CN112299567B - 一种抑制蓝藻的微生物混合制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抑制蓝藻的微生物混合制剂及其制备方法。本发明的混合制剂包括包括复合型芽孢杆菌10‑20份、草药制剂20‑30份、絮凝剂5‑10份和麸皮20‑30份，草药制剂由原药材提取物制备得到，原药材按重量百分比计，为五倍子50％‑60％、乌梅15％‑25％、陈皮10％‑15％和甘遂10％‑15％。本发明利用草药中的化感物质抑制微囊藻细胞生长；并利用五倍子中没食子酸对微囊藻细胞膜上和细胞内的蛋白质进行沉淀收敛，且通过乌梅中有机酸辅助没食子酸，促进其与蛋白质作用，使微囊藻细胞萎缩沉淀，且大部分能维持僵化细胞形态，藻毒素不易扩散，絮凝沉淀到水底，再利用微生物缓慢释放并降解藻毒素。通过本发明的合理配伍，能够高效抑制微囊藻的生长，灭杀微囊藻，还能够降低藻毒素的释放。

Description

一种抑制蓝藻的微生物混合制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种抑制蓝藻的微生物混合制剂及其制备方法，属于环境保护技术领域。
背景技术
蓝藻是一种古老的原核生物群体，具有藻类和细菌双重特性，能够利用阳光、水、氮、磷、二氧化碳和其他营养物质进行光合作用，是光合自养型生物。蓝藻生命力强，繁殖快，在适宜温度、光照、营养物及风向相对稳定情况下，12～24h能繁殖一次，即使在恶劣的环境中也能生存。全球范围内有30％～40％的湖泊和水库受到不同程度富营养化的影响，蓝藻水华在世界各地的富营养化湖泊、池塘、河流中时常发生。在这些水华蓝藻中，微囊藻是最常见的和占比最大的优势种群，并且微囊藻群体相对于单细胞，可分泌更多的藻毒素MC。微囊藻不仅导致水体污染，还严重危害人体健康，特别是微囊藻机体腐败后释放出的微囊藻毒素，对对水生动植物和驯养动物等多种生物都具有毒害作用，甚至对人类也具有致癌作用，长期接触会损坏人体肝功能，对神经、细胞和皮肤也有一定的影响。
目前国内治理蓝藻水华主要采用物理、化学和生物三种方法：(1)物理法：引换水、曝气、机械打捞收藻等方法；(2)化学法：化学除藻是通过化学药剂来控制水中藻类的繁殖，通常与絮凝剂配合使用；(3)生物法：主要有栽种水生高等植物，养殖水生动物，投加微生物菌种等。其中物理打捞运用最为广泛，但是成本高、效率低，打捞速度远不及蓝藻繁殖速度，大面积湖泊水库一旦蓝藻水华爆发，基本无法控制；化学除藻剂控制蓝藻的爆发可以取得较好的短期效果，但是会存在二次污染的风险；利用高等植物虽然能够有效去除蓝藻，不带来二次污染风险，但是处理时间长，见效慢，并且还会导致外来物种因没有天敌而引起其他的环境问题；而现有的微生物菌剂生态稳定性较差，尤其在蓝藻大量释放藻毒素后，菌剂大量失活，无法继续生长，蓝藻无法彻底抑制。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种抑制蓝藻的微生物混合制剂。通过微生物与草药制剂的配合，不仅能够高效抑制蓝藻的生长，还能够降低藻毒素的释放。
本发明的第一个目的是提供一种抑制蓝藻的微生物混合制剂，按重量份计，包括复合型芽孢杆菌10-20份、草药制剂20-30份、絮凝剂5-10份和麸皮20-30份，所述的草药制剂由原药材提取物制备得到，所述的原药材按重量百分比计，为五倍子50％-60％、乌梅15％-25％、陈皮10％-15％和甘遂10％-15％。
进一步地，所述的复合型芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌中的至少两种。
进一步地，所述的草药制剂中还包括助剂，所述的助剂为乳化剂、溶剂、消泡剂、稳定剂中的至少一种。
进一步地，所述的乳化剂为非离子表面活性剂或阴离子表面活性剂中的至少一种。
进一步地，所述的溶剂为水、乙醇、异丙醇、正丁醇、乙酸乙酯、二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮、二甲基甲酰胺中的至少一种。
进一步地，所述的消泡剂为有机硅消泡剂。
进一步地，所述的稳定剂为2-环氧丙烷、丁基缩水甘油醚、聚乙二醇中的至少一种。
进一步地，所述的原药材提取物与助剂的质量比为1-10:1。
进一步地，所述的絮凝剂为壳聚糖类絮凝剂、纤维素类絮凝剂、淀粉类絮凝剂中的一种或多种。
本发明的第二个目的是所述的微生物混合制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)按比例称取原药材，粉碎至80-120目，采用超临界CO2，以乙醇作为夹带剂，在压力为10-30MPa，温度为30-60℃，萃取流量为10-30L/min条件下萃取0.5-5小时，得原药材提取物；将所述的原药材提取物与助剂混匀，制备形成草药制剂；
(2)将复合型芽孢杆菌菌剂接种至培养基中进行活化培养，得到活化菌剂；
(3)将活化菌剂、草药制剂、絮凝剂和麸皮拌料混匀，得到所述的微生物混合制剂。
进一步地，在步骤(1)中，将五倍子粉末进行超临界萃取，将乌梅、陈皮和甘遂粉末混合后进行超临界萃取。
进一步地，五倍子粉末的提取条件为加入5-10％乙醇，置于萃取罐中，采用超临界CO2，在压力为20-30MPa，温度为40-50℃，萃取流量为10-30L/min条件下萃取1-5小时。
进一步地，乌梅、陈皮和甘遂混合粉末的提取条件为加入1-5％乙醇，置于萃取罐中，采用超临界CO2，在压力为10-20MPa，温度为40-50℃，萃取流量为10-30L/min条件下萃取0.5-3小时。
本发明的第三个目的是提供所述的微生物混合制剂在抑制蓝藻中的应用。
进一步地，所述的应用具体是将所述的微生物混合制剂喷洒到水面，抑制蓝藻生长，并控制藻毒素释放。
进一步地，在喷洒时，微生物混合制剂的用量为10-50g/m2。
本发明的有益效果是：
本发明利用陈皮中的黄酮以及挥发油，乌梅中的黄酮类成分，甘遂中的萜类和甾体类化合物等化感物质抑制微囊藻细胞生长，破坏微囊藻的细胞结构；并利用五倍子中的没食子酸对微囊藻细胞膜上和细胞内的蛋白质进行沉淀收敛，且通过乌梅中的有机酸辅助五倍子中的没食子酸，促进其与蛋白质之间的作用，使得微囊藻细胞萎缩沉淀，且大部分能够维持僵化细胞形态，藻毒素不易扩散到水中，然后絮凝沉淀到水底，再利用微生物缓慢释放并降解藻毒素。通过本发明的合理配伍，能够高效抑制微囊藻的生长，灭杀微囊藻，还能够降低藻毒素的释放。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
五倍子主要富含没食子酸。所含的酸对蛋白质具有沉淀作用，并可与若干金属、生物碱形成不溶解化合物。
乌梅主要含有枸橼酸，苹果酸，草酸，琥珀酸和延胡索酸，总酸量约4％-5.5％，以前两种有机酸的含量较多。还含有山奈酚-3-0-鼠李糖苷、鼠李柠檬素-3-0-鼠李糖苷、槲皮素-3-0-鼠李糖苷等黄酮类成分。所含挥发性成分，主要有苯甲醛62.40％，4-松油烯醇3.97％，苯甲醇3.97％和十六烷酸4.55％。
陈皮中含有1.5-2％的挥发油，油中主要成分为D-柠檬烯，还含β-月桂烯，α-及β-蒎烯等，另含有丰富的黄酮类成分：橙皮甙、新橙皮甙、柑橘素、二氢川陈皮素及5-去甲二氢川陈皮素。
甘遂中的主要成分为萜类和甾体类化合物，还包含香豆素、脂肪酸、蔗糖、鞣质、棕榈酸和树脂。
本发明的作用机理：
本发明的混合制剂投入到含有蓝藻的水中，首先通过草药中的成分抑制破坏蓝藻生长，比如陈皮中的黄酮以及挥发油，乌梅中的黄酮类成分，甘遂中的萜类和甾体类化合物都对微囊藻具有明显的化感抑制作用，能够抑制微囊藻光合作用，破坏微囊藻的细胞结构，香豆素对铜绿微囊藻叶绿素a合成具有抑制作用。而五倍子中的鞣酸能够对微囊藻细胞膜上和细胞内的蛋白质进行沉淀，具有收敛作用，并且，乌梅中的有机酸能够辅助五倍子中的鞣酸，能够促进鞣酸与蛋白质之间的作用，使得微囊藻细胞萎缩沉淀，且大部分能够维持僵化细胞形态，藻毒素不易扩散到水中，同时通过絮凝剂的絮凝作用，藻体沉至水底，避免了现有的中草药制剂在短时期内大量灭杀蓝藻，会造成藻细胞破裂释放大量藻毒素的问题。
然后，复合芽孢杆菌属利用水中的有机物，以及五倍子、乌梅等成分对其生长的促进作用，复合芽孢杆菌属分泌的胞外酶对大分子有机物进行降解，将大分子有机物降解为小分子化合物，小分子化合物可进一步进入胞内进行降解。在降解过程中缓慢释放出僵化藻体中的藻毒素，利用底泥中降解藻毒素的微生物或者高等植物对藻毒素进行缓慢降解，彻底去除藻毒素。
通过本发明的合理配伍，能够高效抑制微囊藻的生长，灭杀微囊藻，还能够降低藻毒素的释放，缓慢降解藻毒素。
此外，陈皮中的挥发油成分具有浓郁的芳香气味，在抑制蓝藻水华的过程中能够减轻微囊藻腐败而产生的臭味、刺激性气味，消除蓝藻水华所带来的不良影响。
微囊藻细胞数量采用电子显微镜直接检测得到，藻毒素浓度是将溶液用0.45um孔径的PVDF滤膜过滤后，利用LC/MS/MS检测得到。
消减率(％)＝(原微囊藻数量-喷药后微囊藻数量)÷原微囊藻数量×100
实施例1：
(1)按照如下方法制备草药制剂：
分别称取五倍子55份、乌梅20份、陈皮13份、甘遂12份，粉碎成100目粉末，然后将五倍子的粉末加入8％乙醇，置于萃取罐中，采用超临界CO2，在压力为25MPa，温度为45℃，萃取流量为20L/min条件下萃取2小时，得提取物；另外将乌梅、陈皮、甘遂粉末混合，加入2％乙醇，置于萃取罐中，采用超临界CO2，在压力为10MPa，温度为45℃，萃取流量为20L/min条件下萃取2小时，得提取物，将两种提取物混合，得到总的原药材提取物；将制得的原药材提取物与5份十二烷基苯磺酸钙、5份乙醇、5份水、2份聚乙二醇、1份有机硅消泡剂混匀，制备形成草药制剂。
(2)将枯草芽孢杆菌15份、纳豆芽孢杆菌10份、地衣芽孢杆菌10份、腊状芽孢杆菌10份接种到马铃薯液体培养基中，在37℃培养2天得到活化的复合型芽孢杆菌。
(3)取15份活化的复合型芽孢杆菌、25份草药制剂、8份壳聚糖絮凝剂和25份麦麸进行拌料混匀，制备得到微生物混合制剂。
实施例2：
(1)按照如下方法制备中草药制剂：称取五倍子50份、乌梅25份、陈皮15份、甘遂10份，粉碎成80目粉末，然后向五倍子粉末中加入10％乙醇，置于萃取罐中，采用超临界CO2，在压力为20MPa，温度为50℃，萃取流量为20L/min条件下萃取3小时，得提取物；另外将乌梅、陈皮、甘遂粉末混合，加入3％乙醇，置于萃取罐中，采用超临界CO2，在压力为15MPa，温度为40℃，萃取流量为20L/min条件下萃取1小时，得提取物，将两种提取物混合，得到总的原药材提取物；将制得的原药材提取物与5份十二烷基苯磺酸钙、5份乙醇、5份水、2份聚乙二醇、1份有机硅消泡剂混匀，制备形成草药制剂。
(2)将枯草芽孢杆菌10份、纳豆芽孢杆菌15份、地衣芽孢杆菌15份、腊状芽孢杆菌10份接种到马铃薯液体培养基中，在37℃培养2天得到活化的复合型芽孢杆菌。
(3)取15份活化的复合型芽孢杆菌、25份草药制剂、8份壳聚糖絮凝剂和25份麦麸进行拌料混匀，制备得到微生物混合制剂。
实施例3：
(1)按照如下方法制备中草药制剂：称取五倍子60份、乌梅15份、陈皮10份、甘遂15份，粉碎成120目粉末，然后向五倍子粉末中加入5％乙醇，置于萃取罐中，采用超临界CO2，在压力为30MPa，温度为40℃，萃取流量为20L/min条件下萃取2小时，得提取物；另外将乌梅、陈皮、甘遂粉末混合，加入2％乙醇，置于萃取罐中，采用超临界CO2，在压力为10MPa，温度为45℃，萃取流量为20L/min条件下萃取2小时，得提取物，将两种提取物混合，得到总的提取物；将制得的原药材提取物与5份十二烷基苯磺酸钙、5份乙醇、5份水、2份聚乙二醇、1份有机硅消泡剂混匀，制备形成草药制剂。
(2)将枯草芽孢杆菌10份、纳豆芽孢杆菌10份、地衣芽孢杆菌15份、腊状芽孢杆菌15份接种到马铃薯液体培养基中，在37℃培养2天得到活化的复合型芽孢杆菌。
(3)取15份活化的复合型芽孢杆菌、25份草药制剂、8份壳聚糖絮凝剂和25份麦麸进行拌料混匀，制备得到微生物混合制剂。
对比例1：
采用CN109090150A中的中草药组分：僵蚕23份、槟榔15份、金银花12份、万寿菊12份和五味子10份，按照本发明实施例1的方法制备成草药制剂，再按照实施例1中制备微生物混合制剂的步骤，将草药制剂制备成微生物混合制剂。
取含有微囊藻的水样进行试验，将实施例1-3和对比例1的微生物混合制剂分别按照20g/m2的用量均匀喷洒到含有微囊藻的水面上，分别检测微囊藻细胞数量和藻毒素浓度，检测结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002675960350000071
实施例1-3和对比例1对微囊藻的灭杀作用相当，在48h均能达到98％以上的消除率，肉眼观察水样呈白绿色，微囊藻基本死亡；实施例1-3的水样中藻毒素浓度上升较少，而对比例1水样中藻毒素在12小时后快速上升；实施例1-3和对比例1均能减轻微囊藻腐败产生的臭味、刺激性气味。
对比例2：
与实施例1方法基本保持一致，只是将五倍子粉末与乌梅、陈皮、甘遂粉末一起混匀，加入2％乙醇，置于萃取罐中，采用超临界CO2，在压力为10MPa，温度为45℃，萃取流量为20L/min条件下萃取2小时，得原药材提取物，再按照实施例1中制备微生物混合制剂的步骤，将草药制剂制备成微生物混合制剂。
取含有微囊藻的水样进行试验，将对比例2的微生物混合制剂分别按照20g/m2的用量均匀喷洒到含有微囊藻的水面上，分别检测微囊藻细胞数量和藻毒素浓度，检测结果如表2所示。
表2
Figure BDA0002675960350000081
将各草药组分采用共同提取制备得到的原药材提取物再制备的微生物混合菌剂，对微囊藻的杀灭作用以及对藻毒素的控制作用都比较差，可见不同的草药组份的提取条件都有差异，共同提取的有效成分不足以发挥良好的杀藻作用。
对比例3：
与实施例1方法基本保持一致，只是将乌梅、陈皮、甘遂粉末分别进行提取，分别加入2％乙醇，置于萃取罐中，采用超临界CO2，在压力为10MPa，温度为45℃，萃取流量为20L/min条件下萃取2小时，各原料的提取物混匀得原药材提取物，再按照实施例1中制备微生物混合制剂的步骤，将草药制剂制备成微生物混合制剂。
取含有微囊藻的水样进行试验，将对比例3的微生物混合制剂分别按照20g/m2的用量均匀喷洒到含有微囊藻的水面上，分别检测微囊藻细胞数量和藻毒素浓度，检测结果如表3所示。
表3
Figure BDA0002675960350000091
将各草药组分采用单独提取再混合制备得到提取物再制备的微生物混合菌剂，对微囊藻的杀灭作用低于分类混合提取的效果，可见本发明的乌梅、陈皮、甘遂在提取过程中，具有协同增效的作用，采用本发明的分类提取方法，能够增加有效成分的提取效果。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (8)

1.一种抑制蓝藻的微生物混合制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）按比例称取原药材，粉碎至80-120目，采用超临界CO2，以乙醇作为夹带剂，在压力为10-30MPa，温度为30-60oC，萃取流量为10-30L/min条件下萃取0.5-5小时，得原药材提取物；将所述的原药材提取物与助剂混匀，制备形成草药制剂；
所述的原药材按重量百分比计，为五倍子50%-60%、乌梅15%-25%、陈皮10%-15%和甘遂10%-15%；
（2）将复合型芽孢杆菌菌剂接种至培养基中进行活化培养，得到活化菌剂；
（3）将活化菌剂、草药制剂、絮凝剂和麸皮拌料混匀，得到所述的微生物混合制剂；
所述的微生物混合制剂，按重量份计，包括复合型芽孢杆菌10-20份、草药制剂20-30份、絮凝剂5-10份和麸皮20-30份；
在步骤（1）中，将五倍子粉末单独进行超临界萃取，将乌梅、陈皮和甘遂粉末混合后进行超临界萃取；
所述的复合型芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌中的至少两种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，五倍子粉末的提取条件为加入5-10%乙醇，置于萃取罐中，采用超临界CO2，在压力为20-30MPa，温度为40-50oC，萃取流量为10-30L/min条件下萃取1-5小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，乌梅、陈皮和甘遂混合粉末的提取条件为加入1-5%乙醇，置于萃取罐中，采用超临界CO2，在压力为10-20MPa，温度为40-50oC，萃取流量为10-30L/min条件下萃取0.5-3小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的草药制剂中还包括助剂，所述的助剂为乳化剂、溶剂、消泡剂、稳定剂中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的原药材提取物与助剂的质量比为1-10:1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的絮凝剂为壳聚糖类絮凝剂、纤维素类絮凝剂、淀粉类絮凝剂中的一种或多种。
7.一种权利要求1~6任一项所述的方法制备得到的微生物混合制剂。
8.一种权利要求7所述的微生物混合制剂在抑制蓝藻中的应用。
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