CN112251532B - 一种大豆杂交F1代真实性鉴定的InDel分子标记 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大豆杂交F1代真实性鉴定的InDel分子标记，本发明所开发的多态性InDel分子标记，通过PCR扩增、琼脂凝胶电泳检测即可完成，解决了通过杂交F1代表型鉴定困难、准确性相对较低等问题，在杂交组合亲本选择时不再考虑其表型性状，只要两个亲本存在一定血缘差异，基本可以从这25个InDel标记筛选出多态性标记。利用本发明InDel标记方法鉴定大豆杂交F1代真实性，对仪器设备要求不高，常规PCR、琼脂凝胶电泳便可完成，操作步骤简单，结果准确可靠。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种大豆杂交F1代真实性鉴定的InDel分子标记。
背景技术
大豆杂交育种和遗传分离群体构建均需要选择2个大豆材料进行杂交。大豆杂交过程一般是去除母本雄蕊，保留雌蕊，取父本的花粉，涂抹在母本的雌蕊上。但是大豆属于自花、闭花授粉作物，存在母本去除雄蕊前已经授粉的情况，导致杂交F1代有可能不是真实的杂交F1，而是母本自交，因此十分有必要检测杂交F1代的真实性。
目前，大豆杂交F1代植株真实性鉴定一般采用F1代植株表型鉴定，例如，以花的颜色(紫色对白色为显性)来鉴定杂交F1代的真实性，但只能针对特定杂交组合：白色花材料为母本，紫色花材料为父本，F1代植株花的颜色为紫色则为真实F1，白色则为假F1。如果组配其他杂交组合：母本紫花×父本白花，或母本白花×父本白花、母本紫花×父本紫花，则无法根据F1代植株花的颜色判断其真实性。如果杂交组合两个亲本表型性状相似，得到的F1代植株表型与亲本差异不明显，难以对其真实性做出准确鉴定。另外，即使杂交组合两个亲本表型性状在株高、分枝数、叶片大小等方面差异较大，但这些性状属于数量性状，容易受到环境影响，难以作为鉴定F1代真实性的有效性状。现有的根据表型性状鉴定F1代植株真实性，存在一定局限性，要么对杂交组合两个亲本有特定的组合要求(如根据花的颜色)，要么鉴定难度大，且误差较大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何利用分子标记来鉴定大豆杂交F1代真实性。
本发明的技术方案为：大豆杂交F1代真实性鉴定的InDel标记的引物组合，如下表所示：
上述所述的InDel标记的引物组合可用于大豆杂交F1代真实性鉴定上。
具体方法为：提取杂交组合亲本、F1代植株基因组DNA，以杂交组合两个亲本、F1代植株基因组DNA为模板，利用上述InDel标记的引物筛选杂交组合亲本间多态性InDel标记，选取一个或多个多态性InDel进行PCR扩增F1代植株，然后琼脂糖凝胶电泳检测；如果F1代植株具有两个亲本带型，则为真实的F1；如果F1代植株只具有母本带型，则为假的F1。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所开发的多态性InDel分子标记，通过PCR扩增、琼脂凝胶电泳检测，解决了通过表型无法准确鉴定杂交F1代真实性的问题，在杂交组合亲本选择时不需考虑其表型性状，只要两个亲本存在一定血缘差异，基本可以从这25个InDel标记筛选出多态性标记，经检测，真实F1代植株扩增出两个亲本带型，假F1代植株只扩增出母本带型，容易鉴定F1真实性。总之，利用本发明InDel标记方法鉴定大豆杂交F1代真实性，对仪器设备要求不高，常规PCR、琼脂凝胶电泳便可完成，操作步骤简单，结果准确可靠。
附图说明
图1部分杂交F1代植株InDel标记鉴定电泳图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
1、InDel标记的筛选
通过对18份大豆种质资源(表1)全基因组重测序，将各个样本测序所得reads比对到大豆参考基因组william82序列上，检测插入/缺失位点(InDel)，比较分析18个样本间的InDel位点，从中选取插入/缺失碱基数在13-50bp，并在18个样本间具有多态性的InDel位点；在基因组william82序列上，提取InDel位点两侧200bp序列，以此序列为基础，设计PCR扩增引物。随机挑选73个InDel标记，在18份大豆种质资源中验证其有效性，最后获得具有高多态性、适合琼脂糖凝胶电泳检测的25个InDel标记(表2)(SEQ ID No.1～50)。
表1 18份大豆资源信息表
表2大豆杂交F1代真实性鉴定的25个InDel标记信息表
2、InDel标记的验证
从上述25个多态性InDel标记中，针对每个杂交组合，以杂交组合两个亲本、F1代植株DNA为模板进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，筛选每个杂交组合亲本间具有多态性的InDel标记，选取多态性InDel标记鉴定F1代植株真实性，结合F1植株田间表型鉴定，检测F1代植株在多态性InDel标记中扩增的条带类型。理论上，真实F1代植株应扩增出杂交组合两个亲本的条带类型，假的F1只有母本的带型。
(1)、杂交组合两个亲本、F1代植株基因组DNA提取
采用CTAB法提取13个杂交组合及其F1代植株基因组DNA，具体步骤如下：
1、取新鲜叶片(保持干净、表面无水)，用剪刀剪碎，装入2ml EP管内，放入1颗玻璃珠(半径6mm)，叶片所占体积不超过EP管1/4，若非立即提取，叶片尽快置于-80℃冰箱或放入液氮冷中保存；
2、将装有叶片的EP管放入磨样盒中，液氮冷冻3min(若从冰箱冷冻取出，迅速放入液氮中极冻，防止样品损坏，冷冻3min)，高通量组织研磨机打碎叶片，参数为1000rmp，45sec，重复1次；
3、在破碎样品内加入850μl提前65℃水浴的2×CTAB(按1:1000加入β-巯基乙醇)2ml，快速上下混匀样品，置于65℃水浴45min，间隔10min轻微上下颠倒；
4、取出后，冷却至室温，在通风橱内加入850μl 24:1(V三氯甲烷：V异戊醇＝24:1)；
5、摇床匀速且缓慢摇动15min；
6、10000rmp离心10min；
7、吸取上清液到提前装有700μl异丙醇的1.5ml EP管中，轻微上下摇动，静置待DNA絮状析出；
8、5000rmp离心2min；倒出上部液体，加入500μl 75％酒精洗涤2次沉淀，无水乙醇洗涤1次，干燥DNA；
9、用300μl超纯水(ddH2O)溶解上述DNA；
10、用DNA snap2.0检测DNA浓度和吸光值(OD值)，调节DNA浓度至50-100ng/ul。
(2)、PCR扩增：
表3PCR扩增体系为：
表4PCR扩增程序为：
(3)、3.5％琼脂糖凝胶电泳检测：称取3.5g琼脂糖，加入100ml TBE缓冲液，微波炉煮沸至有大气泡，冷却至70℃左右，加入goldview染液，倒胶入模具中，插梳子，静置30min使其凝固；将上述杂交组合两个亲本PCR产物相邻点入梳空中，电泳电压为180V，电泳时间60-80min；在凝胶成像系统中成像，观察杂交组合亲本间带型；InDel标记在两个亲本间存在上下不一样的带型为多态性InDel标记。
经过PCR扩增、电泳检测，所开发的25个InDel标记在13个随机杂交组合中两个亲本间具有多态性的标记个数为1-16，平均9.23个，多态率为4％-64％(表5)。
表5杂交组合两个亲本间多态性InDel统计表
图1为部分杂交组合亲本及F1代的凝胶电泳图，A为杂交组合Z10亲本及F1代用InDel标记组合中的SIM-23、SIM-60和SIM-64为引物扩增得到的凝胶电泳图，从图中看出，两株F1代植株均能扩增出父本和母本的特征条带，证明两株F1代均为真F1植株。B为杂交组合Z11亲本及F1代用InDel标记组合中的SIM-23、SIM-60和SIM-64为引物扩增得到的凝胶电泳图，从图中看出，其中一株F1植株均能扩增出父本和母本的特征条带，证明该株F1代为真F1植株。另一株F1植株不能同时扩增出父本和母本的特征条带，证明其为假F1植株。C为杂交组合B2亲本及F1代用InDel标记组合中的SIM-19为引物扩增得到的凝胶电泳图，从图中看出，6株F1代植株中有四株能同时扩增出父本和母本的特征条带，证明其为真F1植株，另外两株不能同时扩增出父本和母本的特征条带，证明其为假F1植株。
序列表
<110> 四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所
<120> 一种大豆杂交F1代真实性鉴定的InDel分子标记
<160> 50
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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Claims (3)
1.大豆杂交F1代真实性鉴定的InDel标记的引物组合，如下表所示：
2.权利要求1所述的InDel标记的引物组合在大豆杂交F1代真实性鉴定上的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：提取杂交组合亲本、F1代植株基因组DNA，以杂交组合两个亲本、F1代植株基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的InDel标记的引物筛选杂交组合亲本间多态性InDel标记，选取一个或多个多态性InDel标记进行PCR扩增F1代植株，然后琼脂糖凝胶电泳检测；如果F1代植株具有两个亲本带型，则为真实的F1；如果F1代植株只具有母本带型，则为假的F1。
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2020
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|---|---|
| CN112251532A (zh) | 2021-01-22 |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| CB02 | Change of applicant information |
Address after: No.159, section 3, Huajin Avenue, Qingbaijiang District, Chengdu, Sichuan 610300 Applicant after: Cash crop Research Institute of Agricultural science Address before: No.159, section 3, Huajin Avenue, Qingbaijiang District, Chengdu, Sichuan 610300 Applicant before: INDUSTRIAL CROP Research Institute |
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| CB02 | Change of applicant information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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