CN112198243A

CN112198243A - 一种枸橼酸西地那非杂质的检测方法

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Publication number: CN112198243A
Application number: CN202010951548.XA
Authority: CN
Inventors: 王玮; 李翠芬; 罗志波; 王健松
Original assignee: Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical Holdings Co ltd Baiyunshan Pharmaceutical General Factory
Current assignee: Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical Holdings Co ltd Baiyunshan Pharmaceutical General Factory
Priority date: 2020-09-10
Filing date: 2020-09-10
Publication date: 2021-01-08
Anticipated expiration: 2040-09-10
Also published as: CN112198243B

Abstract

本发明公开一种枸橼酸西地那非杂质的检测方法，采用UPLC进行检测，以缓冲液‑甲醇‑乙腈为流动相，所述缓冲液pH为5.5～6.8。本发明通过采用UPLC对枸橼酸西地那非杂质进行检测，采用特定组成的流动相，可快速将枸橼酸西地那非杂质进行洗脱、分离，缩短了检测时间，通过进一步调整流动相组成和色谱条件，能够将7种枸橼酸西地那非EP杂质分离。

Description

一种枸橼酸西地那非杂质的检测方法

技术领域

本发明涉及药物分析领域，尤其涉及一种枸橼酸西地那非杂质的检测方法。

背景技术

枸橼酸西地那非片是一种环磷酸鸟苷(cGMP)特异的5型磷酸二酯酶(PDE5)的选择性抑制剂，由美国辉瑞公司原研，商品名Viagra，剂型为片剂，规格0.1g、50mg和25mg，适应症为勃起功能障碍。Viagra于1998年4月1日在意大利首次上市，是治疗勃起功能障碍的口服药物。根据规格和(或)剂型及用法用量的不同，西地那非适用于不同的适应症。目前临床上也可用于肺动脉高压的治疗。剂型为：片剂(规格20mg)、口崩膜剂(规格20mg)和多剂量干混悬剂(规格900mg)，用法用量为：成人20mg/次，1天3次，商品名Revatio。

有关物质及其含量是反映药品纯度的直接指标，控制/降低有关物质数量及其含量是药品质量研究的关键内容。枸橼酸西地那非目前已知的主要杂质为A、B、C、D、E、F、G，来自于工艺杂质、降解产物等(杂质命名参考EP9.2、BP2020，二者相同)，结构式如下：

《中国药典(2020版)》未记载枸橼酸西地那非原料或制剂有关物质的检测方法，其余各国药典相关检测方法见表1。

表1枸橼酸西地那非有关物质检测方法对比

然而，上述等度洗脱方法，仅有杂质A、B、C、D出峰，杂质F、杂质G均未出峰。通过用杂质F对照品进行定位，显示杂质F与主成分枸橼酸西地那非峰保留时间一致，包含于主峰中，无法分离；杂质G在等度方法中未能洗脱出来。采用EP9.2(即BP2020)梯度洗脱，上述杂质都能出峰，但杂质G约38min才能出峰，整个检测耗时超过40min。

也有少量文献报道对西地那非原料/制剂中有关物质的分析检测，均是采用HPLC方法。记载等度洗脱的如缪玉山等(缪玉山，厉伟兰，倪桃，等.HPLC测定枸橼酸西地那非片中西地那非及其有关物质的含量.中国药科大学学报，2001，32(4)：273-275.)以乙腈-水(44：56，v/v)为流动相，Hyper sil ODS-2色谱柱(5μm，200mm×4.6mm)为固定相，流速1ml/min，检测波长292nm，但该方法仅能检出一个杂质。王志群等(王志群，倪坤仪.RP_HPLC法检查枸橼酸西地那非中有关物质及其片剂的含量测定.中国药科大学学报，2001，32(6)：429-431.)选用Hypersil ODS2柱，以乙腈-0.015mol/L三乙胺水溶液(用磷酸调pH至6.0)(58：42，v/v)为流动相，流速1ml/min，检测波长292nm，分离中间体杂质包括游离二胺(Ⅰ)、环合中间体(Ⅱ)、氯磺化中间体(Ⅲ)、胺化中间体(Ⅳ)，但也只检出一种有关物质。

采用梯度洗脱的文献如毕嘉益等(毕嘉益，芦红代，程思谟，等.HPLC法测定枸橼酸西地那非原料药的含量及有关物质.沈阳药科大学学报，2015，32(7)：527-530，575.)采用Phenomenex Luna C18色谱柱(250mm×4.60mm，5μm)，流动相：0.05mol·L^-1磷酸三乙胺(取7mL三乙胺用水稀释至1000mL，用磷酸调pH至4.0±0.1)-甲醇-乙腈(体积比58∶25∶17)，流速1.0mL·min^-1，柱温30℃，检测波长290nm，但也仅能检出氧化破坏产生的杂质B。肖昌琴(肖昌琴.西地那非及其相关物质分析新方法的建立.华中科技大学，2013.)在她的硕士论文中较详细地阐述了采用HPLC法检测西地那非及8种相关物质(伐地那非，降解物去甲基西地那非、一种副产物thiodimethylsildenafil及四种合成过程中间体imidazosagatria-zinone，sildenafil amine，sildenafil amide，sildenafil coupled)，具体色谱条件为，色谱柱：ShimadzuVP-ODS(250mm×4.6mm，5μm)；检测波长290nm；柱温25℃；流动相：甲醇(A)-1％(V:V)醋酸(HAc)水溶液(B)；流速：1.2mL/min；梯度洗脱：0→8min，A为37％；8min→10min，A由37％→49％；10min→18min，A均为49％；18min→30min，A由48％→72％；30min→40min，A由72％→73％；40min→45min，A由73％→76％；进样量：10μL，分离耗时超过40min。

CN105334275A公开了一种枸橼酸西地那非有关物质的检测方法，该方法采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，醋酸铵水溶液为流动相A，乙腈-甲醇为流动相B，检测波长为292nm，梯度洗脱，虽然可以同时分离检测枸橼酸西地那非中的7种有关物质，但该7种有关物质中仅杂质D、E、G分别对应了EP9.2记载的杂质D、B、A，其余EP9.2杂质C、E、F、G无法得到有效分离，且分离耗时超过20min。

综上可以看出，现有枸橼酸西地那非有关物质的检测方法存在可分离得到的杂质少，部分杂质未完全分开，用时长、有机溶剂消耗量大等不足。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种枸橼酸西地那非杂质的检测方法，可快速对枸橼酸西地那非杂质进行分离和检测，缩短检测时间。

本发明采取的技术方案为：

一种枸橼酸西地那非杂质的检测方法，采用超高效液相色谱(UPLC)进行检测，以缓冲液-甲醇-乙腈为流动相，所述缓冲液pH为5.5～6.8。

相对于现有技术，本发明通过采用UPLC对枸橼酸西地那非杂质进行检测，采用特定组成的流动相，可快速将枸橼酸西地那非杂质进行洗脱、分离，缩短了检测时间。

所述缓冲液、甲醇和乙腈的体积比为38～65:6.25～19.5:28.75～42.5。该比例下的流动相可完全将A、B、C、D、E、F、G等7种枸橼酸西地那非EP杂质进行分离，检测结果中出现该7种杂质的色谱峰。

考虑到不同的枸橼酸西地那非杂质极性不同，因此本发明在UPLC检测过程中采用梯度洗脱的方式对枸橼酸西地那非杂质进行分离，通过调整流动相的洗脱能力而使不同的枸橼酸西地那非杂质得到分离。

为了便于改变流动相的洗脱能力，采用梯度洗脱的方式，在一种优选的实施方式中，所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为缓冲液-乙腈，所述流动相B为缓冲液-甲醇-乙腈。

所述流动相A中，缓冲液和乙腈的体积比为75～85:15～25，优选约80:20。

所述流动相B中，缓冲液、甲醇和乙腈的体积比为20～25:25～30:50～55，优选约20:25:55。

检测过程中的洗脱程序为：0～1min，流动相A和流动相B的体积比约为75:25(缓冲液、甲醇和乙腈的体积比约为65:6.25:28.75)，等度洗脱；1～8min，流动相A和流动相B的体积比渐变至约30:70(缓冲液、甲醇和乙腈的体积比约为38:19.5:42.5)，梯度洗脱；8～10min，流动相A和流动相B的体积比约为30:70，等度洗脱。

检测过程中的流速为0.1～0.5ml/min，进样量为1～10μl。流动相的流速和进样量均会影响枸橼酸西地那非杂质的洗脱效果，流速或进样量过大或过小都无法对进行有效洗脱和分离。

检测过程中的检测波长为225～240nm。

检测过程中的柱温为25～40℃。

本发明的UPLC采用C18色谱柱、C8色谱柱中的至少一种，优选C18色谱柱。

所述缓冲液采用常见的弱酸性缓冲液，例如磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液，但不限于此。优选磷酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液，最优选磷酸盐缓冲液。

所述枸橼酸西地那非杂质包括具有如下结构式的杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G中是至少4种，优选5种或6种，最优选7种：

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：在本发明的色谱条件下，枸橼酸西地那非中7种杂质都可以获得有效分离，专属性好、灵敏度高，且分析时间短，节约了大量有机溶剂，减少了环境污染。

具体实施方式

以下结合具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。

以下实施例中，如无特殊说明，杂质指的是以下杂质A、B、C、D、E、F、G 7种枸橼酸西地那非EP杂质：

实施例1

将枸橼酸西地那非及7种枸橼酸西地那非EP杂质混合得到待测样品，采用本领域常规的方法配制待测液，采用如下不同的色谱条件进行检测。

方法一：

仪器：Waters Acquity UPLC系统

色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)

流动相A：磷酸盐缓冲液(pH 5.5，配制方法：取磷酸二氢钾2.72g，加水1000ml溶解，用120g/L氢氧化钾水溶液调节pH至5.5)-乙腈(80:20，v/v)

流动相B：磷酸盐缓冲液(pH 5.5)-甲醇-乙腈(20:25:55，v/v/v)

流速：0.5ml/min

进样量：4μl

检测波长：240nm

柱温：25℃

洗脱程序：0～1min，流动相A：流动相B体积比为75:25，等度洗脱；1-8min，流动相A：流动相B体积比渐变为30:70，梯度洗脱；8～10min，流动相A：流动相B体积比为30:70等度洗脱。

方法二：

仪器、色谱柱、洗脱程序同方法一。

流动相A：磷酸盐缓冲液(pH 6.8)-乙腈(80:20，v/v)

流动相B：磷酸盐缓冲液(pH 6.8)-甲醇-乙腈(20:25:55，v/v/v)

流速：0.2ml/min

进样量：10μl

检测波长：230nm

柱温：40℃

方法三：

仪器、色谱柱、检测波长、洗脱程序同方法一。

流动相A：磷酸盐缓冲液(pH 6.0)-乙腈(80:20，v/v)

流动相B：磷酸盐缓冲液(pH 6.0)-甲醇-乙腈(20:25:55，v/v/v)

流速：0.1ml/min

进样量：1μl

检测波长：225nm

柱温：30℃

方法四：

仪器、色谱柱、流速、进样量、检测波长、柱温、洗脱程序同方法一。

流动相A：醋酸盐缓冲液(pH 5.8)-乙腈(80:20，v/v)

流动相B：醋酸盐缓冲液(pH 5.8)-甲醇-乙腈(20:25:55，v/v/v)

方法五：

流动相A：磷酸盐缓冲液(pH 6.5)-乙腈(85:15，v/v)

流动相B：磷酸盐缓冲液(pH 6.5)-甲醇-乙腈(25:30:45，v/v/v)

方法六：

流动相A：醋酸盐缓冲液(pH 6.2)-乙腈(78:22，v/v)

流动相B：醋酸盐缓冲液(pH 6.2)-甲醇-乙腈(23:28:49，v/v/v)

方法七：

仪器、色谱柱、流动相、流速、进样量、柱温、洗脱程序同实施例一。

检测波长：242nm

方法八：

仪器、色谱柱、流动相、检测波长、进样量、柱温、洗脱程序同实施例一。

流速：0.6ml/min

方法九：

仪器、色谱柱、流速、检测波长、进样量、柱温、洗脱程序同实施例一。

流动相A：醋酸盐缓冲液(pH 7.0)-乙腈(80:20，v/v)

流动相B：醋酸盐缓冲液(pH 7.0)-甲醇-乙腈(20:25:55，v/v/v)

方法十：

仪器、色谱柱、流动相、流速、检测波长、柱温、洗脱程序同实施例一。

进样量：15μl

方法十一：

仪器、色谱柱、流动相、流速、进样量、检测波长、柱温同实施例一。

洗脱程序：0～1min，流动相A：流动相B体积比为70:30(缓冲液、甲醇和乙腈的体积比为62:7.5:30.5)，等度洗脱；1～8min，流动相A：流动相B体积比渐变为35:65(缓冲液、甲醇和乙腈的体积比为41:16.25:42.75)，梯度洗脱；8～10min，流动相A：流动相B体积比为35:65，等度洗脱。

上述不同方法的分离效果如表2所示。

表2不同方法分离效果比较

可见，在以缓冲溶液(pH为5.5～6.8)-乙腈作为流动相A，以缓冲溶液(pH为5.5～6.8)-甲醇-乙腈为流动相B，流速：0.1～0.5ml/min，进样量：1～10μl，检测波长：225～240nm，柱温：25～40℃，洗脱程序：0～1min，流动相A：流动相B体积比为75:25，等度洗脱；1～8min，流动相A：流动相B体积比渐变为30:70，梯度洗脱；8～10min，流动相A：流动相B体积比为30:70等度洗脱的色谱条件(方法一至方法四)下，可以对枸橼酸西地那非口服制剂中的7种杂质进行分离、检测，具有较好的专属性，检测限达到0.018μg/ml。

相比之下，若将检测波长增大至242nm，或将流速增加到0.6ml/min，或将进样量增大至15μl，结果仅能检测出5种杂质(方法五、六和八)；将缓冲溶液pH增加到7.0，结果也仅检测出6种杂质(方法七)；改变洗脱程序后也无法同时检测出7种枸橼酸西地那非EP杂质。

实施例2

以下采用实施例1中方法一的色谱条件，研究本发明的检测方法的适应性、专属性、定量限、检测限、重复性等。

溶液配制：

供试品溶液：取枸橼酸西地那非口服制剂待测品适量(约含西地那非50mg)，精密称定，置100ml量瓶中，加流动相A适量，超声使溶解，放冷后定容至刻度，摇匀，过滤。

对照品溶液：取枸橼酸西地那非对照品(中检院，批号420012-201702，去盐后折算)适量，精密称定，加流动相A溶解并定量稀释制成每1ml中约含1μg西地那非的溶液。

按照上述方法一的色谱条件分别对供试品溶液和对照品溶液进行UPLC检测，各杂质的相对保留时间见表3。

表3各杂质的相对保留时间

	相对保留时间	控制限度(％)
			杂质A	1.14	0.2
杂质B	0.75	0.2
			杂质C	0.56	0.2
杂质D	0.26	0.2
			杂质E	0.65	0.2
杂质F	0.84	0.2
			杂质G	1.54	0.2

注：表3中相对保留时间＝杂质保留时间/主成分保留时间。

根据测试结果可知，采用方法一的测试方法各杂质的相对保留时间最大为1.54，远小于现有技术CN105334275A的最大相对保留时间(2.15或2.77)，缩短了检测时间。

1.系统适应性

分别取杂质A对照品(来源：EP，批号：Y0001579)、枸橼酸西地那非对照品适量，用混合溶剂(组成与流动相A相同)稀释制成每1ml分别约含10μg杂质A、25μg西地那非的混合溶液，作为系统适用性溶液。取2μl系统适用性溶液注入液相色谱仪，结果显示除保留时间不同外，记录的色谱图与标准图谱一致，且杂质A与主成分的分离度不小于5.0。

2.专属性

强降解试验是在高温、强酸、强碱、强氧化、强光照条件下加速对对供试品进行破坏，目的是通过考察样品的降解产物和主峰以及已知杂质的分离情况，比对杂质的生成量与主成份的减少量，以此来评估分析方法的有效性和适用性。

采用如表4中的降解条件对供试品进行破坏，获得相应的检测结果如下：

表4专属性试验结果

由表4可知本发明的检测方法专属性强。

3.定量限和检测限

采用信噪比法，取主成分和各杂质对照品，分别用溶剂(流动相A)稀释至一定浓度，进样，观察信噪比S/N，信噪比为10时对应的浓度为定量限，信噪比为3时对应的浓度为检测限。西地那非及各杂质定量限和检测限结果汇总见表5。

表5定量限和检测限试验结果

在定量限的数据中，相当于样品浓度0.05％的有关物质样品信噪比在10以上，保证样品中0.05％以上的有关物质可以定量检测；在检测限的数据中，相当于样品浓度0.02％的杂质样品信噪比在3以上，保证样品中0.02％以上的有关物质可以被检测到，说明本发明的灵敏度很高。

4.线性及范围

取主成分和各杂质对照品，分别配置成系列梯度浓度的溶液，注入色谱仪，记录色谱图，以溶液浓度为横坐标，以峰面积为为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性方程和相关系数如报6所示：

表6线性及范围试验结果

	范围(μg/ml)	线性方程	相关系数(r)
				西地那非	0.125～4.56	y＝36.212x+0.6867	0.9996
杂质A	0.236～4.13	y＝42.133x-0.0658	0.9999
				杂质B	0.156～4.22	y＝38.257x+0.1651	0.9998
杂质C	0.128～4.78	y＝29.572x-0.2557	0.9998
				杂质D	0.108～4.93	y＝40.524x+0.0691	0.9994
杂质E	0.173～5.08	y＝39.879x+0.2768	0.9995
				杂质F	0.144～4.47	y＝35.429x-0.2184	0.9992
杂质G	0.107～4.72	y＝37.629x+0.1368	0.9997

由表6的结果可知，本发明的检测方法针对各杂质的线性范围均符合至少在LOQ值(定量限)～指标400％的范围内的标准，且回归系数均>0.999，证明呈良好的线性关系。

5.重复性

取市售枸橼酸西地那非片，按上述实施例1中方法一的检测方法重复6次检测，验证方法具有良好精密度，标准要求杂质之和绝对偏差不得超过质量标准的50％，结果见表7。

表7重复性试验结果

重复性试验中，6次测定样品中检出杂质种类一致，主要检出杂质A、杂质B和杂质F，杂质之和的绝对偏差为0.01％，不超过质量标准限度的50％(2％)，证实该方法具有良好的重复性和精密度。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种枸橼酸西地那非杂质的检测方法，其特征在于：采用超高效液相色谱进行检测，以缓冲液-甲醇-乙腈为流动相，所述缓冲液pH为5.5～6.8。

2.根据权利要求1所述枸橼酸西地那非杂质的检测方法，其特征在于：所述缓冲液、甲醇和乙腈的体积比为38～65:6.25～19.5:28.75～42.5。

3.根据权利要求1所述枸橼酸西地那非杂质的检测方法，其特征在于：所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为缓冲液-乙腈，所述流动相B为缓冲液-甲醇-乙腈。

4.根据权利要求3所述枸橼酸西地那非杂质的检测方法，其特征在于：所述流动相A中，缓冲液和乙腈的体积比为75～85:15～25。

5.根据权利要求4所述枸橼酸西地那非杂质的检测方法，其特征在于：所述流动相B中，缓冲液、甲醇和乙腈的体积比为20～25：25～30：50～55。

6.根据权利要求5所述枸橼酸西地那非杂质的检测方法，其特征在于：检测过程中的洗脱程序为：0～1min，流动相A和流动相B的体积比约为75:25，等度洗脱；1～8min，流动相A和流动相B的体积比渐变至约30:70，梯度洗脱；8～10min，流动相A和流动相B的体积比约为30:70，等度洗脱。

7.根据权利要求1～6任意一项所述枸橼酸西地那非杂质的检测方法，其特征在于：检测过程中的流速为0.1～0.5ml/min。

8.根据权利要求1～6任意一项所述枸橼酸西地那非杂质的检测方法，其特征在于：检测过程中的进样量为1～10μl。

9.根据权利要求1～6任意一项所述枸橼酸西地那非杂质的检测方法，其特征在于：所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的任意一种。

10.根据权利要求1～6任意一项所述枸橼酸西地那非杂质的检测方法，其特征在于：所述枸橼酸西地那非杂质包括具有如下结构式的杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G中的至少4种：