CN112305115B - 一种检测二氟泼尼酯眼用乳剂中的降解杂质及其含量的高效液相色谱方法 - Google Patents

一种检测二氟泼尼酯眼用乳剂中的降解杂质及其含量的高效液相色谱方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112305115B
CN112305115B CN202011182808.8A CN202011182808A CN112305115B CN 112305115 B CN112305115 B CN 112305115B CN 202011182808 A CN202011182808 A CN 202011182808A CN 112305115 B CN112305115 B CN 112305115B
Authority
CN
China
Prior art keywords
alpha
solution
difluprednate
mobile phase
elution time
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011182808.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112305115A (zh
Inventor
文路乔
宋德兰
徐欣
叶翔
庄昌萌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nuofeng Pharmaceutical Chengdu Co ltd
Original Assignee
Nuofeng Pharmaceutical Chengdu Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nuofeng Pharmaceutical Chengdu Co ltd filed Critical Nuofeng Pharmaceutical Chengdu Co ltd
Priority to CN202011182808.8A priority Critical patent/CN112305115B/zh
Publication of CN112305115A publication Critical patent/CN112305115A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112305115B publication Critical patent/CN112305115B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/36—Control of physical parameters of the fluid carrier in high pressure liquid systems
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/74—Optical detectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
    • G01N30/8679—Target compound analysis, i.e. whereby a limited number of peaks is analysed
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N2030/042—Standards

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Library & Information Science (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了一种测定二氟泼尼酯眼用乳剂中的降解杂质及其含量的高效液相色谱方法，包括以下步骤：(1)样品溶液的制备：取二氟泼尼酯眼用乳剂，加溶剂溶解配制样品溶液；(2)标准品溶液的制备：称取二氟泼尼酯标准品，加溶剂溶解配制标准品溶液；(3)将样品溶液和标准品溶液分别注入高效液相色谱仪，梯度洗脱，进行检测和计算。本发明方法专属性强，精密度高且回收率高，是检测二氟泼尼酯眼用乳剂中降解杂质及其含量的有效方法，具有应用前景。

Description

一种检测二氟泼尼酯眼用乳剂中的降解杂质及其含量的高效 液相色谱方法
技术领域
本发明属于化学分析技术领域，具体涉及一种测定二氟泼尼酯眼用乳剂中的降解杂质及其含量的高效液相色谱方法。
背景技术
二氟泼尼酯眼科乳剂是一种用于的无菌、外抗炎皮质类固醇。它的化学名称是6-3,9二氟-11,17,21-三羟基孕烯-1,4-二烯-3,20-二酮21-乙酸17-丁酸酯(CAS编号23674-86-4)。每毫升乳剂含活性成分二氟泼尼酯0.5mg(0.05％)；非活性成分：硼酸、蓖麻油、甘油、聚山梨酯80、注射用水、醋酸钠、依地酸二钠、氢氧化钠，并含有防腐剂山梨酸。
二氟泼尼酯眼科乳剂的降解杂质主要包括以下五种：
Difluoroprednisolone(CAS:806-29-1)，
Difluoroprednisolone 17-Acetate(CAS:23674-85-3)，
Difluoroprednisolone 21-Acetate(CAS:52-70-0)、
Difluoroprednisolone 17-Butyrate(CAS:23640-96-2)，
Difluoroprednisolone 21-Butyrate(CAS:N/A)
上述五种降解杂质均是在原料药(Active Pharmaceutical Ingredient，API) 合成过程中产生的，在研制成成品制剂后，在放置过程中主成分会有不同程度的降解，根据ICH Q3B的要求，需对其降解出来的杂质进行定性及定量，即作为特定杂质控制，同时监测产品质量。故对二氟泼尼酯眼用乳剂中降解杂质的含量进行有效准确的监测是非常有必要的。
目前暂没文献报道同时检测二氟泼尼酯眼用乳剂中5种降解杂质的含量的方法，而且其中的Difluoroprednisolone杂质的色谱峰容易与辅料峰发生重叠，影响检测。因此，提供一种能够同时、准确检测二氟泼尼酯眼用乳剂中 5种降解杂质的含量的方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测二氟泼尼酯眼用乳剂中降解杂质的方法，所述降解杂质包括Difluoroprednisolone、Difluoroprednisolone 17-Acetate、Difluoroprednisolone 21-Acetate、Difluoroprednisolone 17-Butyrate、Difluoroprednisolone 21-Butyrate，包括以下操作步骤：
(1)样品溶液的制备：取待检二氟泼尼酯眼用乳剂，加溶剂溶解配制样品溶液；
(2)将样品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：流动相A为乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序如下：
洗脱时间0min，25％～35％的流动相B
洗脱时间6min，25％～35％的流动相B
洗脱时间25min，40％～50％的流动相B
洗脱时间35min，40％～50％的流动相B
洗脱时间40min，25％～35％的流动相B
洗脱时间50min，25％～35％的流动相B
本发明还提供了一种检测二氟泼尼酯眼用乳剂中降解杂质含量的高效液相色谱方法，所述降解杂质包括Difluoroprednisolone、Difluoroprednisolone 17-Acetate、Difluoroprednisolone 21-Acetate、Difluoroprednisolone 17-Butyrate、Difluoroprednisolone 21-Butyrate，包括以下操作步骤：
(1’)样品溶液的制备：取待检二氟泼尼酯眼用乳剂，加溶剂溶解配制样品溶液；
(2’)标准品溶液的制备：称取二氟泼尼酯标准品，加溶剂溶解配制标准品溶液；
(3’)将样品溶液和标准品溶液分别注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：流动相A为乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序如下：
洗脱时间0min，25％～35％的流动相B
洗脱时间6min，25％～35％的流动相B
洗脱时间25min，40％～50％的流动相B
洗脱时间35min，40％～50％的流动相B
洗脱时间40min，25％～35％的流动相B
洗脱时间50min，25％～35％的流动相B
(4’)根据检测结果计算得到二氟泼尼酯眼用乳剂中5种降解杂质的含量，计算公式如下：
Figure BDA0002750676580000021
其中，Aspl为测得的样品溶液的峰面积；
Astd为标准品溶液重复测量5次的峰面积的平均值；
Wstd为标准品溶液中二氟泼尼酯的质量，以mg计；
Dstd为标准品溶液的稀释倍数；
Dspl为样品溶液的稀释倍数；
L为样品溶液的标示量，以mg计；
P为二氟泼尼酯标准品的纯度以mg/mg计；
RRF是杂质的相对响应因子。
所述杂质的相对响应因子的值如下：
Difluoroprednisolone的相对响应因子为：1.41；
Difluoroprednisolone 17-Acetate的相对响应因子为：1.22；
Difluoroprednisolone 21-Acetate的相对响应因子为：1.26；
Difluoroprednisolone 17-Butyrate的相对响应因子为：1.05；
Difluoroprednisolone 21-Butyrate的相对响应因子为：1.12。
进一步地，上述方法中，步骤(1)，和/或步骤(1’)，和/或步骤(2’) 所述溶剂为乙腈。
进一步地，上述方法中，步骤(2)和/或步骤(3’)中，所述乙酸铵溶液的浓度为0.01～0.03mol/L，pH为3～4；优选为浓度0.02mol/L，pH为3.5。
进一步地，上述方法中，步骤(2)和/或步骤(3’)中所述色谱柱规格为内径4.6mm，长度150mm，填料粒径3.5μm；优选的色谱柱型号为SVEA C18 Cold色谱柱。
进一步地，上述方法中，步骤(2)和/或步骤(3’)中所述梯度洗脱程序为：
洗脱时间0min，30％的流动相B
洗脱时间6min，30％的流动相B
洗脱时间25min，45％的流动相B
洗脱时间35min，45％的流动相B
洗脱时间40min，30％的流动相B
洗脱时间50min，30％的流动相B
进一步地，上述方法中，步骤(2)和/或步骤(3’)中所述色谱条件还包括：柱温为25～35℃，优选为30℃；流速为0.5～1.5mL/min，优选为1.0 mL/min；样品盘温度为5℃，检测波长为254nm。
进一步地，上述方法中，步骤(2)和/或步骤(3’)中的样品溶液和标准品溶液进样量分别为5～15μL，优选为10μL。
实验结果表明，本发明的检测方法检测降解杂质的专属性强，精密度高且回收率高，在0.2μg/mL～5μg/mL范围内具有良好的线性，是检测二氟泼尼酯眼用乳剂中降解杂质含量的有效方法。
本发明所指的降解杂质Difluoroprednisolone、Difluoroprednisolone 17-Acetate、Difluoroprednisolone 21-Acetate、Difluoroprednisolone 17-Butyrate、Difluoroprednisolone 21-Butyrate分别为表1所示物质：
表1各降解杂质的定义
Figure BDA0002750676580000041
Figure BDA0002750676580000051
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为对照品溶液的高效液相色谱图。
图2为样品溶液的高效液相色谱图。
图3为定位溶液的高效液相色谱图。
图4为各杂质和二氟泼尼酯主成分的线性拟合曲线示意图。
图5为样品加标溶液的高效液相色谱图。
图6为安慰剂溶液的高效液相色谱图。
图7为酸降解后的样品的高效液相色谱图。
图8为碱降解后的样品的高效液相色谱图。
图9为氧化降解后的样品的高效液相色谱图。
图10为高温降解后的样品的高效液相色谱图。
图11为光降解后的样品的高效液相色谱图。
具体实施方式
本发明所用实验原料均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1、本发明测定二氟泼尼酯眼用乳剂中降解杂质含量的方法
(1)标准品溶液的制备：称取25mg二氟泼尼酯标准品，精密称量，至 50mL容量瓶中，用乙腈使其充分溶解，并定容到刻度，摇匀，得到对照品储备溶液，浓度为500μg/mL，然后精密称量对照品储备溶液5.0mL至100mL 容量瓶中，加稀释剂稀释到刻度，混匀；再取上述溶液2.0mL至25mL容量瓶中，加稀释剂稀释到刻度，混匀，得到对照品溶液，浓度为2μg/mL。
(2)样品溶液的制备：准确移取二氟泼尼酯眼用乳剂4.0mL至10mL 容量瓶中，加乙腈稀释到刻度，超声处理5min混匀，然后4000rpm离心10 分钟，取上清液。
(3)对照品溶液和样品溶液分别以10μL的进样量进样到高效液相色谱仪中检测，检测条件为：色谱柱：SVEA C18 Cold色谱柱(4.6mm*150mm， 3.5μm)；
流动相：流动相A为0.02mol/L的乙酸铵溶液，pH为3.5，流动相B为乙腈，按照以下程序洗脱：
洗脱时间0min，70％流动相A，30％的流动相B
洗脱时间6min，70％流动相A，30％的流动相B
洗脱时间25min，55％流动相A，45％的流动相B
洗脱时间35min，55％流动相A，45％的流动相B
洗脱时间40min，70％流动相A，30％的流动相B
洗脱时间50min，70％流动相A，30％的流动相B
检测波长254nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，样品盘温度5℃。
得到对照品溶液的色谱图如图1所示，样品溶液的色谱图如图2所示。
(4)通过结果计算各降解杂质的含量，降解杂质含量的计算公式如下：
Figure BDA0002750676580000061
其中，Aspl为测得的样品溶液峰面积；
Astd为对照品溶液重复测量5次的峰面积的平均值；
Wstd为对照品溶液中二氟泼尼酯的质量(mg)；
Dstd为对照品溶液的稀释倍数；
Dspl为样品溶液的稀释倍数；
L为样品溶液的标示量，以mg计；
P为二氟泼尼酯标准品的纯度(mg/mg)；
RRF是杂质的相对响应因子(未指定杂质的RRF＝1)。
RRF的值如下：Difluoroprednisolone的相对响应因子为：1.41；Difluoroprednisolone 17-Acetate的相对响应因子为：1.22；Difluoroprednisolone 21-Acetate的相对响应因子为：1.26；Difluoroprednisolone 17-Butyrate的相对响应因子为：1.05；Difluoroprednisolone 21-Butyrate的相对响应因子为：1.12。
以下通过试验例的方式来说明本发明的有益效果：
实验例1、降解杂质保留时间的确定
1、定位溶液的配制：
(1)二氟泼尼酯标准品储备溶液的配制：准确称取5.0mg的二氟泼尼酯标准品于25mL容量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，制得二氟泼尼酯标准品储备溶液I，浓度为200μg/mL；
进一步取5.0mL二氟泼尼酯标准品储备溶液I于20mL容量瓶中，加乙腈定容至刻度，得到二氟泼尼酯标准品储备溶液II，浓度为50μg/mL；
进一步取4.0mL二氟泼尼酯标准品储备溶液II于20mL容量瓶中，加乙腈定容至刻度，得到二氟泼尼酯标准品储备溶液III，浓度为10μg/mL。
(2)降解杂质储备溶液的配制：分别精密称取各个杂质的标准品5mg 于10mL容量瓶中，加乙腈溶解稀释至刻度，得到降解杂质储备溶液I，浓度为500μg/mL；
进一步取2.0mL降解杂质储备溶液I于20mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，得到降解杂质储备溶液II，浓度为50μg/mL；
进一步取4.0mL降解杂质储备溶液I于20mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，得到降解杂质储备溶液III，浓度为10μg/mL。
(3)100％浓度水平的定位溶液的配制：取0.4mL二氟泼尼酯标准品储备溶液II和0.4mL降解杂质储备溶液II于10mL容量瓶中混合，加乙腈定容至刻度，即得。
2、实验方法：
将定位溶液进行高效液相色谱检测，检测条件同实施例1，由此定位出各种杂质和二氟泼尼酯标准品准确的保留时间(min)，并以此作为在使用相同色谱条件下检测样品中的杂质的定位依据。
3、实验结果：
得到的典型的定位溶液测试谱图如图3所示，根据多次测量，总结得出的各成分保留时间结果如表2所示：
表2各成分保留时间
Figure BDA0002750676580000071
实验例2、线性考察及相对响应因子(RRF)的确定
1、线性溶液的配制：
(1)二氟泼尼酯标准品储备溶液的配制：同实验例1。
(2)降解杂质储备溶液的配制：同实验例1。
(3)线性溶液的配制：如表3所示
表3线性溶液的配制
Figure BDA0002750676580000081
2、实验方法：
对线性溶液进行高效液相色谱检测，色谱条件同实施例1，然后对测得的结果进行线性拟合。将拟合得到的各个杂质和二氟泼尼酯主成分的线性方程的斜率作比：RRF＝杂质线性方程斜率÷二氟泼尼酯主成分线性方程斜率。
3、实验结果：如图4和表4所示。
表4线性方程结果
Imp-D Imp-17-A Imp-21-A Imp-17-B Imp-21-B Difluprednate
R 0.9994 0.9992 0.9993 0.9992 0.9993 0.9991
A 16714.5078 14467.0241 14940.0216 12477.3095 13370.2637 11892.1747
B 279.6252 247.1297 665.3393 425.3714 265.5284 96.6431
Y％ 1 1 2 2 1 0
表中R为相关系数，A为线性方程的斜率，B为线性方程的截距，Y％为线性方程的截距响应，公式如下
Figure BDA0002750676580000091
其中C100％为理论 100％水平浓度。
可以看出，拟合曲线R值均在0.9991以上，且Y轴截距不超过100％响应值的2％，具有很好的线性。
结论：本发明的检测二氟泼尼酯眼用乳剂中降解杂质含量的高效液相色谱方法在0.2μg/mL～5μg/mL范围内具有良好的线性。
实验例3、本发明检测方法的专属性考察
1、溶液的配制
1.1加标溶液的配制
(1)降解杂质储备溶液的配制：同实施例1。
(2)样品溶液的配制：同实施例1样品溶液的制备方法。
(3)加标溶液的配制：分别取5种降解杂质的储备溶液II各0.4mL和 4mL样品溶液于10mL容量瓶中，加乙腈定容至刻度，即得。
1.2安慰剂溶液的配制：
使用仅不含API的二氟泼尼酯滴眼剂，按照和实施例1样品溶液的制备方法相同的方法进行配制，得到安慰剂溶液。
1.3强制降解样品溶液的配制：
分别用酸、碱、氧化、高温和光照的方式对样品进行强制降解破坏后，按照实施例1样品溶液的制备方法配制成强制降解样品溶液。
具体强制降解条件如表5所示。
表5强制降解条件
强度 时间 温度
酸 1N HCl 0.5h 60℃
碱 0.2N NaOH 1.0h 60℃
氧化 30％H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 1.0h 60℃
高温 NA 5天 60℃
光照 紫外光照 5天 室温
2、实验方法
将加标溶液、安慰剂溶液和强制降解样品溶液分别进行高效液相色谱检测，检测条件同实施例1。
3、实验结果
得到加标溶液的色谱图如图5所示，安慰剂溶液色谱图如图6所示，强制酸降解后的样品液相色谱图如图7所示；碱降解后的样品液相色谱图如图 8所示；氧化降解后的样品液相色谱图如图9所示；高温降解后的样品液相色谱图如图10所示；光照降解后的样品液相色谱图如图11所示。
与未强制降解的原样品图谱(图2)对比可以看出，稀释剂乙腈和安慰剂在二氟泼尼酯和特定杂质峰位置无干扰，样品的降解杂质色谱峰依然能够正常检出，样品对碱、氧化和高温稳定，未产生干扰峰；样品对酸和光照敏感，但酸和光照降解产生的色谱峰与本方法所检测的降解杂质有良好的分离度。
结论：本发明检测方法对二氟泼尼酯眼用乳剂中的降解杂质检测具有良好的专属性。
实验例4、本发明检测方法的精密度考察
使用实施例1的方法重复测定6份样品溶液，得到的结果如表6所示。
表6 6份样品溶液重复测定的含量结果
样品 ％Imp-D ％Imp-17-A ％Imp-21-A ％Imp-17-B ％Imp-21-B
A-1.0％-1 1.108 1.132 1.099 3.040 1.226
A-1.0％-2 1.102 1.121 1.111 3.038 1.222
A-1.0％-3 1.097 1.124 1.084 3.067 1.201
A-1.0％-4 1.085 1.111 1.098 3.023 1.277
A-1.0％-5 1.085 1.117 1.089 3.028 1.196
A-1.0％-6 1.096 1.114 1.106 3.045 1.251
％平均 1.095 1.120 1.098 3.040 1.229
％RSD 0.8 0.7 0.9 0.5 2.5
可以看出，6份样品重复测定降解杂质含量的RSD不超过5.0％，Imp-D、Imp-17-A、Imp-21-A和Imp-17-B含量测定的RSD均不超过0.9％，证明本方法对二氟泼尼酯眼用乳剂中的降解杂质检测具有良好的重复性和高的精密度。
实验例5、本发明检测方法的准确度考察
1、不同浓度水平梯度溶液的配制：
(1)安慰剂溶液的配制：同实验例3。
(2)二氟泼尼酯标准品储备溶液的配制：同实验例1。
(3)降解杂质储备溶液的配制：同实验例1。
(4)样品溶液的配制：同实施例1样品溶液的制备方法。
(5)不同浓度水平梯度溶液的配制：按表7取相应溶液于10mL容量瓶中混合，加乙腈稀释至刻度，即得。
表7不同浓度水平梯度溶液的配制
Figure BDA0002750676580000111
不同浓度水平梯度的溶液一式三份。
2、测试方法
将配制好的不同浓度水平梯度的溶液进行高效液相色谱检测，检测条件同实施例1。
3、检测结果：
检测结果如表8～表12所示。
表8 Imp-D的检测回收率
Figure BDA0002750676580000112
表9 Imp-17-A的检测回收率
Figure BDA0002750676580000113
Figure BDA0002750676580000121
表10 Imp-21-A的检测回收率
Figure BDA0002750676580000122
表11 Imp-17-B的检测回收率
Figure BDA0002750676580000123
Figure BDA0002750676580000131
表12 Imp-21-B的检测回收率
Figure BDA0002750676580000132
可以看出，本方法检测二氟泼尼酯眼用乳剂中的降解杂质含量的回收率均在98.4％～107.5％之间，说明本方法的回收率高，准确度好。
实验例6、对照品溶液和样品溶液的稳定性考察
将实施例1中的样品溶液和对照品溶液分别在2～8℃下避光储存48h和 55h，在不同时间点用实施例1中的色谱条件分别对对照品溶液和样品溶液进行检测，得到的结果如表13、表14所示：
表13对照品溶液的稳定性
Figure BDA0002750676580000133
表14样品溶液的稳定性
Figure BDA0002750676580000134
Figure BDA0002750676580000141
可以看出，本方法配制的样品溶液和对照品溶液在2～8℃低温下贮存48h，色谱峰变化不大，溶液性质变化不大，说明本发明配制的样品溶液和对照品溶液在本发明检测方法中的样品盘温度为5℃的条件下，能够保持48h稳定，不会影响检测结果。
综上，本发明提供了一种测定二氟泼尼酯眼用乳剂中降解杂质含量的高效液相色谱方法,在0.2μg/mL～5μg/mL范围内具有良好的线性，专属性强，精密度高且回收率高，是检测二氟泼尼酯眼用乳剂中降解杂质含量的有效方法，具有良好的应用前景。

Claims (10)

1.一种检测二氟泼尼酯眼用乳剂中降解杂质的高效液相色谱方法，其特征在于，所述降解杂质包括6α,9α-二氟泼尼松龙、6α,9α-二氟泼尼松龙-17-乙酸酯、6α,9α-二氟泼尼松龙-21-乙酸酯、6α,9α-二氟泼尼松龙-17-丁酸酯、6α,9α-二氟泼尼松龙-21-丁酸酯，
所述6α,9α-二氟泼尼松龙的结构为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
；
所述6α,9α-二氟泼尼松龙-17-乙酸酯的结构为：
Figure 56652DEST_PATH_IMAGE002
；
所述6α,9α-二氟泼尼松龙-21-乙酸酯的结构为：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
；
所述6α,9α-二氟泼尼松龙-17-丁酸酯的结构为：
Figure 800224DEST_PATH_IMAGE004
所述6α,9α-二氟泼尼松龙-21-丁酸酯的结构为：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
；
包括以下操作步骤：
（1）样品溶液的制备：取待检二氟泼尼酯眼用乳剂，加溶剂溶解配制样品溶液；
（2）将样品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：
色谱柱：C18色谱柱；色谱柱规格为内径4.6mm，长度150mm，填料粒径3.5μm；
流动相：流动相A为乙酸铵溶液，所述乙酸铵溶液的浓度为0.01~0.03 mol/L，pH为3~4；流动相B为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序如下：
洗脱时间0min，25%~35%的流动相B；
洗脱时间6min，25%~35%的流动相B；
洗脱时间25min，40%~50%的流动相B；
洗脱时间35min，40%~50%的流动相B；
洗脱时间40min，25%~35%的流动相B；
洗脱时间50min，25%~35%的流动相B；
柱温为25~35℃，流速为0.5~1.5 mL/min，检测波长为254nm。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括以下检测二氟泼尼酯眼用乳剂中降解杂质含量的操作步骤：
（3）标准品溶液的制备：称取二氟泼尼酯标准品，加与样品溶液相同的溶剂溶解配制标准品溶液；
（4）将标准品溶液按照与步骤（2）相同的方法注入高效液相色谱仪检测；
（5）根据检测结果计算得到二氟泼尼酯眼用乳剂中5种降解杂质的含量，计算公式如下：
含量%
Figure 704595DEST_PATH_IMAGE006
其中，Aspl为测得的样品溶液的峰面积；
Astd为标准品溶液重复测量5次的峰面积的平均值；
Wstd为标准品溶液中二氟泼尼酯的质量，以mg计；
Dstd为标准品溶液的稀释倍数；
Dspl为样品溶液的稀释倍数；
L为样品溶液的标示量，以mg计；
P为二氟泼尼酯标准品的纯度以mg/mg计；
RRF是杂质的相对响应因子。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述溶剂为乙腈。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述乙酸铵溶液的浓度为0.02mol/L，pH为3.5。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述色谱柱型号为 SVEA C18Cold色谱柱。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述梯度洗脱程序为：
洗脱时间0min，30%的流动相B
洗脱时间6min，30%的流动相B
洗脱时间25min，45%的流动相B
洗脱时间35min，45%的流动相B
洗脱时间40min，30%的流动相B
洗脱时间50min，30%的流动相B。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪样品盘温度为5℃，所述柱温为30℃；流速为1.0 mL/min。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中的样品溶液进样量为5~15μL。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）中的样品溶液进样量为10μL。
10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述杂质的相对响应因子的值如下：
6α,9α-二氟泼尼松龙的相对响应因子为：1.41；
6α,9α-二氟泼尼松龙-17-乙酸酯的相对响应因子为：1.22；
6α,9α-二氟泼尼松龙-21-乙酸酯的相对响应因子为：1.26；
6α,9α-二氟泼尼松龙-17-丁酸酯的相对响应因子为：1.05；
6α,9α-二氟泼尼松龙-21-丁酸酯的相对响应因子为：1.12。
CN202011182808.8A 2020-10-29 2020-10-29 一种检测二氟泼尼酯眼用乳剂中的降解杂质及其含量的高效液相色谱方法 Active CN112305115B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011182808.8A CN112305115B (zh) 2020-10-29 2020-10-29 一种检测二氟泼尼酯眼用乳剂中的降解杂质及其含量的高效液相色谱方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011182808.8A CN112305115B (zh) 2020-10-29 2020-10-29 一种检测二氟泼尼酯眼用乳剂中的降解杂质及其含量的高效液相色谱方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112305115A CN112305115A (zh) 2021-02-02
CN112305115B true CN112305115B (zh) 2022-08-23

Family

ID=74331724

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011182808.8A Active CN112305115B (zh) 2020-10-29 2020-10-29 一种检测二氟泼尼酯眼用乳剂中的降解杂质及其含量的高效液相色谱方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112305115B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012155062A1 (en) * 2011-05-12 2012-11-15 Foresight Biotherapeutics, Inc. Stable povidone-iodine compositions with steroids or non-steroidal anti-inflammatories
CN103364502A (zh) * 2013-07-04 2013-10-23 山东省医药工业研究所 一种二氟泼尼酯中有关物质的hplc测定方法
CN107300589A (zh) * 2017-04-18 2017-10-27 广州仁恒医药科技股份有限公司 一种二氟泼尼酯的色谱纯度测定方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012155062A1 (en) * 2011-05-12 2012-11-15 Foresight Biotherapeutics, Inc. Stable povidone-iodine compositions with steroids or non-steroidal anti-inflammatories
CN103364502A (zh) * 2013-07-04 2013-10-23 山东省医药工业研究所 一种二氟泼尼酯中有关物质的hplc测定方法
CN107300589A (zh) * 2017-04-18 2017-10-27 广州仁恒医药科技股份有限公司 一种二氟泼尼酯的色谱纯度测定方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A multi-technique analytical approach for impurity profiling during synthesis: The case of difluprednate;Nicolette Sammut Bartoloa 等;《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》;20200721;第190卷;第113483页 *
Development and validation of a stability indicating RP-HPLC method for the determination of potential degradation products of difluprednate in ophthalmic emulsion;MURLIDHAR V.ZOPE 等;《International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences》;20180831;第10卷(第9期);第79-86页 *
HPLC测定二氟泼尼酯眼用乳剂的含量;王金虎 等;《食品与药品》;20121130;第14卷(第11期);第428页 *
RP-HPLC法测定二氟泼尼酯原料药中有关物质含量;冯光玲 等;《中国药房》;20130731;第24卷(第25期);第2363-2365页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112305115A (zh) 2021-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113607843A (zh) 一种检测西罗莫司原料药中残留溶剂的方法
CN112198260B (zh) 一种盐酸丙卡特罗药物制剂中工艺杂质含量的检测方法
CN112630365B (zh) 一种高效液相色谱测定二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱含量的方法
CN112305115B (zh) 一种检测二氟泼尼酯眼用乳剂中的降解杂质及其含量的高效液相色谱方法
CN113514588B (zh) 注射用双半胱乙酯有关物质的高效液相色谱分析方法
CN112684031B (zh) 聚维酮k30含量的hplc测定方法
CN114264765B (zh) 一种利用hplc测定格列美脲中间体中有关物质的分析方法
CN114280191A (zh) 一种双半胱氨酸及其制剂中有关物质的检测方法
Shewale et al. Assessment of Fusidic acid (FA) and Beclomethasone Dipropionate (BD) In Semi-solid Dosage Form Using Validated High-Performance Liquid Chromatography Method
CN112305114A (zh) 一种测定二氟泼尼酯眼用乳剂中山梨酸含量的高效液相色谱方法
CN111398442A (zh) 一种检测盐酸溴己新吸入溶液中n-(2-硝基苄)–n-甲基环己胺的方法
CN113686977B (zh) 复方芬苯达唑制剂中有关物质的测定方法
CN114354788B (zh) 一种Molnupiravir原料及其制剂中有关物质的测定方法
CN114184712B (zh) 一种结合雌激素片中游离甾体杂质含量的检测方法
CN110687226B (zh) 一种测定碘帕醇中2-氯丙酸含量的方法
CN117630202B (zh) 盐酸丁螺环酮中间体杂质的检测方法
WO2024060426A1 (zh) 一种测定马来酸甲麦角片剂中乙醇量的方法
CN115144492B (zh) 一种β-氯代苯丙酮中3-氯丙酰氯的痕量检测方法
CN112305100B (zh) 一种药物中基因毒性杂质溴化苄含量的检测方法
Li et al. Analysis of the Genotoxic Impurity S-(+)-Epichlorohydrin Contained in (S)-Oxiracetam using Gas Chromatography
Dhananjaya et al. Development and validation of a stabilityindicating RP-HPLC method for the determination of bendamustine in raw material and finished product
Samala et al. Method development and validation of bendamustine HCl injection by using RP
CN115598238A (zh) 一种高效液相法测定左炔诺孕酮中右旋异构体含量的方法
CN116223667A (zh) 一种检测他达拉非中遗传毒性杂质的方法
CN115541763A (zh) 一种奥拉帕利一水合物中3-溴苯酞的检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant