CN112175051B - 低含量Bt晶体蛋白的快速纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种目的蛋白的纯化方法，包括：S1、将待测样品进行提取处理，获得含有目的蛋白的粗提取液；S2、采用含有铵盐的氯化铯溶液对含有目的蛋白的粗提取液进行密度梯度离心，收集蛋白层液体；S3、将所述蛋白层液体进行电泳，收集目的蛋白条带，所述待测样品为苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis的发酵液。利用本发明的方法可以获得的目的蛋白纯度高、收率高，操作简便、快捷，尤其适用于低蛋白含量样品。通过该方法获得的目的蛋白纯度高、收率高，操作简便、快捷，尤其适用于低蛋白含量样品。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白纯化领域，具体的，本发明涉及一种低含量Bt晶体蛋白的快速纯化方法。
背景技术
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)，是目前应用最广泛的一种微生物杀虫剂，它的主要杀虫成分是伴孢晶体，其中分子量为128KD和65KD的两种毒素蛋白是主要成分。这两种蛋白的含量决定了这种微生物杀虫剂的直接效果。
Bt类产品的质量检测与控制，目前最有效的方法是生物测定，但因生物测定受靶标昆虫质量、数量及外界条件等影响，检测误差高达40％。Bt类产品的毒素蛋白含量测定在我国国标与化工行业标准中均采用SDS-PAGE凝胶电泳方法，如HG 3617-1999的化工行业标准中报道的苏云金杆菌可湿性粉剂的毒素蛋白含量测定方法，用碱性溶液处理苏云金杆菌原粉伴孢晶体，使其降解为毒素蛋白，然后通过SDS-PAGE，依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其它杂蛋白分离，之后用薄层扫描仪或电泳图像扫描仪扫描蛋白区带面积进行定量。
然而利用Bt可湿性粉剂标准HG 3617-1999中毒素蛋白的检测方法来检测防治韭蛆的Bt中晶体蛋白含量，由于试样中65KD晶体蛋白含量较低，无法准确检测出防治韭蛆的Bt杀虫晶体蛋白，因此迫切需要建立一种受外界影响因素小、高效的低含量Bt晶体蛋白纯化方法，从而更好地对含有低含量Bt晶体蛋白类产品实现质量控制。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提供一种蛋白的纯化方法，通过该方法获得的目的蛋白纯度高、收率高，操作简便、快捷，尤其适用于低蛋白含量样品。
本发明第一方面提供一种目的蛋白的纯化方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
S1、将待测样品进行提取处理，获得含有目的蛋白的粗提取液；
S2、采用含有铵盐的氯化铯溶液对含有目的蛋白的粗提取液进行密度梯度离心，收集蛋白层液体；
S3、将所述蛋白层液体进行电泳，收集目标的蛋白条带，
其中，所述待测样品为苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis的发酵液。根据本发明实施例的方法，通过氯化铯密度梯度离心，使目的蛋白分离至特定的密度层中，收集该密度层中的蛋白液进行电泳，即可实现分离目的蛋白的效果。但是，对于低目的蛋白含量的待测样品，密度层中蛋白液中的蛋白的含量偏低，进行电泳后条带较浅甚至无法分辨出条带，低于了蛋白凝胶的最低检测限，无法定性和定量检测目的蛋白。为此，发明人经过深入研究发现，通过向氯化铯溶液中添加铵盐，在密度梯度离心过程中，可以将蛋白沉淀，以便将目的蛋白浓缩，使得密度层中的蛋白液浓度提高。经电泳后出现的条带较清晰，可以实现目的蛋白的有效分离。由此，根据本发明实施例的方法获得的目的蛋白纯度高、收率高，操作简便、快捷，本发明提供的方法尤其适用于低目的蛋白含量样品。
苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis是应用广泛的微生物杀虫剂，其主要杀虫成分是伴孢晶体，伴孢晶体的主要成分是毒素蛋白，毒素蛋白含量决定了微生物杀虫剂的直接效果。因此，检测毒素蛋白的含量可实现Bt类产品的质量检测与控制。在本发明的一个实施例中，利用上述目的蛋白的纯化方法将苏云金芽胞杆菌中的毒素蛋白分离纯化，继而检测毒素蛋白的含量，从而实现Bt类产品的质量检测与控制。
根据本发明实施例的目的蛋白的纯化方法，还可以具有以下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述苏云金芽胞杆菌为防治韭蛆的苏云金芽胞杆菌，优选地，所述防治韭蛆的苏云金芽胞杆菌为苏云金芽胞杆菌JQ23(保藏号CGMCC NO.9375)。
防治韭蛆的苏云金芽胞杆菌中Bt晶体蛋白的含量较低，通过常规的蛋白凝胶电泳方法无法检测出，而利用本发明的目的蛋白纯化方法，能够实现Bt晶体蛋白的分离纯化，利用该方法能够高效快速的纯化待测样品中低含量目的蛋白。
当然，本发明中目的蛋白的纯化方法适用于所有的苏云金芽胞杆菌，该方法不仅适用检测毒素蛋白，苏云金芽胞杆菌中含有的其他的目的蛋白检测也同样适用。
根据本发明的实施例，所述氯化铯溶液中铵盐的质量浓度为15％～30％；
任选地，所述铵盐为硫酸铵和/或氯化铵。
铵盐中高浓度的盐离子在蛋白溶液中可破坏蛋白质表面的水化膜，降低蛋白质的溶解度，使蛋白从溶液中析出。若铵盐浓度过低，例如铵盐的质量浓度低于15％，会导致蛋白无法在氯化铯体系中纯化出来；若铵盐浓度过高，例如铵盐的质量浓度高于30％，会导致体系不稳定，目的蛋白可能被降解，实验结果中蛋白条带不清晰，导致纯化效果较差。
根据本发明优选的实施例，所述铵盐为硫酸铵。
虽然硫酸铵可以单独用于纯化蛋白，但由于纯化出的蛋白没有大小区分，就会造成蛋白聚集物，由于多种蛋白聚集在一起容易造成该物中某些低含量蛋白降解，所以不利于低含量蛋白的纯化。
根据本发明的实施例，进行密度梯度离心中采用的氯化铯溶液的密度为1～2g/cm3。
将氯化铯的密度控制在1～2g/cm3，尤其是1.34g/cm3时，形成的密度梯度可以使目的蛋白带位于密度中心区域，方便抽取目的蛋白带及观察，利用该方法能够更好的富集目的蛋白。
根据本发明的实施例，所述提取处理包括：
将所述发酵液进行搅拌及静置处理，除去芽孢；
将除去芽孢的发酵液进行过滤处理，收集滤液；
将所述滤液进行超滤浓缩处理，收集截留物，并将所述截留物溶解，得到所述含有目的蛋白的粗提取液。
通过上述提取处理，将目的蛋白与芽孢有效分离，利于蛋白的提取和纯化。
根据本发明的实施例，所述静置处理的时间为1～4min。
将所述待测样品中蛋白与杂质进行分离后，静置时间的选择会影响后续纯化效果，若静置时间过长，由于芽孢跟蛋白没有充分分离，导致蛋白被污染，从而导致最终检测结果中目的蛋白条带不清晰，显现杂蛋白带，影响检测结果。
根据本发明的实施例，离心转速为1000～6000rpm，离心时间10～15min。
在进行蛋白的离心浓缩时，若转速过高，不利于目的蛋白的截留，无法获得蛋白，若离心转速过低，则截留蛋白过多，有可能导致目标低含量蛋白的降解，同时截留蛋白过多也会造成密度梯度离心时蛋白密度带靠的很近而无法使目的蛋白分离出来。对于超滤浓缩处理时的截留分子量可根据目的蛋白的大小进行调整。
本发明第二方面提供一种目的蛋白的检测方法，根据本发明的实施例，所述方法包括：
采用本发明第一方面所述的目的蛋白的纯化方法对待测样品进行蛋白纯化，获取目的蛋白；
对所述目的蛋白进行定性或定量检测。
利用本发明第一方面所述的目的蛋白的纯化方法对待测样品进行蛋白纯化，获取目的蛋白，不仅能够获知待测样品中是否含有目的蛋白，而且能够检测目的蛋白的含量。
本发明第三方面提供一种蛋白纯化试剂盒，根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：
含有铵盐的氯化铯溶液，其中，所述铵盐的质量浓度为15％～30％；所述氯化铯溶液的密度为1～2g/cm3。
利用该试剂盒能够检测微生物类产品(例如微生物制剂)中的目的蛋白，对目的蛋白进行定性和定量检测。可用于检测微生物类制剂中目的蛋白的含量，从而实现微生物类制剂中目的蛋白的质量控制。在本发明的一个具体的实施例中，本发明提供的蛋白纯化试剂盒可用于检测Bt类产品中伴孢晶体中蛋白的含量，通过检测65KD的蛋白的含量以实现对Bt类产品的质量检测与控制。
本发明第四方面提供本发明第一方面所述的目的蛋白的纯化方法或本发明第二方面所述的目的蛋白的检测方法或本发明第三方面所述的蛋白纯化试剂盒在对微生物杀虫剂进行质控中的应用。
根据本发明的实施例，所述微生物制剂的剂型为可湿性粉剂、可溶性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、水乳剂、微乳剂、粉剂、粒剂、泡腾片剂、可分散片剂、微胶囊剂、种衣剂。
本发明的发明人创造性的发现，利用含有铵盐的氯化铯溶液对含有目的蛋白的粗提取液进行密度梯度离心，分离目的蛋白，能够使目的蛋白富集和析出，以利于后续对蛋白含量的测定。本发明中方法也适用于检测低含量目的蛋白的样品，例如，通过本发明的方法能够检测Bt类产品中防治韭蛆的Bt杀虫晶体蛋白65KD的毒素蛋白，通过检测65KD晶体蛋白条带，以实现含有低含量Bt晶体蛋白类产品的质量控制。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了实施例1～3以及对比例1～4中不同质量浓度硫酸铵加入氯化铯体系下得到的晶体蛋白的电泳图，其中，泳道1为未加硫酸铵，泳道2-7分别加入质量浓度为14％、15％、20％、30％、31％、60％的硫酸铵；
图2显示了对比例1、实施例4、实施例5以及对比例5中不同质量浓度氯化铵加入氯化铯体系下得到的晶体蛋白的电泳图，其中，泳道1为对比例1的另一重复试验结果，泳道2-4分别加入质量浓度为15％、30％、60％的氯化铵；
图3显示了实施例1、对比例6、对比例7中对苏云金芽胞杆菌晶孢初步分离时不同静置时间下得到晶体蛋白的电泳图，其中，泳道1为静置4min(实施例1的另一重复实验结果)，泳道2为静置5min，泳道3为静置11min；
图4显示了实施例1和对比例8中对苏云金芽胞杆菌进行超滤浓缩，在不同转速下得到的晶体蛋白的电泳图，其中，泳道1为6000rpm，泳道2为7000rpm。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
苏云金芽胞杆菌是一种应用广泛的微生物杀虫剂，其杀虫成分是伴孢晶体，其中分子量为128KD和65KD的两种毒素蛋白是主要成分。这两种蛋白的含量决定了这种微生物杀虫剂的直接效果。对Bt类产品进行质量检测与控制时，晶体蛋白的含量测定尤为重要。防治韭蛆的Bt中65KD的毒素蛋白是起主要杀虫作用的蛋白，因此，通过检测防治韭蛆的Bt类产品中65KD的毒素蛋白的含量，能够实现该类产品的质控。参照Bt可湿性粉剂标准HG3617-1999中毒素蛋白的检测方法来检测防治韭蛆的Bt中晶体蛋白含量，发现多批次的试样均无法检测到65KD晶体蛋白条带，说明用现有的Bt毒素蛋白的检测方法无法准确检测出防治韭蛆的Bt杀虫晶体蛋白。
为此，本发明提供一种晶体蛋白的纯化方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
1)对待测样品进行培养，将培养成熟的防治韭蛆的Bt发酵液用磁力搅拌器搅拌，200rpm搅拌30～60min，芽孢的密度较小，大部分进入泡沫，而蛋白晶体处于水层。静置1～4min，然后利用移液器除去泡沫，使芽孢和晶体得到初步分离；
2)将初步除去芽孢的发酵液通过0.45微米微孔滤膜过滤，实现菌体芽孢与蛋白的分离，收取得到的蛋白滤液，使用截留分子量为50kD的超滤浓缩管，利用施用于50ml离心管的离心机，使用转速1000-6000rpm，离心10～15min，离心后将截留物通过pH＝7.2磷酸盐缓冲液洗下后，将其迅速放置在冰上，防止晶体蛋白降解；
3)利用改进后的氯化铯密度梯度离心法进一步纯化蛋白质，配制密度为1.34g/cm3的氯化铯溶液，并在其中加入质量浓度15％～30％的硫酸铵或氯化铵，然后将其中1份用PBS定容至13.5mL，另外1份加入已超滤浓缩的含有晶体蛋白的截留液3.5mL，PBS定容至13.5mL，加至超离管中，热封，4℃，35000rpm离心24h；暗室抽取蛋白条带第一层；
4)配制SDS-PAGE，加入刚才抽取的第一层样品溶液，进行凝胶电泳检测。
根据电泳结果，获知待测样品中是否含有65KD晶体蛋白，以及晶体蛋白的含量，从而实现对防治韭蛆的Bt类产品的质量控制。
本发明实施例中使用的防治韭蛆的Bt类产品源自河北农科院，其中含有的苏云金芽孢杆菌为JQ23(保藏号CGMCC NO.9375)。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
1)对待测样品进行培养，将培养成熟的Bt发酵液用磁力搅拌器搅拌，200rpm搅拌50min，芽孢的密度较小，大部分进入泡沫，而蛋白晶体处于水层。静置4min，然后利用移液器除去泡沫，使芽孢和晶体得到初步分离；
2)将初步除去芽孢的发酵液通过0.45微米微孔滤膜过滤，实现菌体芽孢与蛋白的分离，收取得到的蛋白滤液，使用截留分子量为50kD的超滤浓缩管，利用适用于50ml离心管的离心机，使用转速6000rpm，离心10min，离心后将截留物通过pH＝7.2磷酸盐缓冲液洗下后，将其迅速放置在冰上，防止晶体蛋白降解；
3)利用改进后的氯化铯密度梯度离心法进一步纯化蛋白质，配制密度为1.34g/cm3的氯化铯溶液，并在其中加入质量浓度15％的硫酸铵，然后将其中1份用PBS定容至13.5mL，另外1份加入已超滤浓缩的含有晶体蛋白的截留液3.5mL，PBS定容至13.5mL，加至超离管中，热封，4℃，35000rpm离心24h；暗室抽取蛋白条带第一层；
4)配制SDS-PAGE，加入刚才抽取的第一层样品溶液，进行凝胶电泳检测。
电泳结果见附图1中泳道3，观察到目的蛋白具有清晰的条带，表明Bt发酵液中含有65KD的伴孢晶体蛋白。
实施例2
与实施例1中方法区别仅在于加入氯化铯溶液中的硫酸铵的质量浓度为20％。电泳结果见附图1中泳道4，观察到目的蛋白具有清晰的条带，表明Bt发酵液中含有65KD的伴孢晶体蛋白。
实施例3
与实施例1中方法区别仅在于加入氯化铯溶液中的硫酸铵的质量浓度为30％。电泳结果见附图1中泳道5，观察到目的蛋白具有清晰的条带，表明Bt发酵液中含有65KD的伴孢晶体蛋白。
对比例1
与实施例1中方法区别仅在于在氯化铯溶液中的未加入硫酸铵。电泳结果见附图1中泳道1，蛋白无法有效在氯化铯体系中纯化出来，未观察到目的条带。
对比例2
与实施例1中方法区别仅在于加入氯化铯溶液中的硫酸铵的质量浓度为14％。电泳结果见附图1中泳道2，蛋白无法有效在氯化铯体系中纯化出来，未观察到目的条带。
对比例3
与实施例1中方法区别仅在于加入氯化铯溶液中的硫酸铵的质量浓度为31％。电泳结果见附图1中泳道6，目的蛋白可能被降解，蛋白条带不清晰，纯化效果较差。
对比例4
与实施例1中方法区别仅在于加入氯化铯溶液中的硫酸铵的质量浓度为60％。电泳结果见附图1中泳道7，目的蛋白可能被降解，蛋白条带不清晰，纯化效果较差。
比较实施例1～3与对比例1～4可知，在氯化铯溶液中不加入硫酸铵，或者加入低于15％质量浓度的硫酸铵，会导致蛋白无法有效在氯化铯体系中纯化出来，但是如果硫酸铵浓度过高，高于30％，会导致体系不稳定，目的蛋白可能被降解，实验结果中蛋白条带不清晰，导致纯化效果较差。
实施例4
与实施例1中方法区别仅在于将加入氯化铯溶液中的质量浓度20％的硫酸铵替换为质量浓度15％的氯化铵。电泳结果见附图2中泳道2，观察到目的蛋白具有清晰的条带，表明Bt发酵液中含有65KD的伴孢晶体蛋白。
实施例5
与实施例1中方法区别仅在于将加入氯化铯溶液中的质量浓度20％的硫酸铵替换为质量浓度30％的氯化铵。电泳结果见附图2中泳道3，观察到目的蛋白具有清晰的条带，表明Bt发酵液中含有65KD的伴孢晶体蛋白。
对比例5
与实施例1中方法区别仅在于将加入氯化铯溶液中的质量浓度20％的硫酸铵替换为质量浓度60％的氯化铵。电泳结果见附图2中泳道4，目的蛋白可能被降解，蛋白条带不清晰，纯化效果较差。
比较实施例4、5与对比例5结果可知，氯化铯溶液中氯化铵的加入有利于提高目的蛋白的浓度，氯化铵浓度过高，高于30％，会导致体系不稳定，目的蛋白可能被降解，实验结果中蛋白条带不清晰，导致纯化效果较差。
对比例6
与实施例1中方法区别仅在于使芽孢和晶体初步分离的步骤中静置时间为5min。电泳结果见附图3中泳道2，目的蛋白条带不清晰，显现杂蛋白带，影响实验结果。
对比例7
与实施例1中方法区别仅在于使芽孢和晶体初步分离的步骤中静置时间为11min。电泳结果见附图3中泳道3，目的蛋白条带不清晰，显现杂蛋白带，影响实验结果。
比较实施例1与对比例6和7结果可知，将待测样品中蛋白与杂质进行分离后，静置时间的选择会影响后续纯化效果，若静置时间过长，由于芽孢跟蛋白没有充分分离，导致蛋白被污染，从而导致最终检测结果中目的蛋白条带不清晰，显现杂蛋白带，影响检测结果。
对比例8
与实施例1中方法区别仅在于超滤浓缩处理时离心转速为7000rpm。电泳结果见附图4中泳道2，未在电泳结果中看到条带。
比较实施例1和对比例8可知，超滤浓缩离心转速大于6000rpm时，由于转速太高将有效蛋白离心出去，并未在电泳结果中看到条带。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (7)
1.目的蛋白的纯化方法，其特征在于，包括：
S1、将待测样品进行提取处理，获得含有目的蛋白的粗提取液；
S2、采用含有铵盐的氯化铯溶液对含有目的蛋白的粗提取液进行密度梯度离心，收集蛋白层液体；
S3、将所述蛋白层液体进行电泳，收集目的蛋白条带，
其中，所述待测样品为防治韭蛆的苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis的发酵液，
所述提取处理包括：
将所述发酵液进行搅拌及静置处理，除去芽孢；
将除去芽孢的发酵液进行过滤处理，收集滤液；
将所述滤液进行超滤浓缩处理，收集截留物，并将所述截留物溶解，得到所述含有目的蛋白的粗提取液，
所述氯化铯溶液中铵盐的质量浓度为15%~30%，所述静置处理的时间为1~4 min，所述超滤浓缩处理时离心转速为1000~6000 rpm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述防治韭蛆的苏云金芽胞杆菌为保藏号CGMCC NO.9375的苏云金芽胞杆菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述铵盐为硫酸铵和/或氯化铵。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行密度梯度离心中采用的氯化铯溶液的密度为1~2 g/cm3。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超滤浓缩处理时离心时间10~15 min。
6.目的蛋白的检测方法，其特征在于，包括：
采用权利要求1~5中任一项所述的目的蛋白的纯化方法对待测样品进行蛋白纯化，获取目的蛋白；
对所述目的蛋白进行定性或定量检测。
7.权利要求1~5中任一项所述的目的蛋白的纯化方法或权利要求6所述的目的蛋白的检测方法在对微生物杀虫剂进行质控中的应用。
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