CN112268968A - 一种药物制剂指纹图谱的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种药物制剂指纹图谱的检测方法，本发明检测方法同时检测没食子酸、新绿原酸、绿原酸、1,2,3,4,6‑五没食子酰葡萄糖、4‑香豆酸、苯甲酰芍药苷、丹皮酚、莪术呋喃二烯酮、α‑香附酮等多种中药指标成分，以有效控制本发明药物制剂的内在质量，以进一步保证本发明药物的临床用药安全有效性。

Description

一种药物制剂指纹图谱的检测方法

技术领域

本发明涉及属于药物成分分析检测领域，尤其具体涉及一种药物制剂指纹图谱的检测方法。

背景技术

本发明所述药物制剂为宫瘤消胶囊，该药为山东步长神州制药有限公司独家生产的中药品种，是由牡蛎、香附、三棱、莪术、土鳖虫、仙鹤草、党参、白术、白花蛇舌草、牡丹皮、吴茱萸十一味药材组成，其中香附(制)、三棱、莪术和牡丹皮四味药为全粉入药，其余药味经水煎煮醇沉等工艺后入药。本品具有活血化瘀、软坚散结的功效。用于子宫肌瘤，属气滞血瘀证。症候见：月经量多，夹有大小血块，经期延长，或有腹痛，舌暗红，或边有紫点、瘀斑，脉细弦或细涩。其批准文号为：国药准字Z20055635，其主要功能主治为：活血化瘀，软坚散结。用于子宫肌瘤属气滞血瘀证，该药品目前执行的国家药品标准为：WS-11419(ZD-1419)-2002。该药品标准的薄层鉴别质量控制指标有：莪术对照品、α-香附酮、丹皮酚进行薄层鉴别(TLC)，且在成分含量检测方面，仅对芍药苷单一成分进行含量控制。本申请人对该产品已经布局申请多件专利，其具体专利号分别为：02153455.1、201110218360.5、201110218926.4、201110218927.9、201110218928.3，上述专利保护技术主题围绕从中药处方、制备工艺方法、临床新用途等方面。但因该药物制剂中处方的药味较多，倘若仅以芍药苷一个定量指标无法全面评价该药的内在质量。其也不符合中药多组分多靶点的辨证论治整体观。中药指纹图谱是将图谱中的某些重要特征信息或整体信息用于中药材真伪鉴别或中药质量整体控制。本文首次采用HPLC方法建立了宫瘤消胶囊的指纹图谱，并同时测定多指标成分含量，以保证制剂质量稳定，临床用药安全有效。

本申请人对“本发明药物制剂含量测定方法”方面的技术文献，进行整理分析如下，该药物的含量检测方法主要包括：高效液相色谱法，薄层鉴别法，原子荧光光谱法等。如李丹，秦晓宇，高效液相色谱法测定宫瘤消片中芍药苷含量[J]。黑龙江科技信息，2014(34)：7，该论文公开了，采用乙腈-甲醇-0.1％磷酸溶液(9：8：83)，检测波长为230nm。建立反相高效液相色谱法测定宫瘤消片中芍药苷的含量。孔徐生，孔翔，等.薄层扫描法测定宫瘤消颗粒剂中苦参碱的含量[J]。北方药学，2014，11(02)：4，该论文以苯-丙酮-甲醇(6∶4∶0.5)为展开剂，在硅胶G薄层板上分离苦参碱，以改良碘化铋钾为显色剂，采用双波长反射锯齿扫描测定其含量，最大吸收波长λS510nm，参比波长λR650nm，用薄层扫描法测定宫瘤消颗粒剂中苦参碱的含量。运行，安迎雪，尤海丹.微波消解-原子荧光光谱法测定宫瘤消片中的砷、镉[J].药物分析杂志，2012，32(02):289-291.该文章记载了利用原子荧光光谱法测定了宫瘤消片中镉、砷微量元素的含量。黄小平，李青，张毅等。高效液相色谱法测定宫瘤消片中芍药苷含量[J].中国药业，2010，19(23):26-27.该论文公开了，以流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液(15:85)，检测波长230nm,流速1.0mL/min，柱温25℃，用以测定宫瘤消片中芍药苷的含量。张迪，马晓璐，张国刚.RP-HPLC测定宫瘤消片中芍药苷的含量[J].中国医药导报，2010，7(29):44-46.该文章流动相：乙睛-0.1％磷酸溶液(15∶85)测定宫瘤消片中芍药苷含量的方法。陈大中，宗鸣等.HPLC法测定宫瘤消胶囊中丹皮酚的含量[J].中国中医药科技，2008(02)：12.该论文中介绍了，通过以流动相：甲醇-水(45：55)，流速：1.0ml/min，柱温：30℃，检测波长：274nm，测定宫瘤消胶囊中丹皮酚的含量。经过对上述文献的检索分析可知，上述绝大多数文献研究的质量标准技术主要集中在对芍药苷，丹皮酚等单一指标成分的含量测定方法上。但由于本发明药物制剂是由蛎、香附、三棱、莪术、土鳖虫、仙鹤草、党参等多种中药材经过加工、提取、干燥，粉碎，混合等加工等步骤制备而成，其药物的成分是多种药材的复合成分的中药制剂。而本项目采用中药指纹图谱检测技术手段，它是建立在对中药制剂的众多有效成分研究基础上，该方法主要用于评价中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。为了更全面地评价本发明药物的内在质量。

发明内容

本发明的目的是提供一种药物制剂指纹图谱的检测方法，本发明采用HPLC方法建立了本发明药物制剂的指纹图谱，并同时测定没食子酸、新绿原酸、绿原酸、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、4-香豆酸、苯甲酰芍药苷、丹皮酚、莪术呋喃二烯酮、α-香附酮等多种中药指标成分，以有效控制本发明药物制剂的内在质量，以进一步保证临床用药安全有效。本发明检测方法还对4-香豆酸、丹皮酚、莪术呋喃二烯酮、α-香附酮作为定量分析指标成分，对本发明药物制剂的含量成分进行限量控制，这对本发明药物质量稳定性有了参考依据。综上所述，本发明所建立的HPLC指纹图谱方法和多指标成分测定方法可有效评价本发明药物制剂的质量。

本发明药物制剂的组成配比为：牡蛎210g、香附128g、三棱64g、莪术64g、土鳖虫64g、仙鹤草126g、党参64g、白术64g、白花蛇舌草210g、牡丹皮128g、吴茱萸64g制备而成。

本发明药物制剂的制备方法为：以上十一味药材，取三棱、莪术、香附(制)、牡丹皮，粉碎成细粉；其余白花蛇舌草等七味药材，加水煎煮二次，第一次1.5小时，第二次1小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.05～1.08(50℃)的清膏，加乙醇使含醇量达50％，冷藏24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.32～1.35(50℃)的稠膏，与上述细粉混匀，干燥，粉碎，加入淀粉，混匀，制成颗粒，过筛，装入胶囊，即得。

本发明药物制剂不局限于所研究对象特指的宫瘤消胶囊，其还包括含有以牡蛎、香附、三棱、莪术、土鳖虫、仙鹤草、党参、白术、白花蛇舌草、牡丹皮、吴茱萸等中药材制备而成的药物制剂。

本发明药物制剂可以为由牡蛎、香附、三棱、莪术、土鳖虫、仙鹤草、党参、白术、白花蛇舌草、牡丹皮、吴茱萸提取而制备的中药提取物，加入药剂学常用药用辅料制成口服制剂，如：胶囊剂、片剂、口服液、丸剂、颗粒剂等。

本发明所提供的技术方案如下：

一种药物制剂指纹图谱的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

⑴、供试品溶液的制备：取本发明药物制剂，精密称定，置锥形瓶中，精密加入60％～90％甲醇，称定重量，超声处理20～40分钟，放冷，再称定重量，用60％～90％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得；

⑵、混合对照品标准液的制备：分别精密称取没食子酸、新绿原酸、绿原酸、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、4-香豆酸、苯甲酰芍药苷、丹皮酚、莪术呋喃二烯酮、α-香附酮对照品适量，加甲醇稀释成混合对照品溶液；

⑶、阴性样品溶液的制备：按照药物制剂的生产处方工艺制法，制备缺“三棱、白花蛇舌草，缺牡丹皮，缺莪术，缺香附”的阴性样品，按照“步骤⑴”项下方法制备阴性样品溶液；

⑷、色谱条件：色谱柱以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，流动相A为乙腈，流动相B为0.2％磷酸水溶液，梯度洗脱比例为：0～25min，10％A→55％；26～35min，90％A)；检测流速：0.8～1.2mL·min^-1，检测波长：230～330nm，检测柱温：23～33℃；

⑸、色谱峰测定：将上述步骤⑴、⑵和⑶所制得的供试品溶液、混合对照品溶液、阴性样品溶液，注入液相色谱仪，按照上述步骤⑷的色谱条件，测定记录色谱图，即得。

优选的，所述步骤⑴供试品溶液的制备中，所述甲醇体积浓度为85％。

优选的，所述步骤⑵混合对照品标准液的制备中，其中对4-香豆酸、丹皮酚、莪术呋喃二烯酮、α-香附酮4种对照品进行含量检测，所述4-香豆酸的进样量范围为0.0508～0.6350μg、丹皮酚的进样量范围为1.5970～19.9625μg、丹皮酚的进样量范围为0.1498～1.8725μg、莪术呋喃二烯酮的进样量范围为0.1088～1.3600μg。

优选的，所述步骤⑷色谱条件，所述色柱型号为：Kromasil-100-5。

作为进一步的优选，所述步骤⑷色谱条件，所述检测流速：1.0mL·min-1，所述检测波长为：切换波长检测：0～15min，310nm；15～35min，245nm；所述柱温：30℃。

为了突出本发明药物制剂含量检测方法技术方案创新性，我们将本实验过程中筛选的部分实验提供如下。

①、检测波长的选择

对于中药复杂体系的含量测定，检测波长的选择至关重要。试验采用二极管阵列检测器对供试品溶液进行200～600nm全波长扫描，各成分最大吸收波长相差较大，没食子酸、新绿原酸、绿原酸、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、4-香豆酸、芹菜素-7-葡萄糖苷、苯甲酰芍药苷、丹皮酚、莪术呋喃二烯酮、α-香附酮的最大吸收波长分别在271nm、325nm、326nm、280nm、310nm、336nm、230nm、274nm、207nm、249nm，采用单一测定波长难以同时检测各化学成分，最终结合各成分的最大吸收波长，并能使各成分有较高响应，采用波长切换方法测定，0～15min选择310nm，15～35min选择245nm。

②、测定成分的选择

本发明建立的指纹图谱共有模式中确认了16个共有峰，这16个成分来源于牡丹皮、党参、吴茱萸、白花蛇舌草、三棱、仙鹤草、莪术、香附八味药材，除一味矿物药牡蛎、一味动物药土鳖虫、一味植物药白术未有成分表征外，该指纹图谱方法基本反映了本发明药物制剂的整体特征。本发明药物制剂根据药物制剂中含有的4味中药材的君臣佐使的配伍剂量关系，在已建立的指纹图谱方法基础上，进一步选择4-香豆酸、丹皮酚、莪术呋喃二烯酮、α-香附酮作为4个药味的定量指标成分。

③、色谱条件探索

流动相的确定

本发明在确定色谱流动相摸索过程中，在前期已建立牡丹皮、三棱、莪术和醋香附四味药材的指纹图谱的基础上，均采用乙腈-磷酸水流动相系统，均能获得较好的分离效果。牡丹皮、三棱、莪术和醋香附是宫瘤消胶囊中最主要的四个原粉投料的药味，预实验选择乙腈-磷酸水流动相系统色谱分离较好，磷酸比例为0.1％、0.2％、0.4％时，色谱行为无显著差异，故以乙腈-0.2％磷酸水为流动相。预实验发现，宫瘤消胶囊中化学成分明显分为两类，一类是极性较大出峰较快的成分，主要来源于牡丹皮、吴茱萸、白花蛇舌草和仙鹤草等药味，另一类是极性较小出峰较慢的性成分，主要来源于牡丹皮、莪术和醋香附，采用梯度洗脱对各化学成分进行分离，这样对本发明药物制剂中的主要药材进行定性鉴别，有利于该药品的内在质量控制。

本发明药物制剂含量检测方法具有以下有益效果：

⑴、本发明建立了宫瘤消胶囊的HPLC指纹图谱，共确定了16个共有色谱峰，与对照品溶液色谱相比较，并鉴定确认了10个指标成分，分别为没食子酸、新绿原酸、绿原酸、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、4-香豆酸、芹菜素-7-葡萄糖苷、苯甲酰芍药苷、丹皮酚、莪术呋喃二烯酮、α-香附酮指标成分，利用相似度评价软件对13批样品指纹图谱进行分析，各批样品相似度均在0.98以上。由此可知，本发明HPLC指纹图谱可以对本发明药物制剂中的10种有效成分进行定性鉴别，以保证本发明药物制剂的内在质量稳定性。

⑵、本发明指纹图谱检测方法，还选择对4-香豆酸、丹皮酚、莪术呋喃二烯酮、α-香附酮作为定量分析指标成分，4个成分分离度良好，线性关系良好，平均回收率分别为103.7％、103.9％、96.8％、103.2％，RSD均≤2.0％。该方法的精密度、稳定性、重复性良好。

⑶、本发明指纹图谱检测方法对13批本发明药物制剂中4-香豆酸、丹皮酚、莪术呋喃二烯酮、α-香附酮4个有效成分含量测定结果分别为0.113～0.268mg·g^-1、4.277～4.868mg·g^-1、0.374～0.507mg·g^-1、0.266～0.315mg·g^-1，该含量检测方法具备定性和定量双重评价功能，该检测方法简单、准确、稳定，可为本发明药物制剂的质量评价提供更加全面的科学依据。

⑷、本发明建立的指纹图谱检测方法，并利用相似度评价软件对13批样品指纹图谱进行分析，各批样品相似度均在0.98以上，这也符合中成药多组分多靶点形成协同治疗的整体辨证观。

综上所述，本发明药物制剂的指纹图谱检测方法可以对本发明药物制剂中所含牡丹皮、党参、吴茱萸、白花蛇舌草、三棱、莪术、香附中的有效指标成分进行定性指纹图谱鉴别，又同时测定4-香豆酸、丹皮酚、莪术呋喃二烯酮、α-香附酮4个成分的含量，具备定性和定量双重评价功能。本发明指纹图谱检测方法具有操作简单、准确、稳定的特点，这也可为本发明药物制剂(宫瘤消胶囊)的质量评价提供更加全面的科学依据。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。本发明所述供试品为宫瘤消胶囊。

图1-13批本发明药物制剂HPLC指纹图谱和对照指纹图谱(R)；

图2-10种药品指标成分混合对照品HPLC色谱图；

图3-本发明药物制剂HPLC色谱图。

具体实施方式

为了更加充分理解本发明的实施，下面通过典型的实施例对本发明做进一步的说明。除非另作定义，本发明专利申请说明书以及权利要求书中使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

实施例1：

1仪器与试药

Waters 2695-2998高效液相色谱仪(Waters公司)；中药色谱指纹图谱相似度评价评价软件(2012.130723版本)；XSE205十万分之一电子天平(METTLER公司)；BK-600C超声波清洗仪(巴克超声设备有限公司)。

对照品没食子酸(批号110831-201204，以89.90％计)、绿原酸(批号110753-201314，以96.6％计)、4-香豆酸(批号112037-201801，以99.3％计)、丹皮酚(批号110708-201407，以99.90％计)、α-香附酮(批号110748-201815，以99.7％计)均购于中国食品药品检定研究院；新绿原酸(批号130113001，≥98％)、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖(批号17060201，以98.50％计)、苯甲酰芍药苷(批号17061803，以99.28％计)均购于成都曼思特生物科技有限公司；芹菜素-7-葡萄糖苷(批号ZZS-20-146-A5，以99.36％计)购于上海甄准生物科技有限公司；莪术呋喃二烯酮(批号P15M7F11225，≥98％)购于上海源叶生物科技有限公司。

宫瘤消胶囊13批(山东步长神州制药有限公司，批号分别为：200502、200503、200504、200601、200602、200603、200604、200605、200701、200702、200703、200704、200705。)。

药材：香附(制)(批号：190501337-1)、三棱(批号：190824009-1)、莪术(批号：190825355-1)、土鳖虫(批号：190825355-1)、仙鹤草(批号：190418123-1)、党参(批号：190503364-1)、白术(批号：190419125-1)、白花蛇舌草(批号：190422141-1)、牡丹皮(批号：190701229-1)、吴茱萸(批号：190505228-1)、牡蛎(批号：190412230-1)药材均由山东步长制药有限公司提供。

乙腈(Honeywell B&J)和磷酸(上海阿拉丁生物科技有限公司)均为色谱纯；其余试剂均为分析纯；水为Milli-Q超纯水(Millipore Co.)。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Kromasil-100-5-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.2％磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～25min，10％A→55％；26～35min，90％A)；流速：1.0mL·min^-1，切换波长检测：0～15min，310nm；15～35min，245nm；柱温：30℃，进样量10～20μL。

2.2溶液制备

2.2.1混合对照品溶液的制备

10种成分混合对照品溶液：分别精密称取没食子酸、新绿原酸、绿原酸、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、4-香豆酸、芹菜素-7-葡萄糖苷、苯甲酰芍药苷、丹皮酚、莪术呋喃二烯酮、α-香附酮对照品适量，加甲醇制成每1mL含没食子酸38.92μg、新绿原酸20.70μg、绿原酸16.18μg、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖0.1771mg、4-香豆酸12.78μg、芹菜素-7-葡萄糖苷30.02μg、苯甲酰芍药苷62.32μg、丹皮酚0.4011mg、莪术呋喃二烯酮38.22μg、α-香附酮27.21μg的混合对照品溶液；

4种成分混合混合对照品溶液：分别精密称取4-香豆酸对照品、丹皮酚对照品、莪术呋喃二烯酮、α-香附酮对照品适量，精密称定，加85％甲醇制成每1ml含4-香豆酸0.0254mg、丹皮酚0.7985mg、莪术呋喃二烯酮0.0749mg、α-香附酮0.0544mg的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备

取本品2.0g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入85％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟(功率600W，频率40kHz)，放冷，再称定重量，用85％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

2.2.3单味药溶液与阴性样品溶液

分别取香附(制)、三棱、莪术、土鳖虫、仙鹤草、党参、白术、白花蛇舌草、牡丹皮、吴茱萸药材粉末各1.0g，按照“2.2.2”项下方法制备处方中十味药材溶液。

按照宫瘤消胶囊处方工艺，制备缺三棱、白花蛇舌草，缺牡丹皮，缺莪术，缺香附(制)的阴性样品，按照“2.2.2”项下方法制备阴性样品溶液。

2.3 HPLC指纹图谱的建立

2.3.1精密度试验

分别精密吸取同一供试品溶液(批号200503)20μL，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱图。以丹皮酚为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，相对保留时间的RSD均小于0.1％，相对峰面积的RSD均小于2.76％，表明仪器精密度良好。

2.3.2稳定性试验

分别精密吸取同一供试品溶液(批号200503)20μL，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、5、10、15、20、25h进样，记录色谱图。以丹皮酚为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，相对保留时间的RSD均小于0.14％，相对峰面积的RSD均小于2.75％，表明供试品溶液在25h内稳定。

2.3.3重复性试验

取同一批宫瘤消胶囊样品(批号200503)，按照“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别精密吸取20μL，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。以丹皮酚为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，相对保留时间的RSD均小于0.10％，相对峰面积的RSD均小于4.90％，表明方法重复性良好。

2.3.4指纹图谱建立及相似度评价

取宫瘤消胶囊样品13批(S1～S13)，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取20μL，按“2.1”项下色谱条件进样分析，将色谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价评价软件(2012.130723版本)，以S1号样品为参照峰，采用中位数法，时间窗设定为0.1，多点校正，经全谱匹配共确定16个共有峰，并生成指纹图谱共有模式(R)。结果13批样品相对于共有模式的相似度分别为0.985、0.993、0.992、0.992、0.998、0.994、0.999、0.999、0.999、0.998、0.999、1.000、0.995、均大于0.98，说明各样品具有较好的一致性。指纹图谱叠加图谱及其共有模式，参见说明书附图1。

2.3.5色谱峰的指认、归属

取10种成分混合对照品溶液、供试品溶液和单味药溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，通过各色谱峰保留时间、紫外光谱信息并结合混合对照品色谱图信息，指认出其中10个色谱峰。将单味药材色谱图与样品色谱图对比分析，确定各色谱峰的归属药味，其中4号、6号色谱峰在单味药材比对中未有相应峰，推测为煎煮过程中产生的成分。其中11号丹皮酚分离度良好，保留时间居中，峰面积较大，因此选择作为参考峰。色谱峰指认信息及药味归属见表1，10种成分混合对照品及供试品色谱图，见图2～3。

表1本发明药物制剂指纹图谱色谱峰指认及药味归属结果

2.4本发明药物制剂中多指标成分定量分析

2.4.1专属性试验

分别精密吸取4种混合对照品溶液10μL、供试品溶液及阴性样品溶液20μL，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。由图可见，阴性样品色谱在与对照品相应保留时间位置上无色谱峰，表明对测定无干扰，方法专属性良好。

2.4.2线性关系考察

分别精密吸取“2.2.1”项下的4种成分混合对照品溶液2μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL，按“2.1”项下色谱条件进样。以对照品的进样量(X)横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程。4种成分在线性范围内均成良好的线性关系。测定结果见表2。

表2 4种成分线性关系考察

2.4.3精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下的4种成分混合对照品溶液10μL，连续进样6次，测定峰面积值。4-香豆酸、丹皮酚、莪术呋喃二烯酮、α-香附酮峰面积的RSD分别为0.43％、0.36％、0.87％、1.57％，实验结果表明该仪器的精密度良好。

2.4.4重复性试验

取同一批样品(批号200503)，按照“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别精密吸取20μL，按“2.1”项下色谱条件进样分析，计算含量。4-香豆酸、丹皮酚、莪术呋喃二烯酮、α-香附酮的平均含量分别为0.1226、4.3898、0.4762、0.2933mg·g^-1，4个成分的RSD值均小于2％，表明方法重复性良好。

2.4.5加样回收率试验

称取已知含量的样品(批号200503)6份，每份1.0g，精密称定，置锥形瓶中，分别精密加入“2.2.1”项下的4种成分混合对照品溶液5mL，再精密加入85％甲醇20ml，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用85％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。分别精密吸取“2.2.1”项下的4种成分混合对照品溶液10μL及上述供试品溶液20μL，测定，计算加样回收率。结果见表3。

表3 4个成分加样回收率测定结果

2.4.6样品测定

取13批本发明药物制剂，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定4个成分的含量，结果见表4。

表4样品测定结果(单位：mg·g^-1)

最后应说明的是：本发明并不局限于上述的具体实施方案，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下，但凡在本发明的精神和实质范围内，所作的任何改变、等同替换和改进，均在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种药物制剂指纹图谱的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

⑴、供试品溶液的制备：取本发明药物制剂，精密称定，置锥形瓶中，精密加入60％～90％甲醇，称定重量，超声处理20～40分钟，放冷，再称定重量，用60％～90％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得；

⑵、混合对照品标准液的制备：分别精密称取没食子酸、新绿原酸、绿原酸、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、4-香豆酸、苯甲酰芍药苷、丹皮酚、莪术呋喃二烯酮、α-香附酮对照品适量，加甲醇稀释成混合对照品溶液；

⑶、阴性样品溶液的制备：按照药物制剂的生产处方工艺制法，制备缺“三棱、白花蛇舌草，缺牡丹皮，缺莪术，缺香附”的阴性样品，按照“步骤⑴”项下方法制备阴性样品溶液；

⑷、色谱条件：色谱柱以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，流动相A为乙腈，流动相B为0.2％磷酸水溶液，梯度洗脱比例为：0～25min，10％A→55％；26～35min，90％A)；检测流速：0.8～1.2mL·min^-1，检测波长：230～330nm，检测柱温：23～33℃；

⑸、色谱峰测定：将上述步骤⑴、⑵和⑶所制得的供试品溶液、混合对照品溶液、阴性样品溶液，注入液相色谱仪，按照上述步骤⑷的色谱条件，测定记录色谱图，即得。

2.如权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述检测方法步骤⑴供试品溶液的制备中，所述甲醇体积浓度为85％。

3.如权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述检测方法步骤⑵混合对照品标准液的制备中，其中对4-香豆酸、丹皮酚、莪术呋喃二烯酮、α-香附酮4种对照品进行含量检测，所述4-香豆酸的进样量范围为0.0508～0.6350μg、丹皮酚的进样量范围为1.5970～19.9625μg、丹皮酚的进样量范围为0.1498～1.8725μg、莪术呋喃二烯酮的进样量范围为0.1088～1.3600μg。

4.如权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述检测方法步骤⑷色谱条件，所述色柱型号为：Kromasil-100-5。

5.如权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述步骤⑷色谱条件，所述检测流速：1.0mL·min-1，所述检测波长为：切换波长检测：0～15min，310nm；15～35min，245nm；所述柱温：30℃。

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