CN112245456B - 一种拟黑多刺蚁提取物在制备抗脑缺血药物中应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种拟黑多刺蚁提取物在制备抗脑缺血药物中应用，所述拟黑多刺蚁提取物的提取方法为：取拟黑多刺蚁细粉，加入有机溶媒加热回流提取，减压回收有机溶媒。本发明首次发现拟黑多刺蚁提取物具有明显的改善血脑屏障损伤活性，且脂溶性较高，容易通过大脑血脑屏障，具有制备抗脑缺血药物或者具有抗脑缺血功能药物的成药潜力，为开发抗脑缺血药物创新药物提供了新的物质基础，具有潜在且巨大的社会效益和经济效益。

Description

一种拟黑多刺蚁提取物在制备抗脑缺血药物中应用

技术领域

本发明属于中医药技术领域，具体涉及一种拟黑多刺蚁提取物在制备抗脑缺血药物中应用。

背景技术

脑卒中包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，缺血性脑卒中约占60%-80%。缺血性脑卒中是由局部脑供血、供氧不足或中断引起的脑部局灶性功能障碍，常见的有短暂脑缺血发作、脑栓塞、脑血栓等，是世界范围内重大的脑血管疾病，是临床常见的为危重病、多发病，往往预后较差，具有发病率和致残致死率高的特点，目前尚缺乏治疗或延缓脑缺血损伤的有效方法。缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI) 是指组织在遭受一定时间缺血，恢复血液供应后，组织损伤程度加重的病理现象。缺血引起的脑组织缺氧以及缺血再灌注，触发了一系列脑缺血级联反应，最终导致神经元死亡和神经功能障碍。

现代医学研究关于脑缺血的发生机制有能量代谢障碍、血小板聚集、血管收缩及微循环障碍、自由基损伤、兴奋性氨基酸毒性作用、细胞内钙离子超载、炎症损伤、NO和NOS的作用、细胞凋亡等，病理生理机制复杂；脑缺血损伤是由于脑部血液循环障碍，造成细胞能量代谢衰竭，从而启动的损伤级联反应的结果。该损伤级联反应主要涉及兴奋性神经毒性、酸中毒、炎症反应、氧化和硝化应激、围梗死去极化、细胞凋亡等方面。现代医学防治脑缺血多采用药物性干预，临床可用于防治脑缺血的药物主要有抗血小板药的阿司匹林、氯吡格雷、噻氯匹定和阿司匹林-双嘧达莫，抗凝剂的肝素、低分子肝素，口服抗凝剂的华法林、双香豆素针，溶栓的尿激酶 (UK)、链激酶 (SK)，血管扩张剂麦角溴烟酯，自由基清除剂超氧化物歧化酶、地塞米松、甘露醇、维生素E，钙拮抗剂尼莫地平，谷氨酸受体拮抗剂，NOS抑制剂及他汀类药物等，其中以阿司匹林抗血小板聚集的应用最多。但是现有的药物由于价格较贵且给药方式受限、副作用多而不适宜反复应用或因用药时间长、给药剂量大等使应用受到了限制。

近些年来，国内外学者将目光投向天然药物（中药或中药制剂）的开发，中药治疗脑血管疾病的历史悠久，且中药具有副作用小等优点；中药保护缺血性脑损伤多通过降低兴奋性神经递质和酸的毒性作用、抑制脂质过氧化和硝化反应、减轻炎症反应和抑制细胞凋亡等途径来实现，具有多靶点、多层次、多环节的脑保护作用，能从多条路径干预脑缺血，减轻脑缺血再灌注的损伤。如，河南中医学院在专利CN 101978987 B、CN 102008521 B、CN103417679 B分别提出了冬凌草提取物、凌霄花提取物、玫瑰花总黄酮在制备治疗抗脑缺血药物中的应用；西北大学在专利CN 103800826 B提出了黄姜提取物在制备抗脑缺血药物中的应用。尚远宏和徐晓玉总结了截至2013年近 10 年来对脑缺血具有保护作用的中药及其提取物，包括植物药、动物药和矿物药共35 种单味药，国内外文献中的实验研究都表明从中药得到的单体成分(如银杏内酯B、川芎嗪、人参皂苷 Rb₃和丹参酮Ⅱ等)或提取物 (如山楂醇提物、当归水提物和地龙提取物等)，及多种药物组方(如银杏达莫注射液、参龙健脑胶囊和参芎注射液等)可通过脑缺血的病理生理机制中的各种途径来实现对缺血性脑损伤的保护作用，充分说明中药及其提取物对于缺血性脑损伤保护作用的研究前景广阔（见尚远宏,徐晓玉.中药及其提取物对脑缺血保护作用的实验研究进展[J]，《中国中药杂志》2013年8期）。

拟黑多刺蚁(Polyrhachis vicina Roger)，又称鼎突多刺蚁、俗称黑蚂蚁，是指蚁科（Formicidae）多刺蚁属（Polyrhachis spp.）昆虫，中国南方各省均有分布。拟黑多刺蚁，味咸、酸，性平；归肝、肾经；具补肾益精、通经活络、解毒消肿之功效；主治肾虚头晕耳鸣、失眠多梦、阳痿遗精、风湿痹痛、中风偏瘫、手足麻木、红斑狼疮、毒蛇咬伤等症。拟黑多刺蚁全身含有 19种氨基酸，其中包括人体必需的 8种氨基酸，蛋白质含量高达 40-60%；并含有多种维生素及微量元素，其中多种为人体所需，尤其锌、硒含量最丰富；此外还有特殊的“蚂蚁抗生素”即后胸侧板腺素等特种抗菌素，因此号称为“动物营养宝库”。现有文献资料显示拟黑多刺蚁具丰富的药理活性，如，黑蚂蚁醇提物石油醚部位对亚急性衰老模型小鼠具有抗氧化作用，拟黑多刺蚁的提取物可在制备防真菌感染药物、防治瘙痒药物、治疗骨质疏松药物、预防和治疗乳腺癌及其相关疾病药物、增强免疫力和缓解疲劳的保健品等方面应用。但目前还未见有关于拟黑多刺蚁提取物在抗脑缺血方面应用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种拟黑多刺蚁提取物在制备抗脑缺血药物中应用，本发明首次发现拟黑多刺蚁提取物具有明显的改善血脑屏障损伤活性，且脂溶性较高，容易通过大脑血脑屏障，具有制备抗脑缺血药物或者具有抗脑缺血功能药物的成药潜力，为开发抗脑缺血药物创新药物提供了新的物质基础，具有潜在且巨大的社会效益和经济效益。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

拟黑多刺蚁提取物在制备抗脑缺血药物中应用。

拟黑多刺蚁提取物的提取方法为：取拟黑多刺蚁细粉，加入有机溶媒加热回流提取，减压回收有机溶媒，即得拟黑多刺蚁提取物。

所述加热回流提取的提取压力为－0.1～－0.09MPa，提取温度为45～80℃。

所述有机溶媒为乙醇或石油醚。

所述乙醇的体积浓度为37～98%。

所述石油醚的沸程规格为60～90℃。

所述的拟黑多刺蚁提取物选择性添加常规辅料，按照常规工艺制成的临床可接受的用于预防和治疗脑缺血的药物制剂。

所述制剂包括片剂、胶囊剂、滴丸或颗粒剂等。

所述的辅料包括淀粉、乳糖、微晶纤维素、糊精、磷酸钙、豆油、蜂胶、聚乙二醇-4000、聚乙二醇-6000、羧甲基纤维素钠、羟丙纤维素、交联聚维酮中一种或两种以上的混合物。

以上拟黑多刺蚁提取物及其制成的制剂均可在制备抗脑缺血药物中应用，起到预防和治疗脑缺血的功效。目前研究表明拟黑多刺蚁提取物及其制成的制剂的抗脑缺血作用可能是通过降低氧化应激作用、对炎症反应实现靶向调控、改善自噬溶酶体系统等机制起治疗作用。

近期大量研究表明，氧化应激、炎症和自噬作为脑缺血再灌注后的关键分子事件，在缺血性脑损伤的发生发展过程中起重要作用，靶向这些机制显示有益的神经保护作用。其中以NF-κB作为炎症反应的核心环节，在脑缺血后被激活，并产生大量的炎症因子，如肿瘤坏死因子α（TNF-α），白介素-1β(interleukins，IL-1β)等，加重脑损伤。靶向调控炎症反应，能降低缺血脑组织炎症水平，有助于改善脑缺血后神经损伤。本发明研究表明，拟黑多刺蚁提取物可显著下调脑缺血大鼠皮层TNF-α和IL-1β水平，有效降低炎症水平（*p<0.05）。

自噬是一种细胞自我吞噬现象，是细胞在生理或病理因子（如营养缺乏、饥饿、低氧等）作用下，由内质网或高尔基体等来源的双层膜包裹受损蛋白质大分子和细胞器等形成自噬体，与溶酶体结合形成自噬溶酶体并进行消化及降解，分解产物可供细胞循环再利用，以满足代谢需要和实现某些细胞器的更新。其中，微管相关蛋白轻链3Ⅱ（LC3-Ⅱ）参与自噬体双层膜形成过程，通过与选择性自噬接头蛋白P62/sequestosome-1（SQSTM1）结合，指引自噬体对待降解物质进行吞噬。随后自噬体向溶酶体运输和融合，利用溶酶体内酸性水解酶降解上述待降解物质。有研究显示，缺血、缺氧可损伤大脑血脑屏障组成细胞——脑微血管内皮细胞的自噬溶酶体系统功能，导致脑微血管内皮细胞受损蛋白及细胞器大量积聚而无法有效降解，破坏血脑屏障完整性，从而加重脑缺血损伤。通过改善自噬溶酶体系统，有助于减轻脑缺血再灌注损伤，对改善脑缺血具有有益作用。其中，可通过检测胞内LC3-Ⅱ和P62变化水平，反映自噬体生成水平和溶酶体降解能力，作为自噬溶酶体系统激活与否的一个重要标志。本发明研究表明，拟黑多刺蚁提取物能显著提高LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达（*p<0.05），降低P62表达（*p<0.05）。从而证实，拟黑多刺蚁提取物可以通过改善脑微血管内皮自噬溶酶体系统功能，进而减轻其缺氧损伤，有助于维持脑缺血后血脑屏障的完整性。

本发明的有益效果是：

1、本发明首次发现拟黑多刺蚁提取物具有明显的改善血脑屏障损伤活性，且脂溶性较高，容易通过大脑血脑屏障，具有制备抗脑缺血药物或者具有抗脑缺血功能药物的成药潜力，为开发抗脑缺血药物创新药物提供了新的物质基础，具有潜在且巨大的社会效益和经济效益。

2、本发明所述拟黑多刺蚁资源丰富，提取制备方法简单易行、原料来源广泛易得，可用于拟黑多刺蚁提取物的大量制备；采用本发明的拟黑多刺蚁提取方法提取拟黑多刺蚁提取物，成本低、污染小，利于节能减排条件下的大规模生产，产业化前景好。

3、本发明通过拟黑多刺蚁提取物对线栓法致局灶性脑缺血大鼠神经功能影响、脑梗死面积影响、皮层炎症因子影响以及小鼠脑微血管内皮氧糖剥夺/复氧损伤自噬溶酶体系统的影响等实验，都有力证明了本发明的拟黑多刺蚁提取物在症状上表现出了明显的抗脑缺血活性。

4、本发明的拟黑多刺蚁提取物还具有扶正固本、延年益寿、补肾壮阳、强壮筋骨、祛风湿、养血养颜、护肝、提高免疫力、抗疲劳、益气力、增强性功能和提高睡眠质量等功效，可以用来预防脑缺血等疾病，或者是用于疾病治疗后的恢复治疗，药物毒性低，可以长期服用。

5、本发明将拟黑多刺蚁提取物与辅料混合制成片剂、胶囊、滴丸或颗粒剂，更方便服用，采用内服的用药方式将药性通过血液快速输送至病症部位进行有效治疗。

附图说明

图1是线栓法致局灶性脑缺血大鼠的神经功能缺陷评分结果；

图2是线栓法致局灶性脑缺血大鼠的TTC染色脑片；

图3是线栓法致局灶性脑缺血大鼠的脑梗塞率测定结果；

图4是线栓法致局灶性脑缺血大鼠的脑组织SOD活力测定结果；

图5是线栓法致局灶性脑缺血大鼠的皮层炎症因子TNF-α水平检测结果；

图6是线栓法致局灶性脑缺血大鼠的皮层炎症因子IL-1β水平检测结果；

图7是bEnd.3细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达的结果；

图8是bEnd.3细胞P62表达的结果。

具体实施方式

为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。

实施例1 拟黑多刺蚁提取物的制备

取拟黑多刺蚁细粉1000g，加入体积浓度为95%的乙醇加热回流提取3次，每次3L，每次提取压力均为－0.1MPa，提取温度均为45℃，合并三次提取液，减压回收乙醇，浓缩至1.0g/mL，即得所述提取物。

实施例2 拟黑多刺蚁提取物的制备

取拟黑多刺蚁细粉1000g，加入体积浓度为75%乙醇加热回流提取3次，每次3L，每次提取压力均为-0.09MPa，提取温度均为62℃，合并三次提取液，减压回收乙醇，浓缩至1.1g/mL，即得所述提取物。

实施例3 拟黑多刺蚁提取物的制备

取拟黑多刺蚁细粉1000g，加入石油醚（沸程规格为60～90℃）加热回流提取2 次，每次3L，每次提取压力均为-0.09MPa，提取温度均为80℃，合并两次提取液，减压回收石油醚，浓缩至1.2 g/mL，即得所述提取物。

实施例4 拟黑多刺蚁提取物片剂的制备

处方：实施例1所得的拟黑多刺蚁提取物320g；干淀粉 400g；羧甲基纤维素钠10g；滑石粉10g；总计740g。

制备方法：将拟黑多刺蚁提取物、干淀粉混匀，制成颗粒，干燥，压制成2000片，用羧甲基纤维素钠和滑石粉混合物作为糖衣进行包糖衣；所得的拟黑多刺蚁提取物糖衣片，每片重370mg，每片含拟黑多刺蚁提取物重约160mg。

实施例5 拟黑多刺蚁提取物软胶囊的制备

处方：实施例1所得的拟黑多刺蚁提取物80g；豆油500g；蜂胶30g；总计610g。

制备方法：将蜂胶加入到豆油中，加热混匀，制得软胶囊基质，再将拟黑多刺蚁提取物加入到基质中，搅拌均匀，胶体磨研磨，制得软胶囊内容物，按明胶：甘油：水=1：0.4：1的体积比制胶，采用软胶囊机压丸，制得1000粒软胶囊，每粒含拟黑多刺蚁提取物重约80mg。

实施例6 拟黑多刺蚁提取物滴丸的制备

处方：实施例1所得的拟黑多刺蚁提取物64g；聚乙二醇-4000 15g；聚乙二醇-600045g；总计124g。

制备方法：将拟黑多刺蚁提取物、聚乙二醇-4000搅拌均匀，再加入熔融的聚乙二醇-6000，置水浴上加热至60～65℃，充分搅拌至成透明液体，倾入保温滴制器中，保持温度在65～70℃，按每丸重64mg选用适宜口径的滴头，以每分钟60滴的滴速滴入用冰浴冷却的液体石蜡中，制成2000丸，包糖衣，每丸含拟黑多刺蚁提取物重约32mg。

实施例7 拟黑多刺蚁提取物颗粒剂的制备

处方：实施例1所得的拟黑多刺蚁提取物480g；干淀粉2000g；羧甲基纤维素钠10g；滑石粉10g；总计2500g。

制备方法：将拟黑多刺蚁提取物、干淀粉、羧甲基纤维素钠、滑石粉混匀，制成颗粒，干燥，分装1000包；所得的拟黑多刺蚁提取物颗粒，每包重2.5g，含拟黑多刺蚁提取物重约480mg。

药性试验

为了验证拟黑多刺蚁提取物的抗脑缺血活性，本申请人使用实验例1制备得到的拟黑多刺蚁提取物进行了以下试验：

1、拟黑多刺蚁提取物（AFPR）对线栓法致局灶性脑缺血大鼠的影响

处理方法：取SD大鼠70只，体重(280±20) g，雄性，线栓法建立局灶性脑缺血/再灌注模型，取造模成功SD大鼠随机分4组：模型组、阳性给药组(尼莫地平9 mg•kg^-1)、AFPR高剂量组（8g•kg^-1）和AFPR低剂量组(4g•kg^-1)，正常SD大鼠做正常对照。灌胃给予相应药物，为期12天。检测如下指标：

（1）神经功能缺陷评分：末次给药后，按Bederson的方法对SD大鼠行为缺陷进行分级评分，标准如下：

0分：未观察到神经症状；

1分：提尾悬空时，动物手术对侧前肢表现为腕肘屈曲，肩内旋，肘外展、紧贴胸壁；

2分：将动物置于光滑平面上，推手术侧肩向对侧移动时，阻力降低；

3分：动物自由行走时向手术对侧转圈或环转；

4分：软瘫，肢体无自发活动。

评分结果如图1所示，与假手术组相比，术后2小时、术后24小时、术后3天模型组大鼠神经行为学评分显著升高（*p<0.05）。与模型组相比，AFPR高剂量组给药3天后，神经功能评分显著下降（#p<0.05）。

（2）梗死面积检测：将SD大鼠麻醉后取脑，大脑冠状切片进行TTC染色，再对脑片分离苍白区（梗塞区）和非苍白区（正常区），计算脑梗塞百分比：梗塞率（%）=苍白区重量/（苍白区重量+非苍白区重量）×100%。

结果如图2-3所示，与模型组相比，AFPR高剂量组、AFPR低剂量组和阳性给药组给药12天后，脑梗塞率均显著降低（#p<0.05，##p<0.01）。

（3）脑组织氧化应激水平检测：取梗死区脑皮层，冰浴匀浆，按照SOD检测试剂盒（由南京建成生物工程研究所提供）说明方法检测组织SOD活力。

结果如图4所示，与假手术组相比，模型组脑组织SOD 活力显著下降，抗氧化应激能力降低（*p<0.05）；与模型组相比，AFPR高剂量组及阳性给药组均可显著上调缺血大鼠脑皮层SOD活力，促进脑组织抗氧化应激能力提升（#p<0.05，##p<0.01）。

（4）脑缺血后皮层炎症因子TNF-α和IL-1β检测：取梗死区脑皮层，冰浴匀浆，采用ELISA 法进行TNF-α和IL-1β水平检测。

结果如图5-6所示，与假手术组相比，模型组TNF-α和IL-1β水平明显升高，表明缺血后脑皮层炎症水平上调；与模型组相比，AFPR高剂量组可显著下调脑缺血大鼠皮层TNF-α和IL-1β水平，有效降低炎症水平（*p<0.05）。

2、拟黑多刺蚁提取物（AFPR）对小鼠脑微血管内皮氧糖剥夺/复氧损伤自噬溶酶体系统的影响

处理方法：将bEnd.3细胞置于含15%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，于5%CO₂、37℃培养箱中培养，选取对数生长的细胞，除空白对照组外，其他组别细胞氧糖剥夺（OGD）造模前弃去培养基，用PBS轻轻荡洗两次，随后将细胞培养于低糖无血清的DMEM培养基内，置于37℃、1%O₂/94% N₂/5%CO₂培养箱内培养2h模拟脑缺血状态下氧糖剥夺。细胞进行OGD造模后将培养基更换为含不同浓度药物的无血清DMEM高糖培养基共同孵育24h。分组如下：空白对照组；模型对照组；AFPR高浓度组（2mg/mL）；AFPR低浓度组（1mg/mL）。最终收集细胞蛋白，利用Western blot法测定各组bEnd.3细胞LC3Ⅱ、P62蛋白表达。

结果如图7-8所示，与空白组相比，模型组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达显著降低，P62表达显著增加（*p<0.05）。与模型组相比，AFPR高浓度组显著提高了LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达（*p<0.05），显著降低了P62表达（*p<0.05）。表明，AFPR可以通过改善脑微血管内皮自噬溶酶体系统功能，进而减轻其缺氧损伤，有助于维持脑缺血后血脑屏障的完整性。

Claims (4)

1.一种拟黑多刺蚁提取物在制备抗脑缺血药物中应用，所述拟黑多刺蚁提取物的提取方法为：取拟黑多刺蚁细粉，加入有机溶媒加热回流提取，减压回收有机溶媒，即得；所述有机溶媒为乙醇，所述乙醇的体积浓度为95%，所述加热回流提取的提取压力为－0.1MPa，提取温度为45℃。

2.根据权利要求1所述拟黑多刺蚁提取物在制备抗脑缺血药物中应用，其特征在于，所述的拟黑多刺蚁提取物添加常规辅料，按照常规工艺制成的临床可接受的用于治疗脑缺血的药物制剂。

3.根据权利要求2所述拟黑多刺蚁提取物在制备抗脑缺血药物中应用，其特征在于，所述制剂包括片剂、胶囊剂、滴丸或颗粒剂。

4.根据权利要求2所述拟黑多刺蚁提取物在制备抗脑缺血药物中应用，其特征在于，所述的辅料包括淀粉、乳糖、微晶纤维素、糊精、磷酸钙、豆油、蜂胶、聚乙二醇-4000、聚乙二醇-6000、羧甲基纤维素钠、羟丙纤维素、交联聚维酮中一种或两种以上混合物。

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