTG |
1.4 통계분석
모든 결과에 대해 Statistical Analysis System(SAS Institute, Inc., USA)의 General Linear Models 절차를 이용한 Duncan's multiple range test로 유의성을 검토하였다
[실시예 2] 결과 및 고찰
2.1 소 체외수정란 발육에 있어서 LR-BSA의 효과
본 연구는 LR-BSA 첨가가 소 채외수정란의 체외 발육에 미치는 영향을 검토하기 위하여 수행하였으며, 결과를 Table 2에 나타내었다. 체외수정 후 2일차에 수정란의 분할율을 검토한 결과, 무첨가 처리구에서는 67.59% (73/108)로 나타났으며, 처리구에서는 65.63~73.28로 처리에 따른 유의적 차이는 없어 LR-BSA 처리에의해 수정 후 수정란의 초기 난할에 미치는 영향이 없음을 확인하였다. 1.0LR-BSA 처리구에서 fragment 난자가 14.84% (19/128)로 가장 높게 나타났으나 대조구와의 유의적인 차이는 없었다. 상실배(morula) 발달율은 2.5LR-BSA 처리구에서 36.11%(39/111)로 대조구의 27.00%(27/108)와 1.0LR-BSA 처리구의 25.39%(28/128)보다 유의적으로 높게 나타났으며(P<0.05), 5.0LR-BSA 처리구의 28.44%(31/116)와 비교하였을 경우 다소 높게 나타났으나 유의성은 인정되지 않았다. 배반포(blastocyst) 발달율은 체외수정 후 배양 7~9일차에 형성된 배반포를 이용하여 분석하였다. 2.5LR-BSA 처리구에서 배반포 발달율은 33.33%(36/111)로 대조구의 26.00%(26/108)와 1.0LR-BSA 처리구의 22.94%(25/128) 및 5.0LR-BSA 처리구의 2.61%(29/116) 보다 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05).
| Treatments | No. of embryos | No. (%) of embryos developed to | |||
| 2-Cell | Fragment | Morula | Blastocyst | ||
| Control | 108 | 73 (67.59) | 8 (7.41) | 27 (27.00) | 26 (26.00) |
| 1.0LR-BSA | 128 | 84 (65.63) | 19 (14.84) | 28 (25.69) | 25 (22.94) |
| 2.5LR-BSA | 111 | 81 (68.07) | 11 (9.24) | 39 (36.11) | 36 (33.33) |
| 5.0LR-BSA | 116 | 85 (73.28) | 7 (6.03) | 31 (28.44) | 29 (26.61) |
배양 9일차에 발육된 배반포의 해칭율(탈출배반포율)을 분석하여 도 1에 나타내었다. 대조구의 해칭율은 69.23± 2.34%(18/26)로 나타났으며, 1, 2.5, 5.0 LR-BSA 처리구에서는 각각 84.00± 3.14%(21/25), 80.56± 2.64%(29/36) 및 82.76± 3.89%(24/29)로 모든 LR-BSA 처리구가 대조구보다 유의적으로 높게 나타났다(p<0.05). LR-BSA 처리구 간 유의성은 인정되지 않았으나 대조구에 비해 LR-BSA 처리가 배반포해칭에 이로운 영향을 미치는 것으로 확인되었다.
2.2 LR-BSA의 첨가가 소 배반포의세포수 및 세포사에 미치는 영향
세포사(apoptosis)에 의한 배반포의 세포를 검사하기 위하여 배양 9일차 배반포를 이용하여 TUNEL 분석을 하였으며, 동시에 배반포의 전체 세포수를 분석하였다(도 2와 3). 발달 상태를 비교한 결과 모든 LR-BSA 처리구에서 2세포기 이후 수정란의 발육이 다소 빠르게 진행되는 것으로 나타났으며, 2.5LR-BSA 처리구에서 배반포의 세포수가 유의적으로 높게 나타났다(p<0.05). Apoptotic cell index를 검토한 결과, 모든 LR-BSA 처리구에서 대조구보다 다소 높게 나타났으나, 유의적인 차이는 없어 LR-BSA 처리가 수정란의 발달에 영향을 미치지만 세포사에는 영향이 없음을 확인하였다.
2.3 LR-BSA의 첨가가 소 배반포의 유전자 발현에 미치는 영향
난자의 질과 연관된 유전자들(oct4, plac8 및 sox2)의 발현을 확인하기 위하여 Real time RT-PCR을 실시하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. Oct4의 경우 1.0LR-BSA 처리구는 대조구보다 유의적으로 낮게 발현되었으며, 5.0LR-BSA 처리구에서는 대조구와 발현 차이가 없었다. 하지만 2.5LR-BSA 처리구는 대조구를 포함하여 다른 모든 처리구에서보다 유의적으로 높게 나타났다(p<0.05). Sox2의 경우 대조구에서 모든 LR-BSA 처리구보다 유의적으로 낯게 나타났으며(p<0.05), 처리리구 중 2.5LR-BSA 처리구가 가장 높게 발현되었다(p<0.05).
PLAC8 유전자는 수정란의 생존과 관련된 중요한 표지자로 체외수정란 생산 프로그램에서 질을 예측하기 위해 주로 사용된다. 가축의 경우 PLAC8 유전자는 잘 정립된 경로가 없으나, 모체-태자 상호작용에 중요한 역할을 가지고 있어 그 발현이 태반 발달에 관여하는 것으로 알려져 있다. 임신에 성공한 소의 배반포에서는 유산되어 재흡수된배반포에 비해 높은 유전자 발현이 보고되었으며, 임신한 소의 자궁내막은 비임신 소에 비해 유전자 발현이 높은 것으로 보고되었다. 본 연구에서는 2.5LR-BSA 및 5.0LR-BSA 처리구가 대조구 및 1.0LR-BSA 처리구보다 유의적으로 높게 발현되었다(p<0.05). 따라서 소 체외수정란 생산을 위한 배양액에 LR-BSA 첨가는 발달된 수정란의 질적 향상에 도움이 되는 것으로 생각된다.
소 수정란을 이용한 연구에서는 LR-BSA 첨가가 배반포의 동결 융해 후 생존율을 향상시키는 것으로 보고되었으며, 본 연구를 통해 소 수정란의 생산효율과 함께 수정란의 질적 향상에 이롭게 작용하는 것을 확인하였다. 특히 체외 배양액 내에 2.5mg/ml LR-BSA를 첨가하였을 경우 배반포 생산성이 향상되었을 뿐만 아니라, 세포수 증가와 이로운 유전자의 발현이 증가하여 생산된 배반포가 질적으로 향상된다는 것을 확인하였다. 따라서 수정란 이식기술과 함께 본 연구에서 확립한 체외수정란 배양체계는 한우 개량을 위해 매우 효율적인 수단으로 활용될 수 있을 것이다.
Claims (6)
- LR-BSA (Lipid-rich bovine serum albumin)을 포함하는, 소 수정란의 체외 배양용 배지 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 배지 조성물은 mSOFaa 배양액에 LR-BSA (Lipid-rich bovine serum albumin)를 첨가하는, 소 수정란의 체외 배양용 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 배지 조성물은 FBS (fetal bovine serum)를 포함하지 않는, 소 수정란의 체외 배양용 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 배지 조성물은 배반포 생산성이 향상시키고, 세포수를 증가 시키는, 소 수정란의 체외 배양용 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 배지 조성물은 Oct4, Sox2 및 Plac8의 발현을 증가시키는, 소 수정란의 체외 배양용 배지 조성물. - LR-BSA (Lipid-rich bovine serum albumin)을 포함하는 소 수정란의 체외 배양용 배지 조성물에서 소외 체외 수정란을 체외 배양하는 것을 특징으로 하는 소 수정란의 체외 배양 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220141532A KR20240062255A (ko) | 2022-10-28 | 2022-10-28 | Lr-bsa를 포함하는 소 수정란의 체외 배양요 배지 조성물 및 이를 이용한 체외 배양 방법 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220141532A KR20240062255A (ko) | 2022-10-28 | 2022-10-28 | Lr-bsa를 포함하는 소 수정란의 체외 배양요 배지 조성물 및 이를 이용한 체외 배양 방법 |
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR20190007326A (ko) | 2017-07-12 | 2019-01-22 | 경상대학교산학협력단 | Its 및 egf를 포함하는 소 수정란의 체외 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외 배양 방법 |
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2022
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| KR20190007326A (ko) | 2017-07-12 | 2019-01-22 | 경상대학교산학협력단 | Its 및 egf를 포함하는 소 수정란의 체외 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외 배양 방법 |
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