CN107864988B - 一种合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法，属于生物发酵技术领域。为了解决现有的活性差的问题，提供一种合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法，包括选取合欢植物原料进行粉碎后，加入水进行打浆处理，得到相应的合欢打浆液；选取石松植物原料进行粉碎后加水进行打浆处理，得到石松打浆液；将两者在发酵罐内进行混合，灭菌；调节体系pH值为6.5～7.5，再按照107cfu/mL～109cfu/mL的量作为初始浓度将经活化的枯草芽孢杆菌接种，发酵培养，离心清液，得到相应的发酵液杀蚊生物制剂。本发明能够有效提取出具有杀蚊活性成分，提高杀蚊的效果，无需采用有机溶剂，对环境基本无污染。
Description
技术领域
本发明涉及一种合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法，属于生物发酵技术领域。
背景技术
蚊虫是传播疟疾、登革热和丝虫病等疾病的中药媒介，严重影响人类健康，因此，防护蚊虫具有重要意义。
现有技术中有研究表明合欢的丙酮提取物对埃及伊蚊和致倦库蚊的Ⅳ龄幼虫有慢性毒性；而石松全草提取物对东乡伊蚊Ⅳ龄幼虫有较明显的杀灭作用。因此，可作为蚊虫杀灭剂。但是，传统的植物性杀虫剂多用有机溶剂或煎煮提取，存在较多的不足之处：如不利于节能也有较大的环境风险；影响活性物质的稳定性和遗失活性物质；增加成本使得开发应用困难较大，作用效果缓慢，因此，给植物源杀虫剂的研发和生产带来了巨大的经济困难。现有的也有直接采用合欢或石松作为中药成分进行组合用药来达到驱蚊或杀蚊的功效。如中国专利(公开号：CN106942209A)公开了一种驱蚊水，使驱蚊水由以下重量份的原料组成，邻氨基苯甲酸丁酯0.4份，橙花醇5份，丁香油3份、酒精20份和合欢皮5份。虽然，该驱蚊水中用到了合欢皮成分，使具有一定的驱蚊功效，但是，在该文献中合欢皮仅是以传统的功效使用具有安神、增加睡眠的功效，且还用于了酒精、邻氨基苯甲酸丁酯等有机化学成分，不利用健康。
发明内容
本发明针对以上现有技术中存在的缺陷，提供一种合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法，解决的问题是如何实现提高有效活性成分含量使具有高杀蚊活性的功能。
本发明的目的是通过以下技术方案得以实现的，一种合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
A、选取合欢植物原料进行粉碎后，加入水进行打浆处理，得到相应的合欢打浆液；
B、选取石松植物原料进行粉碎后加水进行打浆处理，得到石松打浆液；
C、将合欢打浆液和石松打浆液在发酵罐内进行混合，得到混合液，再进行灭菌处理；
D、调节经灭菌处理后的混合液的体系pH值为6.5～7.5，再按照107cfu/mL～109cfu/mL的量作为初始浓度将经活化的枯草芽孢杆菌接种到混合液内，然后，使在25℃～40℃的条件下进行发酵培养，结束后，进行离心收集清液，得到相应的发酵液杀蚊生物制剂。
本发明通过以合欢打浆液和石松打浆液作为枯草芽孢杆菌生长的底物的营养物质来源，使枯草芽孢杆菌在生长的过程中能够有效利用这些有机物而将其分解，从而使有效活性成分被提取出来，而通过初始浓度在107cfu/mL～109cfu/mL的接种量，是为了保证体系内的菌的有效含量，使达到充分发酵的效果；而使体系的pH值为6.5～7.5内是为了能够使枯草芽孢杆菌能够更充分的生长繁殖，提高提取的效率。通过采用枯草芽孢杆菌作为促生菌发酵合欢和石松来提取有效活性成分，不仅有利于生物活性物质的提取，且由于发酵过程中无需采用有机溶剂和长时间的高温处理过程，还不易造成有效成分活性物质的失活，有利于保证合欢和石松中具有杀蚊功效的成分活性。合欢中的有效成分主要三萜类化合物、黄酮类化合物、生物碱等有效成分，通过采用本发明的发酵方式能够使发酵液中合欢植物中的总皂苷保证较高的活性；而石松中的有效成分主要含有石松碱等生物碱的活性，使结合本发明的生物促生菌能够使发酵液中总皂苷和生物碱的活性成分含量较高，实现高杀蚊的功效。同时，采用的枯草芽孢杆菌作为促生菌本身还有较好的杀虫防病和促生作用，有利于增强杀蚊或驱蚊的效果，且发酵过程中无需添加有机溶剂等，减少了对环境的危害。
在上述合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法中，作为优选，所述步骤C中所述灭菌处理具体为使混合液在90℃～100℃的条件下进行灭菌处理10～30min。目的是为了在发酵过程中避免其它共生微生物的竞争生长，保证接种的枯草芽孢杆菌的生长，使能够提高有效活性成分的提取。
在上述合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法中，作为优选，步骤D中所述发酵培养4～8天后，再加入经活化的地衣芽孢杆菌，然后再进行二次发酵培养5～10天，所述地衣芽孢杆菌的接种量为105cfu/mL～106cfu/mL。由于本发明人在研究过程中发现枯草芽孢杆菌对合欢植物原料的利用率较高，使合欢植物中的有效活性成分生物碱能够更有效的提取释放出来；但是，对于石松植物原料的利用相对较差，其活性成分的释放相对较差，而在发酵一段时间后加入地衣芽孢杆菌，能够更快速的利用石松原料，从而使其中的活性成分生物碱也能够更有效的提取，从而使得到的发酵液中能够同时兼具石松和合欢中的活性成分，提高发酵液的活性性能，实现具有较好的杀蚊活性。
在上述合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法中，作为优选，步骤A中所述合欢打浆液的固液比为1：3～5。提高原料的利用率，保证有效活性成分的含量。
在上述合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法中，作为优选，步骤B中所述石松打浆液的固液比为1：2.0～5.0。提高原料的利用率，保证有效活性成分的含量。
在上述合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法中，作为优选，步骤C中所述合欢打浆液与石松打浆液的质量比为1：0.5～1.5。能够使发酵液中合欢中的活性成分和石松中活性成分的含量达到更合适的功能，起到更好的协同作用，提高杀蚊效果。
在上述合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法中，作为优选，所述二次发酵培养时使体系的pH值调整为7.2～7.5。目的是为了使枯草芽孢杆菌和后期加入的地衣芽孢杆菌均能够得到较好的生长环境，使更有利用两者的有效生长繁殖，使兼具有对合欢和石松材料的利用和分解，从而实现高效的提取活性成分的效果，使发酵液具有更好的杀蚊和/或驱蚊的效果。
在上述合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法中，作为优选，步骤C中所述灭菌处理后加入纤维素酶，所述纤维素酶的用量为混合液总质量的1.0％～2.0％。能够促进植物纤维组织的降解，从而能够使枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌更充分的利用它们作为营养物质，从而也能够提高有效成分的释放和提取。
在上述合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法中，作为优选，步骤A中所述合欢植物原料选自合欢的新鲜叶子、花和树皮中的一种或几种。有利于提高粉碎效果，且新鲜的组织中用于杀蚊作用的活性成分含量较高。
在上述合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法中，作为优选，步骤A中所述石松植物原料为石松全草。由于石松全草的提取物均能够对东乡伊蚊Ⅳ龄幼虫等有较明显的杀灭作用。因此，采用全草作为原料，也能够使其中的活性成分有效的提取，保证具有较好的杀蚊作用。
综上所述，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1.通过采用枯草芽孢杆菌以合欢打浆液和石松打浆液为主要营养成分进行发酵处理，能够有效的使从合欢和石松中提取出的具有杀蚊活性成分的保持活性，提高杀蚊的效果，且由于无需采用有机溶剂，对环境基本无污染。
2.通过采用枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌共生进行发酵处理，能够使合欢和石松组织中的有效活性成分更好被提取，提高发酵液的整体杀蚊活性。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。
实施例1
选取合欢植物的新鲜叶子作为原料，进行挑选形状完整，叶肉饱满的叶子，进行清洗干净，然后，先剪切成小片状后再通过搅碎机进行粉碎成细粉末后，使粒径达到100目-200目之间，粉碎过程中可以加入少量的水起到降温的作用，再加入适量的水，然后在高速搅拌的条件下进行打浆处理30min，得到相应的合欢叶子的打浆液，其中水的加入量以使合欢叶子的打浆液中固液比为1：3，备用；
再另外选取石松植物全草作为原料，经过去杂和清净后，先剪切成较大的颗粒物，然后，再加入粉碎机中进行一次性粉碎成细小的粉末，使粒径达到100目-200目之间，通过先剪切成较大颗粒物，再进行一次性粉碎成相应大小的粉末，目的是为了避免在粉碎机中经过多次粉碎，受多次剪切力的作用和粉碎过程中高温的影响而破坏活性物质；后适量的加水进行打浆处理，使细粉末均匀的分散在体系内，得到相应的石松打浆液，其中水的加入量以石松打浆液中的固液比为1：5，备用；当然，这里的石松打浆液和合欢叶子打浆液的制作顺序并没有具体限定作用，两者可以相互互换顺序或同时进行均可；
按比例选自上述得到的相应将合欢叶子打浆液和石松打浆液投入到发酵罐内进行搅拌混合，得到混合液，使混合液中合欢叶子打浆液和石松打浆液的质量比为1：0.5，然后，使混合液在90℃的条件下进行灭菌处理30min；然后，根据经灭菌处理后的混合液体系的中pH值情况，调节经灭菌处理后的混合液的体系pH值为6.5～7.5，再按照107cfu/mL的量作为初始浓度将经活化的枯草芽孢杆菌接种到混合液内，这里枯草芽孢杆菌是常规的生物促生菌，可以直接通过购买得到，然后，体系的温度在30℃～35℃的条件下进行发酵培养18天，发酵过程中可以根据需要加入少量的氮源和碳源，碳源如葡萄糖等，氮源如氨基酸等均可，发酵培养结束后，将得到的发酵液进行离心，收集上清液，得到相应的发酵液杀蚊生物制剂，进一步的，还可以根据需要通过加入无菌水稀释浓度。
将得到的发酵液杀蚊生物制剂进行相关的有效活性成分测试，结果表明发酵液中含有有效活性成分总皂苷，具体含有三匝类化合物、黄酮类化合物，且同时发酵液中生物碱的总体含量也较高，活性成分含量丰富，其中，总皂苷的提取效率达到60％以上，而活性成分生物碱的总提取率也达到了75％以上，从而使本发酵液中活性成分较高，具人很好的杀蚊活性，实验测试表明对东乡伊蚊Ⅳ龄幼虫和埃及伊蚊以及致倦库蚊的Ⅳ龄幼虫均具有较好的杀灭效果，杀灭率达到85％以上。
实施例2
选取合欢植物的新鲜树皮作为原料，进行挑选形状完整，叶肉饱满的叶子，进行清洗干净，然后，先剪切成小片状后再通过粉碎机进行一次性粉碎成细粉末后，使粒径达到100目～200目之间，粉碎过程中可以加入少量的水起到降温的作用，再向树皮的细粉中加入适量的水，然后在高速搅拌的条件下进行打浆处理15min，得到相应的合欢树皮的打浆液，其中水的加入量以使合欢叶子的打浆液中固液比为1：5，备用；若因存放时间过长而使出现部分沉淀现象，可以有使用前先进行预搅拌处理；
本实施例中石松全草打浆液的具体的制作方法同实施例1一致，这里不再赘述，其中使石松全草打浆液中的固液比为1：2.0；
按比例选自上述得到的相应将合欢叶子打浆液和石松全草打浆液投入到发酵罐内进行搅拌混合，得到相应的混合液，使混合液中合欢叶子打浆液和石松打浆液的质量比为1：1.0，然后，使混合液在100℃的条件下进行灭菌处理10min；然后，根据经灭菌处理后的混合液体系的中pH值情况，调节经灭菌处理后混合液的体系pH值为6.5～7.2，使有利于促生菌生长的效果，再按照108cfu/mL的量作为初始浓度将经活化的枯草芽孢杆菌接种到混合液内，这里枯草芽孢杆菌是常规的生物促生菌，可以直接通过购买得到，然后，体系的温度在35℃～40℃的条件下进行发酵培养15天，发酵过程中可以根据需要加入少量的氮源氨基酸和碳源葡萄糖等，有利于促进生长，发酵培养结束后，将得到的发酵液进行离心，收集上清液，得到相应的发酵液杀蚊生物制剂。
将得到的发酵液杀蚊生物制剂进行相关的有效活性成分测试，结果表明发酵液中含有有效活性成分总皂苷，具体含有三匝类化合物、黄酮类化合物，且同时发酵液中生物碱的总体含量也较高，活性成分含量丰富，其中，总皂苷的提取效率达到60％以上，而活性成分生物碱的总提取率也达到了72％以上，从而使本发酵液中活性成分较高，具人很好的杀蚊活性，实验测试表明对东乡伊蚊Ⅳ龄幼虫和埃及伊蚊以及致倦库蚊的Ⅳ龄幼虫均具有较好的杀灭效果，杀灭率达到85％以上。
实施例3
选取合欢植物的新鲜花朵作为原料，除杂去除易掉落的细末，进行清洗干净，然后，先剪切成小片状后再通过粉碎机进行一次性粉碎成细粉末后，使粒径达到100目-200目之间，粉碎过程中可以加入少量的水起到降温的作用，再向树皮的细粉中加入适量的水，然后在高速搅拌的条件下进行打浆处理20min，得到相应的合欢花朵的打浆液，其中水的加入量以使合欢叶子的打浆液中固液比为1：4.0，备用；
本实施例中石松全草打浆液的具体的制作方法同实施例1一致，这里不再赘述，其中使石松全草打浆液中的固液比为1：3.5；
按比例选自上述得到的相应将合欢叶子打浆液和石松全草打浆液投入到发酵罐内进行搅拌混合，得到相应的混合液，使混合液中合欢叶子打浆液和石松打浆液的质量比为1：1.5，然后，使混合液在95℃的条件下进行灭菌处理15min；然后，根据经灭菌处理后的混合液体系的中pH值情况，调节经灭菌处理后混合液的体系pH值为6.8～7.3，使有利于促生菌生长的效果，再按照109cfu/mL的量作为初始浓度将经活化的枯草芽孢杆菌接种到混合液内，这里枯草芽孢杆菌是常规的生物促生菌，可以直接通过购买得到，然后，体系的温度在25℃～35℃的条件下进行发酵培养20天，发酵过程中可以根据需要加入少量的氮源氨基酸和碳源葡萄糖等，有利于促进生长，发酵培养结束后，将得到的发酵液进行离心，收集上清液，可将上清液进行减压浓缩来提高有效成分的浓度，得到相应的发酵液杀蚊生物制剂。
将得到的发酵液杀蚊生物制剂进行相关的有效活性成分测试，结果表明发酵液中含有有效活性成分总皂苷，具体含有三匝类化合物、黄酮类化合物，且同时发酵液中生物碱的总体含量也较高，活性成分含量丰富，其中，总皂苷的提取效率达到60％以上，而活性成分生物碱的总提取率也达到了70％以上，从而使本发酵液中活性成分较高，具人很好的杀蚊活性，实验测试表明对东乡伊蚊Ⅳ龄幼虫和埃及伊蚊以及致倦库蚊的Ⅳ龄幼虫均具有较好的杀灭效果，杀灭率达到85％以上。
实施例4
本实施例中的合欢叶子的打浆液和石松全草打浆液的具体制作方法同实施例1一致，这里不再赘述。区别仅在于使合欢叶子的打浆液中的固液比为1：3.5；石松全草打浆液中的固液比为1：3.0。
按比例选取上述得到的相应将合欢叶子打浆液和石松全草打浆液投入到发酵罐内进行搅拌混合，得到混合液，使混合液中合欢叶子打浆液和石松打浆液的质量比为1：1.2，然后，使混合液在85℃的条件下进行灭菌处理10min；然后，根据经灭菌处理后的混合液体系的中pH值情况，调节经灭菌处理后的混合液的体系pH值为6.5～7.0，再按照108cfu/mL的量作为初始浓度将经活化的枯草芽孢杆菌接种到混合液内，这里枯草芽孢杆菌是常规的生物促生菌，可以直接通过购买得到，然后，体系的温度在30℃～35℃的条件下进行发酵培养5天，发酵过程中可以根据需要加入少量的氮源和碳源，碳源如葡萄糖等，氮源如氨基酸等均可；然后，再向发酵罐内加入经活化的地衣芽孢杆菌，且使浓度为106cfu/mL左右，同样，这里的地衣芽孢杆菌也是常用的生物菌，可以通过购买得到，再调整体系的pH值使达到7.2～7.5，再进行二次发酵培养5天，二次发酵培养的温度为30℃～35℃，发酵培养结束后，将得到的发酵液进行离心，收集上清液，得到相应的发酵液杀蚊生物制剂，进一步的，还可以根据需要通过加入无菌水稀释浓度。
将得到的发酵液杀蚊生物制剂进行相关的有效活性成分测试，结果表明发酵液中含有有效活性成分总皂苷，具体含有三匝类化合物、黄酮类化合物，且同时发酵液中生物碱的总体含量也较高，活性成分含量丰富，其中，总皂苷的提取效率达到85％以上，而活性成分生物碱的总提取率也达到了88％以上，从而使本发酵液中活性成分较高，具人很好的杀蚊活性，实验测试表明对东乡伊蚊Ⅳ龄幼虫和埃及伊蚊以及致倦库蚊的Ⅳ龄幼虫均具有较好的杀灭效果，杀灭率达到92％以上。
实施例5
本实施例中的合欢叶子的打浆液和石松全草打浆液的具体制作方法同实施例3一致，这里不再赘述。区别仅在于使合欢花朵的打浆液中的固液比为1：4.5；石松全草打浆液中的固液比为1：3.5。
按比例选取上述得到的相应将合欢叶子打浆液和石松全草打浆液投入到发酵罐内进行搅拌混合，得到混合液，使混合液中合欢叶子打浆液和石松打浆液的质量比为1：0.8，然后，使混合液在90℃的条件下进行灭菌处理15min；然后，根据经灭菌处理后的混合液体系的中pH值情况，调节经灭菌处理后的混合液的体系pH值为6.6～6.9，再按照108cfu/mL的量作为初始浓度将经活化的枯草芽孢杆菌接种到混合液内，这里枯草芽孢杆菌是常规的生物促生菌，可以直接通过购买得到，然后，体系的温度在25℃～30℃的条件下进行发酵培养8天，发酵过程中可以根据需要加入少量的氮源和碳源，碳源如葡萄糖等，氮源如氨基酸等均可；然后，再向发酵罐内加入经活化的地衣芽孢杆菌，且使浓度为105cfu/mL左右，同样，这里的地衣芽孢杆菌也是常用的生物菌，可以通过购买得到，再调整体系的pH值使达到7.2～7.3之间并保持在该范围内，再进行二次发酵培养10天，二次发酵培养结束后，将得到的发酵液进行离心，收集上清液，得到相应的发酵液杀蚊生物制剂，进一步的，还可以根据需要通过加入无菌水稀释浓度。
将得到的发酵液杀蚊生物制剂进行相关的有效活性成分测试，结果表明发酵液中含有有效活性成分总皂苷，具体含有三匝类化合物、黄酮类化合物，且同时发酵液中生物碱的总体含量也较高，活性成分含量丰富，其中，总皂苷的提取效率达到85％以上，而活性成分生物碱的总提取率也达到了90％以上，从而使本发酵液中活性成分较高，具人很好的杀蚊活性，实验测试表明对东乡伊蚊Ⅳ龄幼虫和埃及伊蚊以及致倦库蚊的Ⅳ龄幼虫均具有较好的杀灭效果，杀灭率达到92％以上。
实施例6
本实施例中的合欢叶子的打浆液和石松全草打浆液的具体制作方法同实施例3一致，这里不再赘述。区别仅在于使合欢花朵的打浆液中的固液比为1：4.0；石松全草打浆液中的固液比为1：4.0。
按比例选取上述得到的相应将合欢叶子打浆液和石松全草打浆液投入到发酵罐内进行搅拌混合，得到混合液，使混合液中合欢叶子打浆液和石松打浆液的质量比为1：1，然后，使混合液在90℃的条件下进行灭菌处理15min；再加入纤维素酶，使纤维素酶的用量为混合液总质量的1.0％；然后，根据经灭菌处理后的混合液体系的中pH值情况，调节经灭菌处理后的混合液的体系pH值为6.5～6.8，再按照109cfu/mL的量作为初始浓度将经活化的枯草芽孢杆菌接种到混合液内，这里枯草芽孢杆菌是常规的生物促生菌，可以直接通过购买得到，然后，体系的温度在28℃～32℃的条件下进行发酵培养6天，发酵过程中可以根据需要加入少量的氮源和碳源，碳源如葡萄糖等，氮源如氨基酸等均可；然后，再向发酵罐内加入经活化的地衣芽孢杆菌，且使浓度为105cfu/mL左右，同样，这里的地衣芽孢杆菌也是常用的生物菌，可以通过购买得到，再调整体系的pH值使达到7.3～7.5范围内，再进行二次发酵培养8天，二次发酵培养结束后，将得到的发酵液进行离心，收集上清液，得到相应的发酵液杀蚊生物制剂，进一步的，还可以根据需要通过加入无菌水稀释浓度。
将得到的发酵液杀蚊生物制剂进行相关的有效活性成分测试，结果表明发酵液中含有有效活性成分总皂苷，具体含有三匝类化合物、黄酮类化合物，且同时发酵液中生物碱的总体含量也较高，活性成分含量丰富，其中，总皂苷的提取效率达到85％以上，而活性成分生物碱的总提取率也达到了90％以上，从而使本发酵液中活性成分较高，具人很好的杀蚊活性，实验测试表明对东乡伊蚊Ⅳ龄幼虫和埃及伊蚊以及致倦库蚊的Ⅳ龄幼虫均具有较好的杀灭效果，杀灭率达到92％以上。
实施例7
本实施例中的合欢树皮的打浆液和石松全草打浆液的具体制作方法同实施例3一致，这里不再赘述。区别仅在于使合欢花朵的打浆液中的固液比为1：4.5；石松全草打浆液中的固液比为1：4.0。
按比例选取上述得到的相应将合欢叶子打浆液和石松全草打浆液投入到发酵罐内进行搅拌混合，得到混合液，使混合液中合欢叶子打浆液和石松打浆液的质量比为1：1，然后，使混合液在100℃的条件下进行灭菌处理10min；再加入纤维素酶，使纤维素酶的用量为混合液总质量的2.0％；然后，根据经灭菌处理后的混合液体系的中pH值情况，调节经灭菌处理后的混合液的体系pH值为6.5～6.8，再按照109cfu/mL的量作为初始浓度将经活化的枯草芽孢杆菌接种到混合液内，这里枯草芽孢杆菌是常规的生物促生菌，可以直接通过购买得到，然后，体系的温度在28℃～32℃的条件下进行发酵培养7天，发酵过程中可以根据需要加入少量的氮源和碳源；然后，再向发酵罐内加入经活化的地衣芽孢杆菌，且使浓度为106cfu/mL左右，同样，这里的地衣芽孢杆菌也是常用的生物菌，可以通过购买得到，再调整体系的pH值使达到7.3～7.4之间的范围内并保持的该酸碱度要求，再进行二次发酵培养6天，二次发酵培养结束后，将得到的发酵液进行离心，收集上清液，得到相应的发酵液杀蚊生物制剂，进一步的，还可以根据需要通过加入无菌水稀释浓度。
将得到的发酵液杀蚊生物制剂进行相关的有效活性成分测试，结果表明发酵液中含有有效活性成分总皂苷，具体含有三匝类化合物、黄酮类化合物，且同时发酵液中生物碱的总体含量也较高，活性成分含量丰富，其中，总皂苷的提取效率达到85％以上，而活性成分生物碱的总提取率也达到了90％以上，从而使本发酵液中活性成分较高，具人很好的杀蚊活性，实验测试表明对东乡伊蚊Ⅳ龄幼虫和埃及伊蚊以及致倦库蚊的Ⅳ龄幼虫均具有较好的杀灭效果，杀灭率达到92％以上。
本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
Claims (8)
1.一种合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
A、选取合欢植物原料进行粉碎后，加入水进行打浆处理，得到相应的合欢打浆液；
B、选取石松植物原料进行粉碎后加水进行打浆处理，得到石松打浆液；
C、将合欢打浆液和石松打浆液在发酵罐内进行混合，得到混合液，再进行灭菌处理；
D、调节经灭菌处理后的混合液的体系pH值为6.5～7.5，再按照107cfu/mL～109cfu/mL的量作为初始浓度将经活化的枯草芽孢杆菌接种到混合液内，然后，使在25℃～40℃的条件下进行发酵培养4～8天后，再加入经活化的地衣芽孢杆菌，然后再进行二次发酵培养5～10天，所述二次发酵培养时使体系的pH值调整为7.2～7.5，所述地衣芽孢杆菌的接种量为105cfu/mL～106cfu/mL，结束后，进行离心收集清液，得到相应的发酵液杀蚊生物制剂。
2.根据权利要求1所述合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法，其特征在于，步骤C中所述灭菌处理具体为使混合液在90℃～100℃的条件下进行灭菌处理10～30min。
3.根据权利要求1或2所述合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法，其特征在于，步骤A中所述合欢打浆液的固液比为1：3～5。
4.根据权利要求1或2所述合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法，其特征在于，步骤B中所述石松打浆液的固液比为1：2.0～5.0。
5.根据权利要求1或2所述合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法，其特征在于，步骤C中所述合欢打浆液与石松打浆液的质量比为1：0.5～1.5。
6.根据权利要求1或2所述合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法，其特征在于，步骤C中所述灭菌处理后加入纤维素酶，所述纤维素酶的用量为混合液总质量的1.0％～2.0％。
7.根据权利要求1或2所述合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法，其特征在于，步骤A中所述合欢植物原料选自合欢的新鲜叶子、花和树皮中的一种或几种。
8.根据权利要求1或2所述合欢植物发酵液杀蚊生物制剂的制备方法，其特征在于，步骤A中所述石松植物原料为石松全草。
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