CN112179997A - 包含联苯苄唑/醋酸氯己定复方药物的质量监测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种包含联苯苄唑/醋酸氯己定复方药物的质量监测方法，每100重量份所述复方药物中包含联苯苄唑0.1‑10重量份、醋酸氯己定0.05‑10重量份，余量为药学可接受的辅料；所述监测方法包括采用高效液相色谱法对待测复方药物中联苯苄唑及其分解产物联苯苄醇、醋酸氯己定及其分解产物对氯苯胺进行测定，记录峰面积，按外标法以峰面积计算确定所测定目标物的含量。本发明所提供的质量监测方法专属性强、精密度好、准确度高，可实现对包含联苯苄唑/醋酸氯己定复方药物的质量检测，快速准确的测定有关物质的含量，保证上述复方药物的安全性、有效性及可靠性，实现质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物的质量监测方法，尤其涉及一种包含联苯苄唑/醋酸氯己定复方药物的质量监测方法。
背景技术
包含联苯苄唑/醋酸氯己定复方药物是非抗生素非激素广谱抗菌药物，用于治疗真菌、细菌感染或真菌细菌混合感染性疾病，并且临床试验证明其效果优异，其活性成分主要为联苯苄唑和/或醋酸氯己定，是一种非常有应用前景的外用广谱抗菌制剂，可以提供的剂型有溶液剂、喷雾剂、乳膏剂、凝胶剂、栓剂等。
药品属于一类特殊商品，其生产过程中每个环节都必须严格遵照操作标准和规范执行，以保证最终产品的品质和功效。受到原料质量(来源、生产批次等)和操作条件的影响，所生产药物质量都可能会有波动，对制剂中间产物及最终产品进行质量控制，保证产品的安全性、有效性及可靠性是非常重要的，而每个具体药品的质量监测手段和标准都需要有针对性地制定，制定严格的监测标准是制药工业中的重要环节。
对于药物的质量监测，一般包括对药物活性成分(或主成分)、以及杂质或分解(或降解)副产物等有关物质的定量、定性分析等，具体到联苯苄唑/醋酸氯己定复方药物，如何排除各成分之间的相互干扰，对各成分进行精确测定，提供一种专属性强、精密度好、准确度高的质量监测方法，是保证该药物安全生产所必不可少的环节。
发明内容
本发明提供一种针对包含联苯苄唑/醋酸氯己定复方药物的质量监测方法，通过对该复方药物的有关物质快速准确测定，实现对生产药物的质量监测，保证该类复方药物的安全性、有效性和可靠性。
本发明提供一种包含联苯苄唑/醋酸氯己定复方药物的质量监测方法，每100重量份所述复方药物中包含联苯苄唑0.1-10重量份、醋酸氯己定0.05-10重量份，余量为药学可接受的辅料；所述监测方法包括采用高效液相色谱法对待测复方药物中联苯苄唑及其分解产物联苯苄醇、醋酸氯己定及其分解产物对氯苯胺进行测定，记录峰面积，按外标法以峰面积计算确定所测定目标物的含量。
如前述，本发明提供的监测方法是针对和配合活性成分包含联苯苄唑/醋酸氯己定的外用复方药物，对于该复方药物的详细描述可以参看中国专利CN1254242C。在本发明的一实施方式中，所述复方药物中，包含联苯苄唑0.1-10重量份、醋酸氯己定0.1-10重量份；在一实施方式中，联苯苄唑和醋酸氯己定质量比可为20:1～1:2。
基于申请人的研究，制定该复方药物的质量标准，除了考虑活性组分联苯苄唑和醋酸氯已定的性质和含量外，还必须同时考虑在生产和流通环节中可能生成的副产物，即联苯苄醇衍生物和对氯苯胺衍生物的性质与含量；在制定监测方法时，由于待测品是各组分共存物，特别是作为活性组分的联苯苄唑和醋酸氯己定共存的复方药物，排除相互干扰以及确保结果的准确与可信，也是达到目标的关键所在。
本发明中，发明人进一步对填充剂、检测波长、流动相等高效液相色谱条件进行了筛选和确定。本发明采用高效液相色谱法测定时，填充剂选用十八烷基硅烷键合硅胶，检测波长为190～350nm，测定联苯苄唑、醋酸氯己定和对氯苯胺含量时，流动相选用甲醇:三乙胺:磷酸:水相＝(500～650):(1～10):(5～15):(350～500)；测定联苯苄醇含量时，流动相选用甲醇:水相＝(500～850):(150～350)。通过对上述色谱条件的设定，能够更加高效、准确的对各成分进行测定，进一步提高本发明监测方法的专属性、精密度与准确度。
本发明中，流动相组成中的水相可以为磷酸盐缓冲液，其pH范围3-8；或者，流动相组成中的水相为水。在本发明的一实施方式中，所述磷酸盐选自磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾中的一种或一种以上，如在本发明的一实施例中，所述磷酸盐为磷酸氢二钾。
本发明所使用的各种试剂，尤其是配制流动相所用的试剂，都应选择分析纯或更高标准，例如也可以色谱纯，而水则为纯化水。
合理的保留时间、理论板数及分离度可以进一步保证监测方法的专属性、准确度以及检测效率，在本发明的一实施方式中，采用高效液相色谱法一次进样检测得到联苯苄唑和醋酸氯己定含量，并使醋酸氯己定保留时间约为6-9min、联苯苄唑保留时间约为11-15min，理论板数均大于3000，与相邻峰的分离度均大于1.5，调节适当的分离度，利于各待测物能通过一次进样而形成清晰的各自色谱峰，且同时得到各待测物的测定结果。如在一实施例中，醋酸氯己定保留时间约为8min，联苯苄唑保留时间约为13min。
本发明中，可通过适当调整色谱条件(如流动相极性、流速、含盐量、色谱柱条件、柱温等)以使上述各成分的保留时间、理论板数、分离度等达到相应的范围。如在本发明的一实施方式中，采用ZORBAXSB-C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱；色谱柱的柱温为20～30℃，一般最佳为25℃；流动相流速为0.5～1.5ml/min，优选1ml/min。
本发明中，还包括对照品测定液和药物供试品检测液的制备方法：分别精密量取联苯苄唑和醋酸氯己定对照品，加检测用流动相稀释并混匀，配制成每1ml中含量分别为0.0500mg±10％的联苯苄唑/醋酸氯己定对照品测定液(即，每1ml对照品测定液含有0.05mg±10％的联苯苄唑和0.05mg±10％的醋酸氯己定)；精密量取联苯苄醇对照品，加检测用流动相配制成含量为1.0000μg/ml±10％的联苯苄醇对照品测定液；精密量取对氯苯胺对照品，加检测用流动相配制成含量为1.0000μg/ml±10％的对氯苯胺对照品测定液；精密量取待测复方药物0.5毫升或0.5克，偏差范围在±10％，置于50毫升容量瓶中，加入检测用流动相配制成均匀混合液，过滤处理后得到供试品检测液。
本发明中，在含量测定项下(即在测定某一成分含量时的试验条件下)，对照品测定液和供试品检测液可按照上述方法配制，一般情况下，在含量测定项下的高效液相色谱图中，供试品与对照品主峰(即待测成分的色谱峰)的保留时间较为一致。
具体地，上述制备方法中，可将精密量取的对照品置于容量瓶中，用检测用流动相定容，配置成相应浓度的对照品测定液，然而本发明并不以此为限，也可采用其他合适的方式配制。
在本发明的一实施方式中，可先将上述对照品用检测用流动相配制成适当浓度的对照品储备液，然后取适量储备液，再用检测用流动相稀释，配制成相应浓度的对照品测定液。
本发明监测方法可适用于上述复方药物常规的各种剂型，如喷雾剂、溶液剂、乳膏剂、凝胶剂、栓剂等，对于不同剂型的复方药物，所对应的供试品检测液的制备方法可能略有不同。在具体的实施过程中：所述待测复方药物为喷雾剂或溶液剂时，供试品检测液的配制过程包括：将精密量取的0.5毫升±10％待测复方药物置于50毫升容量瓶中，水浴除去可能的有机基质或溶剂，加入检测用流动相配制成均匀混合液，定容后于3-10℃冷藏2-6小时，用0.45μm滤膜过滤，得到供试品检测液；所述待测复方药物为乳膏剂或凝胶剂时，供试品检测液的配制过程包括：将精密量取的0.5克±10％待测复方药物置于50毫升容量瓶中，加入检测用流动相并超声振荡处理配制成均匀混合液，定容后于3-10℃冷藏2-6小时，用0.45μm滤膜过滤，得到供试品检测液；所述待测复方药物为栓剂时，供试品检测液的配制过程包括：将精密量取的0.5克±10％待测复方药物置于50毫升容量瓶中，水浴加热或超声振荡处理配制成均匀混合液，定容后于3-10℃冷藏2-6小时，用0.45μm滤膜过滤，得到供试品检测液。
上述制备方法中，可适当设定水浴温度，以进行蒸发或溶解处理。当待测复方药物为喷雾剂或溶液剂时，所设定的水浴温度可使待测复方药物中可能的有机基质或溶剂蒸发即可，同时也可配合使用惰性气体进行吹扫，以更快速、充分地去除上述有机基质或溶剂，如在本发明的一实施方式中，可将精密量取后的复方药物置于约37℃水浴中蒸发，去除乙醇等有机基质或溶剂，用氮气或其他惰性气体吹干，然后加检测用流动相溶解，并稀释至刻度，定容后进行冷藏过滤，得到供试品检测液；当待测复方药物为栓剂时，所设定的水浴温度能够使栓剂溶解即可，在本发明的一实施方式中，综合考虑栓剂溶解速率及防止过高温度破坏药物成分，采用约60℃水浴加热溶解。
本发明中，在对待测物进行上述水浴加热、或超声振荡等处理过程中，一般也会伴随热量的产生，在一实施方式中，可先将经上述处理的待测物放冷至室温再进行定容，以减少误差，进一步提高检测的准确性。
上述制备方法中，用检测用流动相将复方药物供试品配制成均匀混合液，然后将该混合液在相应的温度条件下进行冷藏，充分沉淀液体中的不溶物，更利于过滤分离效果，提高待测液的纯度。其中，可将混合液置于冰箱或冷柜中冷藏，然本发明并不以此为限，也可采用其他适当的冷藏方式。
在本发明的一实施方式中，为进一步提高检测的准确性，可将上述冷藏后的混合液取出后立即过滤，弃去初滤液，取续滤液用0.45μm滤膜过滤，得到供试品检测液。
一般情况下，进样量也会影响检测效果，若进样量过大，则易产生较大误差，影响检测的准确度与灵敏度，且峰图中可能会出现杂质峰更为明显、目标峰超出显示图面等问题；若进样量过少，则可能会导致出峰不明显等问题。为更利于显示结果，使各成分出峰面积更为清晰，更易分离，以及进一步提高检测的准确性，在本发明的一实施方式中，检测时，可分别取各对照品测定液和供试品检测液10-50μl(即进样量)，注入高效液相色谱仪，记录待检测目标物的色谱峰面积，基于相应的对照品测定结果，按外标法以峰面积计算确定所测定目标物的含量。如在本发明的一具体实施例中，进样量可为20μl左右。
具体地，如在检测联苯苄唑和醋酸氯己定时，可按照上述方法分别配制复方药物供试品检测液、以及联苯苄唑、醋酸氯己定的混合对照品测定液，各取一定量(如各取20μl)的该供试品检测液和该混合对照品测定液分别注入高效液相色谱仪进行检测，分别记录用该供试品检测液进行检测所得的色谱图中联苯苄唑和醋酸氯己定的色谱峰面积，以及用该混合对照品测定液进行检测所得的色谱图中联苯苄唑和醋酸氯己定的色谱峰面积，基于上述联苯苄唑或醋酸氯己定的色谱峰面积测定结果，可以按外标法分别以联苯苄唑或醋酸氯己定的色谱峰面积计算确定其各自的含量。同样，在对联苯苄醇或对氯苯胺进行检测时，也可以按外标法以峰面积计算确定其含量。
本发明中，可采用手动或自动方式进样，如可采用常规的手动进样器、自动进样器进样等，本发明对此不做特别限定。
本发明中，发明人进一步对检测波长进行了探究，采用HPLC色谱在线光谱扫描确认：联苯苄唑在254nm波长处有最大吸收(图14A)，醋酸氯己定在250～260nm有强吸收的扁平峰(图14B)，联苯苄醇最大吸收波长为254nm(图14C)，对氯苯胺在240nm波长处有最大吸收，在200～320nm范围都有较强紫外线吸收(图14D)，综合考虑各成分对光的吸收范围，以及考虑能够同时测定联苯苄唑和醋酸氯己定这两个成分、以及便于在测定活性成分含量时同时检测对氯苯胺的含量等因素，在本发明一实施方式中，采用高效液相色谱法测定时，采用254nm±2nm为检测波长。
进一步地，为更加高效、准确的对各成分进行测定，在本发明的一实施过程中，测定联苯苄唑、醋酸氯己定和对氯苯胺含量时，流动相选用甲醇:三乙胺:磷酸:水相＝570:5:10:415；测定联苯苄醇含量时，流动相选用甲醇:水相＝775:225。
保证有效成分含量达到一定要求，以及控制杂质成分在一定范围内，是保证药物的质量及疗效的必要条件。对于本发明复方药物的质量监测方法，根据检测结果，联苯苄唑和醋酸氯己定含量为其各自标称含量的90-110％，联苯苄醇和对氯苯胺分别相对于联苯苄唑和醋酸氯己定的量均不大于5％，则待测复方药物的质量达标。为进一步对上述复方药物进行质量控制，保证其安全性、有效性及可靠性，在本发明的一实施方式中，联苯苄醇和对氯苯胺分别相对于联苯苄唑和醋酸氯己定的量均不大于2％。其中，某复方药物中，联苯苄醇相对于联苯苄唑的量＝所测得的联苯苄醇的含量/所测得的联苯苄唑的含量；对氯苯胺相对于醋酸氯己定的量＝所测得的对氯苯胺的含量/所测得的醋酸氯己定的含量。
本发明所提供的质量监测方法专属性强、精密度好、准确度高，可排除各成分之间的相互干扰，实现对包含联苯苄唑/醋酸氯己定复方药物的质量监测，快速准确的测定有关物质的含量，保证上述复方药物的安全性、有效性及可靠性，实现质量控制。
附图说明
图1A为喷雾剂中溶液基质测定液的色谱图；图1B为联苯苄唑与醋酸氯己定混合对照品测定液的色谱图；图1C为喷雾剂供试品检测液的色谱图；图1D为醋酸氯己定进样浓度与峰面积线性关系图；图1E为联苯苄唑进样浓度与峰面积线性关系图；
图2A为喷雾剂中溶液基质测定液的色谱图；图2B为联苯苄醇对照品测定液的色谱图；图2C为喷雾剂加联苯苄醇对照品测定液的色谱图；图2D为联苯苄醇进样浓度与峰面积线性关系图；
图3A为喷雾剂中溶液基质测定液的色谱图；图3B为对氯苯胺对照品测定液的色谱图；图3C为喷雾剂加对氯苯胺对照品测定液的色谱图；图3D为对氯苯胺进样浓度与峰面积线性关系图；
图4为测定乳膏剂中联苯苄唑、醋酸氯己定时的色谱图；
图5为测定乳膏剂中联苯苄醇时的色谱图；
图6为测定乳膏剂中对氯苯胺时的色谱图；
图7A为凝胶剂中凝胶基质测定液的色谱图；图7B为联苯苄唑醋酸氯己定混合对照品测定液的色谱图；图7C为凝胶剂供试品检测液的色谱图；
图8A为凝胶剂中凝胶基质测定液的色谱图；图8B为联苯苄醇对照品测定液的色谱图；图8C为凝胶剂加联苯苄醇对照品测定液的色谱图；
图9A为联苯苄醇对照品测定液在色谱条件a下测得的色谱图；图9B为喷雾剂加联苯苄醇对照品测定液在色谱条件a下测得的色谱图；
图10A为凝胶剂中凝胶基质测定液的色谱图；图10B为对氯苯胺对照品测定液的色谱图；图10C为凝胶剂加对氯苯胺对照品测定液的色谱图；
图11A为空白对照栓测定液的色谱图；图11B为联苯苄唑与醋酸氯己定混合对照品测定液的色谱图；图11C为栓剂供试品检测液的色谱图；
图12A为栓剂中空白对照栓测定液的色谱图；图12B为联苯苄醇对照品测定液的色谱图；图12C为栓剂供试品检测液的色谱图；
图13A为空白对照栓测定液的色谱图；图13B为对氯苯胺对照品测定液的色谱图；图13C为栓剂供试品检测液的色谱图；
图14A为联苯苄唑的光谱图；图14B为醋酸氯己定的光谱图；图14C为联苯苄醇的光谱图；图14D为对氯苯胺的光谱图。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
以下实施例中，采用安捷伦(Agilent)1100系列高效液相色谱仪，含G1310A-液相色谱泵，7725i型手动进样器，G1314A-VWD紫外-可见光检测器，Agilent液相色谱系统化学工作站。
以下实施例中，联苯苄唑(10326-0201)对照品、醋酸氯己定(0183-99021)对照品、联苯苄醇(10327-0201)对照品、对氯苯胺对照品均购自中国药品生物制品鉴定所；甲醇(Fisher Scientific Co Lot No 032314)色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。
以下实施例中，检测各成分时的色谱条件如下：
1)检测联苯苄唑、醋酸氯己定、对氯苯胺的色谱条件(以下称色谱条件a)为：采用安捷伦ZORBAX SB-C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇：三乙胺：磷酸：水＝570：5：10：415为流动相(以下称流动相a)；流动相流速：1ml/min；检测波长254nm；柱温25℃；
2)检测联苯苄醇的色谱条件(以下称色谱条件b)：采用安捷伦ZORBAX SB-C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇:水＝775:225为流动相(以下称流动相b)；流动相流速：1ml/min；检测波长254nm；柱温25℃。
以下实施例中，复方喷雾剂、乳膏剂、凝胶剂、栓剂均分别以一定量的药物成分及余量的基质加工制成，具体地，该复方喷雾剂、乳膏剂、凝胶剂、栓剂及其分别对应的未包含药物成分的溶液基质、乳膏基质、凝胶基质、栓基质分别按照如下配方加工制成(可采用本领域常规工艺及常用医用辅料加工)：
紫外吸收显示，联苯苄唑在254nm波长处有最大吸收，醋酸氯己定在250～260nm波长范围有强吸收的平头峰，在此波长下，溶液基质、乳膏基质、凝胶基质等也有较强紫外吸收，难以直接用紫外分光光度法测定联苯苄唑和醋酸氯己定的含量，容量法也难以对上述剂型的主要成分准确测定；且栓基质和药物成分间对容量法、光谱法测定含量存在干扰。本品为复方制剂，已有报道的文献方法不能直接用于含量测定，以下实施例研究建立了采用高效液相色谱法测定复方联苯苄唑醋酸氯己定喷雾剂、乳膏剂、凝胶剂、栓剂中联苯苄唑、醋酸氯己定及其他有关物质含量的方法，方法验证如下：
实施例1：复方联苯苄唑醋酸氯己定喷雾剂(以下简称喷雾剂)中有关物质测定方法学考察试验
本实施例中，如无特别说明，喷雾剂供试品检测液均按如下方法配制：精密量取0.5ml喷雾剂溶液，置50ml容量瓶中，在约37℃水浴中蒸发，去乙醇，用氮气吹干，加适量检测用流动相溶解，摇匀，配制成均匀混合液，继续加检测用流动相稀释至刻度，摇匀，定容，置冰箱(约4℃)冷藏2h以上，取出用0.45μm滤膜过滤，即得。
其中，1)在测定联苯苄唑、醋酸氯己定、对氯苯胺的相关试验中，检测用流动相为流动相a；2)在测定联苯苄醇的相关试验中，检测用流动相为流动相b。
一、喷雾剂中联苯苄唑、醋酸氯己定的含量测定方法验证
(一)、系统适用性试验
1、色谱柱的理论板数和分离度
1)检测用溶液配制
(1)联苯苄唑醋酸氯己定混合对照品测定液配制
分别精密称定联苯苄唑对照品与醋酸氯己定对照品各10mg，置同一100ml容量瓶中，加适量流动相a溶解并混匀，继续加流动相a稀释至刻度，摇匀，定容，配制成联苯苄唑醋酸氯己定混合对照品储备液；精密量取5ml上述对照品储备液，置10ml容量瓶中，加流动相a稀释至刻度，摇匀，定容，即得联苯苄唑醋酸氯己定混合对照品测定液(其中，联苯苄唑与醋酸氯己定浓度均为50μg/ml)。
(2)配制喷雾剂供试品检测液
(3)喷雾剂中溶液基质测定液配制
精密量取0.5ml喷雾剂的溶液基质，置50ml容量瓶中，在约37℃水浴中蒸发，去乙醇，用氮气吹干，加适量流动相a溶解，摇匀，配制成均匀混合液，继续加流动相a稀释至刻度，摇匀，定容，置冰箱(约4℃)冷藏2h以上，取出用0.45μm滤膜过滤，即得。
2)检测
各取20μl上述混合对照品测定液、供试品检测液、溶液基质测定液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件a下进行检测，检测结果如图1A-图1C所示；其中，图1A为喷雾剂中溶液基质测定液的色谱图；图1B为联苯苄唑与醋酸氯己定混合对照品测定液的色谱图；图1C为喷雾剂供试品检测液的色谱图。
图1A-图1C表明，联苯苄唑保留时间约为13min，醋酸氯己定保留时间约为8min，理论板数均大于3000，与相邻峰的分离度均大于1.5。
2、对照品溶液进样重复性试验
取上述联苯苄唑醋酸氯己定混合对照品测定液，按照上述检测方法重复进样5次，记录色谱峰面积，并计算峰面积数据的相对标准偏差RSD，结果见表1。
表1、联苯苄唑醋酸氯己定混合对照品测定液进样重复性试验结果
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | RSD |
| 联苯苄唑峰面积 | 5562.57 | 5577.25 | 5610.40 | 5597.56 | 5599.58 | 0.34％ |
| 醋酸氯己定峰面积 | 3378.51 | 3375.58 | 3395.39 | 3386.81 | 3386.06 | 0.23％ |
表1结果显示，联苯苄唑醋酸氯己定混合对照品测定液进样重复性测定结果符合《中华人民共和国药典》高效液相色谱法项下系统适用性试验的要求(RSD不大于2.0％)。
(二)、线性关系试验
1)溶液配制
分别精密称定联苯苄唑对照品110.8mg、醋酸氯己定对照品112.3mg，置同一个100ml容量瓶中，加适量流动相a溶解并混匀，继续加流动相a稀释至刻度，摇匀，定容，配制成混合对照品储备液；
取混合对照品储备液，用流动相a配制5份醋酸氯己定浓度分别为33.69μg/ml、89.84μg/ml、112.3μg/ml、146.0μg/ml、179.7μg/ml的对照品溶液，以及5份联苯苄唑浓度分别为33.24μg/ml、88.64μg/ml、110.8μg/ml、144.0μg/ml、177.3μg/ml的对照品溶液。
2)检测
各取20μl上述10份对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件a下进行检测，记录色谱峰面积，计算回归方程，结果见表2、表3、图1D、图1E。
表2、醋酸氯己定线性关系试验结果
表3、联苯苄唑线性关系试验结果
表2与图1D、表3与图1E分别显示，醋酸氯己定、联苯苄唑进样浓度与峰面积在30～180μg/ml范围呈良好的线性关系。
(三)、方法重复性和准确度试验
1)配制联苯苄唑、醋酸氯己定含量不同的复方溶液回收测定用样品
配制混合对照品溶液，并确定其每1毫升中含联苯苄唑对照品0.4986mg、含醋酸氯己定对照品0.5054mg；
按如下量精密量取喷雾剂溶液基质，分别置50ml容量瓶中，并分别按如下量精密加入所配制的混合对照品溶液，配制3组联苯苄唑、醋酸氯己定含量不同的溶液回收测定用样品，分别用流动相a定容；每组配制3份，第1组编号1-1～1-3，第2组编号2-1～2-3，第3组编号3-1～3-3：
第1组：溶液基质0.5ml，混合对照品溶液4ml(每1ml溶液基质含联苯苄唑3.988mg、醋酸氯己定4.044mg)；
第2组：溶液基质0.38ml，混合对照品溶液4.65ml(每1ml溶液基质含联苯苄唑6.100mg、醋酸氯己定6.184mg)；
第3组：溶液基质0.52ml，混合对照品溶液5.5ml(每1ml溶液基质含联苯苄唑5.273mg、醋酸氯己定5.346mg)。
2)检测
分别按上述检测方法进行检测，记录色谱峰面积，考察重复性并计算回收率，结果见表4、表5。
表4、联苯苄唑回收率测定结果
“*”：表示测试进样或样品测定结果中每毫升溶液基质中联苯苄唑的含量(毫克)。
表5、醋酸氯己定回收率测定结果
“*”：表示测试进样或样品测定结果中每毫升溶液基质中醋酸氯己定的含量(毫克)。
表4与表5结果显示，按照《中华人民共和国药典》(2015年版四部)药品质量标准分析方法验证项下要求进行重复性试验，复方联苯苄唑醋酸氯己定溶液中，联苯苄唑和醋酸氯己定回收率测定数据的RSD分别为0.55％和0.57％，其平均回收率分别为99.4％和102.7％。
(四)、供试品溶液稳定性试验
配制喷雾剂供试品检测液，6h内重复进样测定6次，结果见表6。
表6、稳定性试验结果
| 进样时间(h) | 0 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD |
| 醋酸氯己定峰面积 | 2839.23 | 2863.11 | 2859.00 | 2856.07 | 2844.08 | 2896.54 | 0.71％ |
| 联苯苄唑峰面积 | 5190.24 | 5250.70 | 5237.02 | 5224.80 | 5266.62 | 5251.13 | 0.51％ |
表6结果显示，供试品溶液至少在6h内稳定。
(五)、样品含量测定
按照上述配方，配制三批喷雾剂样品(批号见表7)，按如下方法分别测定每批样品中联苯苄唑和醋酸氯己定的含量，结果见表7：
1)按照上述方法配制联苯苄唑与醋酸氯己定浓度均为50μg/ml的混合对照品测定液；
2)取喷雾剂样品，配制喷雾剂供试品检测液；
3)各取20μl所配制的混合对照品测定液、供试品检测液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件a下进行检测，分别记录联苯苄唑与醋酸氯己定的色谱峰面积，分别通过外标法以峰面积计算喷雾剂中联苯苄唑与醋酸氯己定的含量。
表7、三批喷雾剂样品中联苯苄唑和醋酸氯己定含量测定结果
| 批号 | 20040803 | 20040808 | 20040812 |
| 醋酸氯己定含量(％) | 0.5097 | 0.5255 | 0.5117 |
| 联苯苄唑含量(％) | 0.5230 | 0.5245 | 0.5110 |
二、喷雾剂中联苯苄醇的检测方法验证
根据《中华人民共和国药典》及有关文献报道显示，联苯苄唑的主要分解产物是联苯苄醇，为了考察复方联苯苄唑醋酸氯己定喷雾剂溶液中联苯苄醇的含量及稳定性研究样品中联苯苄醇含量的变化，建立了本复方联苯苄唑醋酸氯己定喷雾剂溶液中联苯苄醇含量的测定方法，并对稳定性研究的三批样品进行了检查。
在HPLC测定联苯苄醇时，采用了与检测联苯苄唑、醋酸氯己定、对氯苯胺时不同的流动相，主要是因为反复多次的试验结果均显示对氯苯胺和联苯苄醇保留特性差别很大。如果联苯苄醇测定采用后者的流动相条件(即流动相a，甲醇：三乙胺：磷酸：水＝570：5：10：415，流速1ml/min)，当对氯苯胺在3.3min左右出峰时，联苯苄醇的出峰时间达76min(见图9A与图9B，其中，图9A为下述联苯苄醇对照品测定液在色谱条件a下测得的色谱图，图9B为下述喷雾剂加联苯苄醇对照品测定液在色谱条件a下测得的色谱图)，完全不适合测定。因此，对联苯苄醇和对氯苯胺的检查采用了不同的色谱系统进行分离测定，方法验证及检查结果如下：
(一)、系统适用性试验
1、色谱柱的理论板数和分离度
1)检测用溶液配制
(1)联苯苄醇对照品测定液配制
精密称定联苯苄醇对照品25.00mg，置100ml容量瓶中，加适量流动相b溶解并混匀，继续加流动相b稀释至刻度，摇匀，定容，配制成联苯苄醇对照品储备溶液(联苯苄醇浓度为250μg/ml)；
精密量取联苯苄醇对照品储备溶液，用流动相b配制成联苯苄醇浓度为1.000μg/ml的联苯苄醇对照品测定液。
(2)喷雾剂加联苯苄醇对照品测定液配制
取供试品喷雾剂溶液1ml，精密量取0.4ml联苯苄醇对照品储备溶液(250μg/ml)，置100ml容量瓶中用流动相b溶解并混匀，继续加流动相b稀释至刻度，摇匀，定容，即得。
或者，根据测试品的实际情况，也可以采用按照前述方法配制的喷雾剂供试品检测液。
(3)喷雾剂中溶液基质测定液配制
取喷雾剂的溶液基质1ml，置100ml容量瓶中，用流动相b溶解并混匀，继续加流动相b稀释至刻度，摇匀，定容。
2)检测
各取20μl联苯苄醇对照品测定液、喷雾剂加联苯苄醇对照品测定液、溶液基质测定液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件b下进行检测，检测结果如图2A-图2C所示；其中，图2A为喷雾剂中溶液基质测定液的色谱图；图2B为联苯苄醇对照品测定液的色谱图；图2C为喷雾剂加联苯苄醇对照品测定液的色谱图。
图2A-图2C表明，联苯苄醇保留时间约为8min，理论板数大于3000，与相邻峰的分离度大于1.5。
2、对照品溶液进样重复性试验
取上述联苯苄醇对照品测定液，按照上述联苯苄醇的检测方法重复进样5次，记录色谱峰面积，结果见表8。
表8、联苯苄醇对照品测定液进样重复性试验结果
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | RSD |
| 联苯苄醇峰面积 | 20.50 | 20.36 | 20.08 | 19.93 | 20.58 | 1.4％ |
表8结果显示，联苯苄醇对照品测定液进样重复性测定结果符合《中华人民共和国药典》(2015年版四部)高效液相色谱法项下系统适用性试验的要求(RSD不大于2.0％)。
(二)、线性关系试验
1)溶液配制
取上述联苯苄醇对照品储备溶液(或重新配制)，用流动相b配制5份联苯苄醇浓度分别为1.88μg/ml、1.25μg/ml、1.00μg/ml、0.625μg/ml、0.500μg/ml的对照品溶液。
2)检测
各取20μl上述5份对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件b下进行检测，记录色谱峰面积，计算回归方程，结果见表9和图2D。
表9、联苯苄醇线性关系试验结果
表9和图2D显示，联苯苄醇的进样浓度与峰面积在0.50～1.88μg/ml范围呈良好的线性关系。
(三)、方法重复性和准确度试验
1)配制联苯苄醇含量不同的溶液回收测定用样品
按照上述方法配制联苯苄醇浓度为0.1000mg/ml的联苯苄醇对照品溶液；
按如下量精密量取溶液基质，分别置100ml容量瓶中，并分别按如下量精密加入所配制的联苯苄醇对照品溶液，配制3组联苯苄醇含量不同的溶液回收测定用样品，分别用流动相b定容(定容后联苯苄醇浓度均为0.1mg/100ml)；每组配制3份，第1组编号1-1～1-3，第2组编号2-1～2-3，第3组编号3-1～3-3：
第1组：溶液基质0.75ml，对照品溶液1ml；
第2组：溶液基质1.0ml，对照品溶液1ml；
第3组：溶液基质1.4ml，对照品溶液1ml。
2)检测
分别按上述检测方法进行检测，记录联苯苄醇色谱峰面积，考察重复性并计算回收率，结果见表10。
表10、联苯苄醇回收率测定结果
“*”：表示测试进样或样品测定结果中联苯苄醇的浓度。
表10结果显示，按照《中华人民共和国药典》(2015年版四部)药品质量标准分析方法验证项下要求进行重复性试验，上述复方喷雾剂溶液中，联苯苄醇回收率测定数据的RSD为1.3％，其平均回收率为104.1％。
(四)、供试品溶液稳定性试验
配制喷雾剂供试品检测液，5h内重复进样测定6次，结果见表11。
表11、稳定性试验结果
| 进样时间(h) | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | RSD |
| 联苯苄醇峰面积 | 29.44 | 29.23 | 29.71 | 29.36 | 29.8 | 29.71 | 0.78％ |
表11结果显示，供试品溶液至少在5h内稳定。
(五)、样品含量测定
取所配制的三批喷雾剂样品(批号见表12)，按如下方法，分别检测加速、长期试验条件下每批样品中联苯苄醇的含量，结果见表12：
1)按照上述方法配制联苯苄醇浓度为1.000μg/ml的联苯苄醇对照品测定液；
2)取喷雾剂样品，配制喷雾剂供试品检测液；
3)各取20μl所配制的对照品测定液、供试品检测液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件b下进行检测，分别记录联苯苄醇的色谱峰面积，通过外标法以峰面积计算喷雾剂中联苯苄醇的含量。
表12、不同试验条件下，三批喷雾剂样品中联苯苄醇的含量测定结果(联苯苄醇相对于联苯苄唑的量)
表12结果显示，加速、长期试验条件下，三批样品中的联苯苄醇的量均不大于联苯苄唑含量的1％(小于《药物杂质研究技术指导原则》中要求的制剂的杂质报告限度，即：小于5％)。
三、喷雾剂中对氯苯胺的检测方法验证
根据《中华人民共和国药典》和有关文献报道显示，醋酸氯已定的主要分解产物是对氯苯胺，为了考察复方联苯苄唑醋酸氯己定喷雾剂溶液中对氯苯胺的含量及稳定性研究样品中对氯苯胺含量的变化，建立了本复方联苯苄唑醋酸氯己定喷雾剂溶液中对氯苯胺含量测定方法并对稳定性研究的三批样品进行了检查。方法验证及检查结果如下：
(一)、系统适用性试验
1、色谱柱的理论板数和分离度
1)检测用溶液配制
(1)对氯苯胺对照品测定液配制
精密称定对氯苯胺对照品12mg，置100ml容量瓶中，加适量流动相a溶解并混匀，继续加流动相a稀释至刻度，摇匀，定容，配制成对氯苯胺对照品储备溶液(对氯苯胺浓度120.0μg/ml)；
精密量取0.830ml对氯苯胺对照品储备溶液，置100ml容量瓶中，用流动相a溶解并混匀，继续加流动相a稀释至刻度，摇匀，定容，即得对氯苯胺浓度为0.9960μg/ml的对氯苯胺对照品测定液。
(2)喷雾剂加对氯苯胺对照品测定液配制
取供试品喷雾剂溶液1ml，精密量取0.830ml对氯苯胺对照品储备溶液(120.0μg/ml)，置100ml容量瓶中，用流动相a溶解并混匀，继续加流动相a稀释至刻度，摇匀，定容。
或者，根据测试品的实际情况，也可以采用按照前述方法配制的喷雾剂供试品检测液；或者也可采用按照如下方法配制的喷雾剂供试品检测液：取供试品喷雾剂溶液1ml，置100ml容量瓶中用流动相a溶解并混匀，继续加流动相a稀释至刻度，摇匀，定容。
(3)喷雾剂中溶液基质测定液配制
取喷雾剂的溶液基质1ml，置100ml容量瓶中，用流动相a溶解并混匀，继续加流动相a稀释至刻度，摇匀，定容。
2)检测
各取20μl对氯苯胺对照品测定液、喷雾剂加对氯苯胺对照品测定液、溶液基质测定液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件a下进行检测，检测结果如图3A-图3C所示；其中，图3A为喷雾剂中溶液基质测定液的色谱图；图3B为对氯苯胺对照品测定液的色谱图；图3C为喷雾剂加对氯苯胺对照品测定液的色谱图。
图3A-图3C表明，对氯苯胺保留时间约为3.3min，理论板数大于3000，与喷雾剂溶液中其他成分可以分离，分离度大于1.5。
2、对照品溶液进样重复性试验
按照上述方法配制对氯苯胺浓度为1.200μg/ml的对氯苯胺对照品溶液；
取所配制的对氯苯胺对照品溶液，按照上述对氯苯胺的检测方法重复进样5次，记录色谱峰面积，结果见表13。
表13、对氯苯胺对照品测定液进样重复性试验结果
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | RSD |
| 对氯苯胺峰面积 | 16.57 | 16.24 | 15.30 | 16.17 | 15.17 | 3.9％ |
表13结果显示，对氯苯胺对照品溶液进样重复性测定，其峰面积数据的RSD为3.9％。
(二)、线性关系试验
1)溶液配制
取上述对氯苯胺对照品储备液(或重新配制)，用流动相a配制5份对氯苯胺浓度分别为1.2μg/ml、0.96μg/ml、0.72μg/ml、0.48μg/ml、0.24μg/ml的对照品溶液。
2)检测
各取20μl上述5份对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件a下进行检测，记录色谱峰面积，计算回归方程，结果见表14和图3D。
表14、对氯苯胺线性关系试验结果
表14和图3D显示，对氯苯胺的进样浓度与峰面积在0.24～1.2μg/ml范围呈良好的线性关系。
(三)、方法重复性和准确度试验
1)配制对氯苯胺含量不同的溶液回收测定用样品
按照上述方法配制对氯苯胺浓度为0.1200mg/ml的对照品溶液；
按如下量精密量取溶液基质，分别置100ml容量瓶中，并分别按如下量精密加入所配制的对氯苯胺对照品溶液，配制3组对氯苯胺含量不同的溶液回收测定用样品，分别用流动相a定容；每组配制3份，第1组编号1-1～1-3，第2组编号2-1～2-3，第3组编号3-1～3-3：
第1组：溶液基质0.95ml，对照品溶液0.95ml，定容后对氯苯胺浓度为1.14μg/ml；
第2组：溶液基质1ml，对照品溶液0.900ml，定容后对氯苯胺浓度为1.08μg/ml；
第3组：溶液基质1.4ml，对照品溶液0.85ml，定容后对氯苯胺浓度为1.02μg/ml。
2)检测
分别按上述检测方法进行检测，记录对氯苯胺色谱峰面积，考察重复性并计算回收率，结果见表15。
表15、对氯苯胺回收率测定结果
“*”：表示测试进样或样品测定结果中对氯苯胺的浓度。
表15结果显示，按照《中华人民共和国药典》(2015年版四部)药品质量标准分析方法验证项下要求进行重复性试验，上述复方喷雾剂溶液中，对氯苯胺回收率测定数据的RSD为2.8％，其平均回收率为98.3％。
(四)、供试品溶液稳定性试验
配制喷雾剂供试品检测液，5h内重复进样测定6次，结果见表16。
表16、稳定性试验结果
| 进样时间(h) | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | RSD |
| 对氯苯胺峰面积 | 9.5 | 9.3 | 9.3 | 9.5 | 9.4 | 9.5 | 1.0％ |
表16结果显示，供试品溶液至少在5h内稳定。
(五)、样品含量测定
取所配制的三批喷雾剂样品(批号见表17)，按如下方法，分别检测加速、长期试验条件下每批样品中对氯苯胺的含量，结果见表17：
1)按照上述方法配制对氯苯胺浓度为0.9960μg/ml的对氯苯胺对照品测定液；
2)取喷雾剂样品，配制喷雾剂供试品检测液；
3)各取20μl所配制的对照品测定液、供试品检测液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件a下进行检测，分别记录对氯苯胺的色谱峰面积，通过外标法以峰面积计算喷雾剂中对氯苯胺的含量。
表17、不同试验条件下，三批喷雾剂样品中对氯苯胺的含量测定结果(对氯苯胺相对于醋酸氯己定的量)
表17结果显示，加速、长期试验条件下，三批样品中的对氯苯胺含量均不大于醋酸氯己定含量的1％(小于《药物杂质研究技术指导原则》中要求的制剂的杂质报告限度，即：小于5％)。
以下实施例2～4，分别是对不同剂型的复方药物中有关物质的测定方法学考察试验。其中，各成分的对照品溶液进样重复性试验、线性关系试验、方法重复性和准确度试验可参见实施例1的相关试验；供试品溶液稳定性试验结果均显示供试品溶液至少在5～6h内稳定，具体试验过程可参考实施例1。以下实施例2～4中仅详细说明各成分的理论板数和分离度以及样品含量测定。
实施例2，复方联苯苄唑醋酸氯己定乳膏剂(以下简称乳膏剂)中有关物质测定方法学考察试验
本实施例中，如无特别说明，乳膏剂供试品检测液均按如下方法配制：精密称定乳膏剂0.5g，置50ml容量瓶中，加约45ml检测液流动相，超声并反复振摇使之溶解；放冷至室温，检测用流动相稀释至刻度，摇匀，定容，置冰箱(约5～10℃)冷藏2h以上，取出后立即过滤(用0.45μm滤膜滤过)，弃去初滤液，取续滤液再用0.45μm滤膜滤过，即得。
其中，1)在测定联苯苄唑、醋酸氯己定、对氯苯胺的相关试验中，检测用流动相为流动相a；2)在测定联苯苄醇的相关试验中，检测用流动相为流动相b。
一、乳膏剂中联苯苄唑、醋酸氯己定的检测方法验证
1、色谱柱的理论板数和分离度
1)检测用溶液配制
(1)按照实施例1的方法配制联苯苄唑与醋酸氯己定浓度均为50μg/ml的混合对照品测定液。
(2)配制乳膏剂供试品检测液
(3)乳膏剂中乳膏基质测定液配制
称定乳膏基质0.5g，置50ml容量瓶中，加约45ml流动相a，超声并反复振摇使之溶解；放冷至室温，加流动相a稀释至刻度，摇匀，定容，置冰箱(约5～10℃)冷藏2h以上，取出后立即过滤(用0.45μm滤膜滤过)，弃去初滤液，取续滤液再用0.45μm滤膜滤过，即得。
2)检测
各取20μl上述混合对照品测定液、供试品检测液、乳膏基质测定液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件a下进行检测，检测结果如图4所示；其中，图4的A为联苯苄唑与醋酸氯己定混合对照品测定液的色谱图；图4的B为乳膏剂中乳膏基质测定液的色谱图；图4的C为乳膏剂供试品检测液的色谱图。
图4表明，联苯苄唑保留时间约为14min，醋酸氯己定保留时间约为9min，理论板数均大于3000，与相邻峰的分离度均大于1.5。
2、样品含量测定
按照上述配方，配制三批乳膏剂样品(批号见表18)，按如下方法分别测定每批样品中联苯苄唑和醋酸氯己定的含量，结果见表18：
1)按照上述方法配制联苯苄唑与醋酸氯己定浓度均为50μg/ml的混合对照品测定液；
2)取乳膏剂样品，配制供试品检测液；
3)各取20μl所配制的混合对照品测定液、供试品检测液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件a下进行检测，分别记录联苯苄唑与醋酸氯己定的色谱峰面积，分别通过外标法以峰面积计算乳膏剂中联苯苄唑与醋酸氯己定的含量。
表18、三批乳膏剂样品中联苯苄唑和醋酸氯己定含量测定结果
| 批号 | 20040720 | 20040726 | 20040730 |
| 醋酸氯己定含量(％) | 0.5053 | 0.5087 | 0.5055 |
| 联苯苄唑含量(％) | 0.5015 | 0.4957 | 0.4987 |
二、乳膏剂中联苯苄醇的检测方法验证
1、色谱柱的理论板数和分离度
1)检测用溶液配制
(1)按照实施例1的方法配制联苯苄醇浓度为1.000μg/ml的联苯苄醇对照品测定液。
(2)配制乳膏剂供试品检测液
(3)乳膏剂加联苯苄醇对照品测定液配制
取供试品乳膏剂1g，精密量取0.4ml联苯苄醇对照品储备溶液(250μg/ml)，置100ml容量瓶中，用流动相b溶解并混匀，继续加流动相b稀释至刻度，摇匀，定容。
(4)乳膏剂中乳膏基质测定液的配制
取乳膏基质1g，置100ml容量瓶中，用流动相b溶解并混匀，继续加流动相b稀释至刻度，摇匀，定容。
2)检测
各取20μl联苯苄醇对照品测定液、供试品检测液、乳膏基质测定液、乳膏剂加联苯苄醇对照品测定液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件b下进行检测，检测结果如图5所示；其中，图5的A为乳膏剂中乳膏基质测定液的色谱图；图5的B为联苯苄醇对照品测定液的色谱图；图5的C为乳膏剂供试品检测液的色谱图；图5的D为乳膏剂加联苯苄醇对照品测定液的色谱图。
图5表明，联苯苄醇保留时间约为8min，理论板数大于3000，与相邻峰的分离度大于1.5。
2、样品含量测定
取所配制的三批乳膏剂样品(批号见表19)，按如下方法，分别检测加速、长期试验条件下每批样品中联苯苄醇的含量，结果见表19：
1)按照上述方法配制联苯苄醇浓度为1.000μg/ml的联苯苄醇对照品测定液；
2)取乳膏剂样品，配制乳膏剂供试品检测液；
3)各取20μl所配制的对照品测定液、供试品检测液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件b下进行检测，分别记录联苯苄醇的色谱峰面积，分别通过外标法以峰面积计算乳膏剂中联苯苄醇的含量。
表19、不同试验条件下，三批乳膏剂样品中联苯苄醇的含量测定结果(联苯苄醇相对于联苯苄唑的量)
表19结果显示，加速、长期试验条件下，三批乳膏剂样品中联苯苄醇含量均不大于联苯苄唑含量的1％(小于《药物杂质研究技术指导原则》中要求的制剂的杂质报告限度，即：小于5％)。
三、乳膏剂中对氯苯胺的检测方法验证
1、色谱柱的理论板数和分离度
1)检测用溶液配制
(1)按照实施例1的方法配制对氯苯胺浓度为0.9960μg/ml的对氯苯胺对照品测定液。
(2)配制乳膏剂供试品检测液
(3)乳膏剂加对氯苯胺对照品测定液配制
取供试品乳膏剂1g，精密量取0.830ml对氯苯胺对照品储备溶液(120μg/ml)，置100ml容量瓶中用流动相a溶解并混匀，继续加流动相a稀释至刻度，摇匀，定容。
(4)乳膏剂中乳膏基质测定液配制
取乳膏基质1g，置100ml容量瓶中，用流动相a溶解并混匀，继续加流动相a稀释至刻度，摇匀，定容。
2)检测
各取20μl对氯苯胺对照品测定液、供试品检测液、乳膏基质测定液、乳膏剂加对氯苯胺对照品测定液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件a下进行检测，检测结果如图6所示；其中，图6的A为对氯苯胺对照品测定液的色谱图；图6的B为乳膏剂中乳膏基质测定液的色谱图；图6的C为乳膏剂供试品检测液的色谱图；图6的D为乳膏剂加对氯苯胺对照品测定液的色谱图。
图6表明，对氯苯胺保留时间约为3.2min，理论板数大于3000，与乳膏中其他成分可以分离。
2、样品含量测定
取所配制的三批乳膏剂样品(批号见表20)，按如下方法，分别检测加速、长期试验条件下每批样品中对氯苯胺的含量，结果见表20：
1)按照上述方法配制对氯苯胺浓度为0.9960μg/ml的对氯苯胺对照品测定液；
2)取乳膏剂样品，配制乳膏剂供试品检测液；
3)各取20μl所配制的对照品测定液、供试品检测液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件a下进行检测，分别记录对氯苯胺的色谱峰面积，通过外标法以峰面积计算乳膏剂中对氯苯胺的含量。
表20、不同试验条件下，三批乳膏剂样品中对氯苯胺的含量测定结果(对氯苯胺相对于醋酸氯己定的量)
表20结果显示，加速、长期试验条件下，三批乳膏剂样品中对氯苯胺含量均不大于醋酸氯己定含量的1％(小于《药物杂质研究技术指导原则》中要求的制剂的杂质报告限度，即：小于5％)。
实施例3，复方联苯苄唑醋酸氯己定凝胶剂(以下简称凝胶剂)中有关物质测定方法学考察试验
本实施例中，如无特别说明，凝胶剂供试品检测液均按如下方法配制：精密称定0.5g凝胶剂，置50ml容量瓶中，加约40ml检测用流动相，超声并反复振摇使之溶解；放冷至室温，加检测用流动相稀释至刻度，摇匀，定容，置冰箱(约5～10℃)冷藏2h以上，取出后立即过滤(用0.45μm滤膜过滤)，弃去初滤液，取续滤液再用0.45μm滤膜滤过，即得。
其中，1)在测定联苯苄唑、醋酸氯己定、对氯苯胺的相关试验中，检测用流动相为流动相a；2)在测定联苯苄醇的相关试验中，检测用流动相为流动相b。
一、凝胶剂中联苯苄唑、醋酸氯己定的检测方法验证
1、色谱柱的理论板数和分离度
1)检测用溶液配制
(1)按照实施例1的方法配制联苯苄唑与醋酸氯己定浓度均为50μg/ml的混合对照品测定液。
(2)配制凝胶剂供试品检测液
(3)凝胶剂中凝胶基质测定液配制
精密称定0.5g凝胶基质，置50ml容量瓶中，加约40ml流动相a，超声并反复振摇使之溶解；放冷至室温，加流动相a稀释至刻度，摇匀，定容，置冰箱(约5～10℃)冷藏2h以上，取出后立即过滤，弃去初滤液，取续滤液用0.45μm滤膜滤过，即得凝胶剂供试品检测液。
2)检测
各取20μl上述混合对照品测定液、供试品检测液、凝胶基质测定液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件a下进行检测，检测结果如图7A-图7C所示；其中，图7A为凝胶剂中凝胶基质测定液的色谱图；图7B为联苯苄唑醋酸氯己定混合对照品测定液的色谱图；图7C为凝胶剂供试品检测液的色谱图。
图7A-图7C表明，联苯苄唑保留时间约为13min，醋酸氯己定保留时间约为8min，理论板数均大于3000，与相邻峰的分离度均大于1.5。
2、样品含量测定
按照上述配方，配制三批凝胶剂样品(批号见表21)，按如下方法分别测定每批样品中联苯苄唑和醋酸氯己定的含量，结果见表21：
1)按照上述方法配制联苯苄唑与醋酸氯己定浓度均为50μg/ml的混合对照品测定液；
2)取凝胶剂样品，配制凝胶剂供试品检测液；
3)各取20μl所配制的混合对照品测定液、供试品检测液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件a下进行检测，分别记录联苯苄唑与醋酸氯己定的色谱峰面积，分别通过外标法以峰面积计算凝胶剂中联苯苄唑与醋酸氯己定的含量。
表21、三批凝胶剂样品中联苯苄唑和醋酸氯己定含量测定结果
| 批号 | 20061004 | 20061005 | 20061006 |
| 醋酸氯己定含量(％) | 0.4961 | 0.4983 | 0.5003 |
| 联苯苄唑含量(％) | 0.5010 | 0.4997 | 0.5033 |
二、凝胶剂中联苯苄醇的检测方法验证
1、色谱柱的理论板数和分离度
1)检测用溶液配制
(1)按照实施例1的方法配制联苯苄醇浓度为1.000μg/ml的联苯苄醇对照品测定液。
(2)凝胶剂加联苯苄醇对照品测定液配制
取供试品凝胶剂1g，精密量取0.4ml联苯苄醇对照品储备溶液(250μg/ml)，置100ml容量瓶中用流动相b溶解并混匀，继续加流动相b稀释至刻度，摇匀，定容。
或者，根据测试品的实际情况，也可以采用按照前述方法配制的凝胶剂供试品检测液。
(3)凝胶剂中凝胶基质测定液的配制
取凝胶基质1g，置100ml容量瓶中用流动相b溶解并混匀，继续加流动相b稀释至刻度，摇匀，定容。
2)检测
各取20μl联苯苄醇对照品测定液、凝胶基质测定液、凝胶剂加联苯苄醇对照品测定液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件b下进行检测，检测结果如图8A-图8C所示；其中，图8A为凝胶剂中凝胶基质测定液的色谱图；图8B为联苯苄醇对照品测定液的色谱图；图8C为凝胶剂加联苯苄醇对照品测定液的色谱图。
图8A-图8C表明，联苯苄醇保留时间约为8min，理论板数大于3000，与相邻峰的分离度大于1.5。
2、样品含量测定
取所配制的三批凝胶剂样品(批号见表22)，按如下方法，分别检测加速、长期试验条件下每批样品中联苯苄醇的含量，结果见表22：
1)按照上述方法配制联苯苄醇浓度为1.000μg/ml的联苯苄醇对照品测定液；
2)取凝胶剂样品，配制凝胶剂供试品检测液；
3)各取20μl所配制的对照品测定液、供试品检测液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件b下进行检测，分别记录联苯苄醇的色谱峰面积，通过外标法以峰面积计算凝胶剂中联苯苄醇的含量。
表22、不同试验条件下，三批凝胶剂样品中联苯苄醇的含量测定结果(联苯苄醇相对于联苯苄唑的量)
表22结果显示，加速、长期试验条件下，三批凝胶剂样品中联苯苄醇含量均不大于联苯苄唑含量的1％(小于《药物杂质研究技术指导原则》中要求的制剂的杂质报告限度，即：小于5％)。
三、凝胶剂中对氯苯胺的检测方法验证
1、色谱柱的理论板数和分离度
1)检测用溶液配制
(1)按照实施例1的方法配制对氯苯胺浓度为0.9960μg/ml的对氯苯胺对照品测定液。
(2)凝胶剂加对氯苯胺对照品测定液配制
取供试品凝胶剂1g，精密量取0.830ml对氯苯胺对照品储备溶液(120μg/ml)，置100ml容量瓶中，用流动相a溶解并混匀，继续加流动相a稀释至刻度，摇匀，定容。
或者，根据测试品的实际情况，也可以采用按照前述方法配制的凝胶剂供试品检测液。
或者，也可采用按照如下方法配制的凝胶剂供试品检测液：取供试品凝胶剂1g，置100ml容量瓶中用流动相a溶解并混匀，继续加流动相a稀释至刻度，摇匀，定容。
(3)凝胶剂中凝胶基质测定液配制
取凝胶基质1g，置100ml容量瓶中，用流动相a溶解并混匀，继续加流动相a稀释至刻度，摇匀，定容。
2)检测
各取20μl对氯苯胺对照品测定液、凝胶基质测定液、凝胶剂加对氯苯胺对照品测定液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件a下进行检测，检测结果如图10A-图10C所示；其中，图10A为凝胶剂中凝胶基质测定液的色谱图；图10B为对氯苯胺对照品测定液的色谱图；图10C为凝胶剂加对氯苯胺对照品测定液的色谱图。
图10A-图10C表明，对氯苯胺保留时间约为3.6min，理论板数大于3000，与凝胶剂中其他成分可以分离。
2、样品含量测定
取所配制的三批凝胶剂样品(批号见表23)，按如下方法，分别检测加速、长期试验条件下每批样品中对氯苯胺的含量，结果见表23：
1)按照上述方法配制对氯苯胺浓度为0.9960μg/ml的对氯苯胺对照品测定液；
2)取凝胶剂样品，配制凝胶剂供试品检测液；
3)各取20μl所配制的对照品测定液、供试品检测液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件a下进行检测，分别记录对氯苯胺的色谱峰面积，通过外标法以峰面积计算凝胶剂中对氯苯胺的含量。
表23、不同试验条件下，三批凝胶剂样品中对氯苯胺的含量测定结果(对氯苯胺相对于醋酸氯己定的量)
表23结果显示，加速、长期试验条件下，三批凝胶剂样品中的对氯苯胺含量均不大于醋酸氯己定含量的1％(小于《药物杂质研究技术指导原则》中要求的制剂的杂质报告限度，即：小于5％)。
实施例4，复方联苯苄唑醋酸氯己定栓剂(以下简称栓剂)中有关物质测定方法学考察试验
本实施例中，如无特别说明，栓剂供试品检测液按如下方法配制：
1)在测定联苯苄唑、醋酸氯己定、对氯苯胺的相关试验中，栓剂供试品检测液的配制方法：精密称定0.5g栓剂，置50ml容量瓶中，加约45ml流动相a，置约60℃水浴中加热使之溶解；放冷至室温，加流动相a稀释至刻度，摇匀，定容，置冰箱(约5～10℃)冷藏2h以上，取出后用0.45μm滤膜滤过，即得；
2)在测定联苯苄醇的相关试验中，栓剂供试品检测液的配制方法：精密称定0.5g栓剂，置50ml容量瓶中，加约45ml流动相b，超声并反复振摇使之溶解；放冷至室温，加流动相b稀释至刻度，摇匀，定容，置冰箱(约5～10℃)冷藏2h以上，取出后立即过滤(用0.45μm滤膜滤过)，弃去初滤液，取续滤液再用0.45μm滤膜滤过，即得。
一、栓剂中联苯苄唑、醋酸氯己定的检测方法验证
1、色谱柱的理论板数和分离度
1)检测用溶液配制
(1)按照实施例1的方法配制联苯苄唑与醋酸氯己定浓度均为50μg/ml的混合对照品测定液。
(2)配制栓剂供试品检测液
(3)空白对照栓测定液配制
精密称定0.5g栓基质，置50ml容量瓶中，加约45ml流动相a，置约60℃水浴中加热使之溶解；放冷至室温，加流动相a稀释至刻度，摇匀，定容，置冰箱(约5～10℃)冷藏2h以上，取出后用0.45μm滤膜滤过，即得。
2)检测
各取20μl上述混合对照品测定液、供试品检测液、空白对照栓测定液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件a下进行检测，检测结果如图11A-图11C所示；其中，图11A为空白对照栓测定液的色谱图；图11B为联苯苄唑与醋酸氯己定混合对照品测定液的色谱图；图11C为栓剂供试品检测液的色谱图。
图11A-图11C表明，联苯苄唑保留时间约为13min，醋酸氯己定保留时间约为8min，理论板数均大于3000，与相邻峰的分离度均大于1.5。
2、样品含量测定
按照上述配方，配制三批栓剂样品(批号见表24)，按如下方法分别测定每批样品中联苯苄唑和醋酸氯己定的含量，结果见表24：
1)按照上述方法配制联苯苄唑与醋酸氯己定浓度均为50μg/ml的混合对照品测定液；
2)取栓剂样品，配制栓剂供试品检测液；
3)各取20μl所配制的混合对照品测定液、供试品检测液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件a下进行检测，分别记录联苯苄唑与醋酸氯己定的色谱峰面积，分别通过外标法以峰面积计算栓剂中联苯苄唑与醋酸氯己定的含量。
表24、三批栓剂样品中联苯苄唑与醋酸氯己定含量测定结果
| 批号 | 20070716 | 20070717 | 20070718 |
| 联苯苄唑含量(％) | 0.4979 | 0.4979 | 0.5044 |
| 醋酸氯己定含量(％) | 0.0796 | 0.0795 | 0.0804 |
二、栓剂中联苯苄醇的检测方法验证
1、色谱柱的理论板数和分离度
1)检测用溶液配制
(1)按照实施例1的方法配制联苯苄醇浓度为1.000μg/ml的联苯苄醇对照品测定液。
(2)配制栓剂供试品检测液
或者，也可采用按照如下方法配制的供试品栓剂加联苯苄醇对照品测定液：取供试品栓剂1g，精密量取0.4ml联苯苄醇对照品储备溶液(250μg/ml)，置100ml容量瓶中，用流动相b溶解并混匀，继续加流动相b稀释至刻度，摇匀，定容。
(3)空白对照栓测定液的配制
取栓基质1g，置100ml容量瓶中，用流动相b溶解并混匀，继续加流动相b稀释至刻度，摇匀，定容。
2)检测
各取20μl联苯苄醇对照品测定液、供试品检测液、空白对照栓测定液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件b下进行检测，检测结果如图12A-图12C；其中，图12A为栓剂中空白对照栓测定液的色谱图；图12B为联苯苄醇对照品测定液的色谱图；图12C为栓剂供试品检测液的色谱图。
图12A-图12C表明，联苯苄醇保留时间约为8min，理论板数大于3000，与相邻峰的分离度大于1.5。
2、样品含量测定
取所配制的三批栓剂样品(批号见表25)，按如下方法，分别检测加速、长期试验条件下每批样品中联苯苄醇的含量，结果见表25：
1)按照上述方法配制联苯苄醇浓度为1.000μg/ml的联苯苄醇对照品测定液；
2)取栓剂样品，配制供试品检测液；
3)各取20μl所配制的对照品测定液、供试品检测液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件b下进行检测，分别记录联苯苄醇的色谱峰面积，通过外标法以峰面积计算栓剂中联苯苄醇的含量。
表25、不同试验条件下，三批栓剂样品中联苯苄醇的含量测定结果(联苯苄醇相对于联苯苄唑的量)
表25结果显示，联苯苄唑的化学性质稳定，加速、长期试验条件下的三批栓剂样品中联苯苄醇的含量均不大于联苯苄唑含量的1.6％，符合《中华人民共和国药典》(2015年版四部)联苯苄唑项下对有关物质的限量要求，且其在制剂中的含量在不同试验条件下也没有明显增加。
三、栓剂中对氯苯胺的检测方法验证
1、色谱柱的理论板数和分离度
1)检测用溶液配制
(1)按照实施例1的方法配制对氯苯胺浓度为0.9960μg/ml的对氯苯胺对照品测定液。
(2)栓剂供试品检测液配制
取供试品栓剂1g，置100ml容量瓶中，用流动相a溶解并混匀，继续加流动相a稀释至刻度，摇匀，定容。
或者，也可采用按照如下方法配制的栓剂加对氯苯胺对照品测定液：取供试品栓剂1g，精密量取0.830ml对氯苯胺对照品储备溶液(120μg/ml)，置100ml容量瓶中，用流动相a溶解并混匀，继续加流动相a稀释至刻度，摇匀，定容。
(3)空白对照栓测定液配制
取栓基质1g，置100ml容量瓶中，用流动相a溶解并混匀，继续加流动相a稀释至刻度，摇匀，定容。
2)检测
各取20μl对氯苯胺对照品测定液、供试品检测液、空白对照栓测定液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件a下进行检测，检测结果如图13A-图13C所示；其中，图13A为空白对照栓测定液的色谱图；图13B为对氯苯胺对照品测定液的色谱图；图13C为栓剂供试品检测液的色谱图。
图13A-图13C表明，对氯苯胺保留时间约为3.5min，理论板数大于3000，与栓剂中其他成分可以分离。
2、样品含量测定
取所配制的三批栓剂样品(批号见表26)，按如下方法，分别检测加速、长期试验条件下每批样品中对氯苯胺的含量，结果见表26：
1)按照上述方法配制对氯苯胺浓度为0.9960μg/ml的对氯苯胺对照品测定液；
2)取栓剂样品，配制栓剂供试品检测液；
3)各取20μl所配制的对照品测定液、供试品检测液，分别注入高效液相色谱仪，在色谱条件a下进行检测，分别记录对氯苯胺的色谱峰面积，通过外标法以峰面积计算栓剂中对氯苯胺的含量。
表26、不同试验条件下，三批栓剂样品中对氯苯胺的含量测定结果(对氯苯胺相对于醋酸氯己定的量)
表26的结果显示，加速、长期试验条件下，三批栓剂样品中的对氯苯胺含量均不大于醋酸氯己定含量的1％(小于《药物杂质研究技术指导原则》中要求的制剂的杂质报告限度，即：小于5％)，且其在制剂中的含量在不同试验条件下也没有明显增加。
上述实施例1～4中，根据检测结果，联苯苄唑和醋酸氯己定含量为样品各自标称含量的90-110％，联苯苄醇相对于联苯苄唑的量与对氯苯胺相对于醋酸氯己定的量均不大于5％，待测复方药物的质量达标。
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Claims (10)
1.包含联苯苄唑/醋酸氯己定复方药物的质量监测方法，每100重量份所述复方药物中包含联苯苄唑0.1-10重量份、醋酸氯己定0.05-10重量份，余量为药学可接受的辅料；所述监测方法包括采用高效液相色谱法对待测复方药物中联苯苄唑及其分解产物联苯苄醇、醋酸氯己定及其分解产物对氯苯胺进行测定，记录峰面积，按外标法以峰面积计算确定所测定目标物的含量。
2.根据权利要求1所述的质量监测方法，其中，采用高效液相色谱法测定时，填充剂选用十八烷基硅烷键合硅胶，检测波长为190～350nm；测定联苯苄唑、醋酸氯己定和对氯苯胺含量时，流动相选用甲醇:三乙胺:磷酸:水相＝(500～650):(1～10):(5～15):(350～500)；测定联苯苄醇含量时，流动相选用甲醇:水相＝(500～850):(150～350)。
3.根据权利要求2所述的质量监测方法，其中，流动相组成中的水相为磷酸盐缓冲液，其pH范围3-8；或者，流动相组成中的水相为水。
4.根据权利要求2所述的质量监测方法，其中，采用高效液相色谱法一次进样检测得到联苯苄唑和醋酸氯己定含量，并使醋酸氯己定保留时间约为6-9min、联苯苄唑保留时间约为11-15min，理论板数均大于3000，与相邻峰的分离度均大于1.5。
5.根据权利要求1-4任一项所述的质量监测方法，还包括对照品测定液和药物供试品检测液的制备方法：
分别精密量取联苯苄唑和醋酸氯己定对照品，加检测用流动相稀释并混匀，配制成每1ml中含量分别为0.0500mg±10％的联苯苄唑/醋酸氯己定对照品测定液；
精密量取联苯苄醇对照品，加检测用流动相配制成含量为1.0000μg/ml±10％的联苯苄醇对照品测定液；
精密量取对氯苯胺对照品，加检测用流动相配制成含量为1.0000μg/ml±10％的对氯苯胺对照品测定液；
精密量取待测复方药物0.5毫升或0.5克，偏差范围在±10％，置于50毫升容量瓶中，加入检测用流动相配制成均匀混合液，过滤处理后得到供试品检测液。
6.根据权利要求5所述的质量监测方法，其中，
所述待测复方药物为喷雾剂或溶液剂时，供试品检测液的配制过程包括：将精密量取的0.5毫升±10％待测复方药物置于50毫升容量瓶中，水浴除去可能的有机基质或溶剂，加入检测用流动相配制成均匀混合液，定容后于3-10℃冷藏2-6小时，用0.45μm滤膜过滤，得到供试品检测液；
所述待测复方药物为乳膏剂或凝胶剂时，供试品检测液的配制过程包括：将精密量取的0.5克±10％待测复方药物置于50毫升容量瓶中，加入检测用流动相并超声振荡处理配制成均匀混合液，定容后于3-10℃冷藏2-6小时，用0.45μm滤膜过滤，得到供试品检测液；
所述待测复方药物为栓剂时，供试品检测液的配制过程包括：将精密量取的0.5克±10％待测复方药物置于50毫升容量瓶中，水浴加热或超声振荡处理配制成均匀混合液，定容后于3-10℃冷藏2-6小时，用0.45μm滤膜过滤，得到供试品检测液。
7.根据权利要求5所述的质量监测方法，还包括：
检测时，分别取各对照品测定液和供试品检测液10-50μl，注入高效液相色谱仪，分别记录待检测目标物的色谱峰面积，基于相应的对照品测定结果，按外标法以峰面积计算确定所测定目标物的含量。
8.根据权利要求5或7所述的质量监测方法，其中，采用高效液相色谱法测定时，检测波长为254nm±2nm。
9.根据权利要求2、4或7所述的质量监测方法，其中，测定联苯苄唑、醋酸氯己定和对氯苯胺含量时，流动相选用甲醇:三乙胺:磷酸:水相＝570:5:10:415；测定联苯苄醇含量时，流动相选用甲醇:水相＝775:225。
10.根据权利要求1-9任一项所述的质量监测方法，其中，根据检测结果，联苯苄唑和醋酸氯己定含量为其各自标称含量的90-110％，联苯苄醇和对氯苯胺分别相对于联苯苄唑和醋酸氯己定的量均不大于5％，则待测复方药物的质量达标。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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