CN103436591B - 以盐类作为沉淀剂用于蛋白质结晶筛选的试剂盒 - Google Patents
以盐类作为沉淀剂用于蛋白质结晶筛选的试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103436591B CN103436591B CN201310390423.4A CN201310390423A CN103436591B CN 103436591 B CN103436591 B CN 103436591B CN 201310390423 A CN201310390423 A CN 201310390423A CN 103436591 B CN103436591 B CN 103436591B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- crystallization
- screening
- salt
- protein
- condition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 52
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 title claims abstract description 48
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 239000013078 crystal Substances 0.000 title abstract description 35
- 239000012716 precipitator Substances 0.000 title abstract 4
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims abstract description 69
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims abstract description 69
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims abstract description 13
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 20
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 12
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 27
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 14
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 12
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 9
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 108010064696 N,O-diacetylmuramidase Proteins 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 238000002447 crystallographic data Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000011549 crystallization solution Substances 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- INHCSSUBVCNVSK-UHFFFAOYSA-L lithium sulfate Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]S([O-])(=O)=O INHCSSUBVCNVSK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 230000005469 synchrotron radiation Effects 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 2
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 2
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 2
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 2
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- YKYOUMDCQGMQQO-UHFFFAOYSA-L cadmium dichloride Chemical compound Cl[Cd]Cl YKYOUMDCQGMQQO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M potassium bromide Chemical compound [K+].[Br-] IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 239000003764 sweet protein Substances 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VFXZKNGPBLVKPC-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;sodium Chemical compound [Na].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 VFXZKNGPBLVKPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DTDYFAZVXNSAGJ-UHFFFAOYSA-N ClC(O)C(O)CO.[Na] Chemical compound ClC(O)C(O)CO.[Na] DTDYFAZVXNSAGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 1
- OVBJJZOQPCKUOR-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt dihydrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[O-]C(=O)C[NH+](CC([O-])=O)CC[NH+](CC([O-])=O)CC([O-])=O OVBJJZOQPCKUOR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- ZPVCKTAYIYEIRZ-UHFFFAOYSA-K [Na+].[Cl-].[Ca++].CC([O-])=O.CC([O-])=O Chemical compound [Na+].[Cl-].[Ca++].CC([O-])=O.CC([O-])=O ZPVCKTAYIYEIRZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;zinc Chemical compound [Zn].CC(O)=O.CC(O)=O ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940098124 cesium chloride Drugs 0.000 description 1
- 229940069078 citric acid / sodium citrate Drugs 0.000 description 1
- GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L cobalt dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Co+2] GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007418 data mining Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- DZGCGKFAPXFTNM-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydron;chloride Chemical compound Cl.CCO DZGCGKFAPXFTNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- CNFDGXZLMLFIJV-UHFFFAOYSA-L manganese(II) chloride tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.[Cl-].[Cl-].[Mn+2] CNFDGXZLMLFIJV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000013001 matrix buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229940045641 monobasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940093916 potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L potassium sodium L-tartrate Chemical compound [Na+].[K+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229960004249 sodium acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M sodium formate Chemical compound [Na+].[O-]C=O HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PRWXGRGLHYDWPS-UHFFFAOYSA-L sodium malonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC([O-])=O PRWXGRGLHYDWPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 229940001516 sodium nitrate Drugs 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 235000011006 sodium potassium tartrate Nutrition 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003010 sodium sulfate Drugs 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000406 trisodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019801 trisodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004246 zinc acetate Substances 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229960001939 zinc chloride Drugs 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明提供了一种以盐类作为沉淀剂用于蛋白质结晶筛选的试剂盒，包括缓冲液、沉淀剂和添加剂，选择结晶效率较高的盐作为结晶试剂盒中的沉淀剂，同时加入一些添加剂分子以提高蛋白质的溶解性和稳定性来获得较高的筛选效率。本发明可以有效提高蛋白质结晶条件筛选的成功率。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于蛋白质结晶条件筛选的96条件盐类试剂盒。
背景技术
目前，对于蛋白质结晶条件的筛选，首要选择的盐类筛选试剂盒为HamptonResearch公司的SaltRx-HT（96条件）盐类筛选试剂盒，具体成分见表1。它包括两部分：盐与pH矩阵缓冲区。盐是唯一利用的主要结晶试剂(沉淀剂)，而结晶盐浓度、pH值的盐的不同选择则是基于数据挖掘生物大分子结晶数据库（BMCD）和其他结晶数据库、结晶的报道文学,以及Hampton结晶实验室的研究工作，在此大量工作的基础上分析得到：多达35%的蛋白质结晶试剂盒涉及以盐作为主要结晶试剂。盐主要包括钠盐、铵盐、镁盐、钾盐、酒石酸盐等，其浓度范围从0.4M到6M；缓冲液仅仅包括3种，浓度为0.1M，pH范围从4.6到8.5；添加剂则没有选择任何试剂成分。
表1：SaltRx-HT96条件成分表
使用SaltRx-HT的96条件试剂盒对以下20种蛋白质进行结晶条件筛选研究，分别为溶菌酶、蛋白酶K、过氧化氢酶、伴刀豆球蛋白、甜味蛋白、核糖核酸酶I-A、核糖核酸酶III-A、核糖核酸酶XII-A、纤维素酶、枯草杆菌蛋白酶A、α-乳白蛋白、葡萄糖磷酸酶、木瓜蛋白酶、α-糜蛋白酶原、α-糜蛋白酶、肌红蛋白、α-淀粉酶、细胞色素C、血红蛋白、胃蛋白酶，统计得出其长出晶体的成功率仅为25%（5/20），结果发现SaltRx-HT对于大部分蛋白质（15/20）的筛选结晶条件无效，因此本发明尝试从结晶筛选试剂这一角度出发，试图寻找更适合蛋白质结晶的试剂条件，而组合成为一种新的高效的蛋白质结晶条件筛选试剂盒则显得十分必要。
SaltRx-HT的96条件试剂盒对溶菌酶、蛋白酶K、伴刀豆球蛋白、过氧化氢酶等几种蛋白进行了结晶条件筛选研究，统计出其筛选的成功率分别为：41.67%、40.63%、36.46%、34.38%。
但是SaltRx-HT的局限在于所用沉淀剂的组合是自由选取的，其浓度配比范围相对较低，这对蛋白质结晶筛选的成功率还存在提高的空间；所选缓冲区间以及添加剂的试剂种类过少，不利于提高蛋白质的溶解性和稳定性。
发明内容
为了克服现有技术在蛋白质结晶条件筛选中成功率低的不足，本发明提供一种以盐类作为沉淀剂，而且使用更加高效、全面的蛋白质结晶筛选盐类试剂盒，可以有效提高蛋白质结晶条件筛选的成功率。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：包括缓冲液、沉淀剂和添加剂，具体组成如下表所示：
本发明的有益效果是：①本发明设计的96条件盐类筛选试剂盒包含种类繁多的各种筛选试剂，20多种盐类的沉淀剂组合不仅在结晶成功率上高于目前市场上最为流行的SaltRx-HT盐类筛选试剂盒，而且获得的蛋白质单晶尺寸较大，形貌较好，晶体质量高；②本发明结合其特色设计合适的酸碱环境并选择了7种缓冲能力较强的缓冲液，使得pH范围尽可能地广泛，从4.0至9.0，覆盖了大部分蛋白质可结晶的pH区间，从而提高了结晶的成功率，增加了结晶的可能性；③本发明试剂盒所选沉淀剂的浓度相对较高，浓度范围从0.5M至7M，所选沉淀剂的种类也多达28种，可以有助于提高结晶筛选效率；⑤本发明可以为提高蛋白质结晶筛选的成功率提供一种有效途径。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明，本发明包括但不仅限于下述实施例。
本发明设计了一种用于蛋白质结晶条件筛选的96条件盐类试剂盒，该试剂盒是选择结晶效率较高的盐作为结晶试剂盒中的沉淀剂，同时加入一些添加剂分子以提高蛋白质的溶解性和稳定性来获得筛选效率高的盐类结晶试剂盒。
首先设计出一套含有192结晶条件的一级粗筛盐类试剂盒，命名为Primary SaltScreen（简称PSS），其具体组成如表2。在PSS所得的效率基础上，根据其初筛的结晶结果，进一步通过调节沉淀剂浓度或加入添加剂分子来进行更深层的优化，从而得到结晶效率较高的96结晶条件的二级筛选盐类试剂盒Secondary Salt Screen（简称SSS），SSS是一种高效率的蛋白质结晶96条件盐类筛选试剂盒，它的具体组成如表3。
使用上述20种蛋白质进行结晶筛选实验，观察统计其筛选结果，并验证20种蛋白质的结晶成功率；同时，筛选得到的晶体可以在宏观上产生X-射线衍射现象，通过对晶体的收集、冷冻，可以得到晶体的衍射数据，例如得到几种蛋白晶体的衍射分辨率。
本发明包括三部分：缓冲液、沉淀剂和添加剂。
所述的沉淀剂是硫酸铵、硫酸镁、氯化钠、醋酸钙、结晶醋酸钠、甲酸钠、柠檬酸钠、氯化锰、氯化钙、磷酸钾、乙酸锌、氯化镉、磷酸钠、硫酸锂、氯化钴、醋酸铵、氯化锌、硫酸锌、氯化钾、氯化铯、硫酸钠、乙酸镁、硝酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、柠檬酸铵、磷酸铵或磷酸二氢钾任一种。其浓度范围为0.5M～7M。
所述的缓冲液是柠檬酸/柠檬酸钠、哌嗪-1,4-二乙磺酸、咪唑、N,N-二羟乙基甘氨酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸、双(2-羟基乙胺基)三(羟甲基)甲烷-盐酸盐或三羟甲基氨基甲烷中任一种。以上7种缓冲液体系所选的浓度均为0.1M，pH值的缓冲范围从4.0至9.0。
所述的添加剂通常使用的浓度较低，为了防止过多的添加剂影响盐类结晶剂的溶解，其选择的浓度范围为0.05M～0.3M、10%v/v～15%v/v。所选择的添加剂有：氯化钠、甘油、L-丙氨酸、溴化钾、乙腈、焦磷酸钠、酒石酸钾钠、L-精氨酸、硫酸锂、丙二酸钠、甘氨酸、乙二胺四乙酸二钠、硫酸铵、蔗糖等。
表2：Primary Salt Screen（简称PSS）192条件成分表
本发明为一种高效率的蛋白质结晶96条件盐类筛选试剂盒(Secondary SaltScreen)，其具体组成如下：
表3：Secondary Salt Screen（简称SSS）96条件成分表
配制Secondary Salt Screen盐类试剂盒的筛选条件：以配制25mL的条件A4(0.1M柠檬酸钠，pH4.5，1.5M硫酸铵，0.2M氯化钠和0.2M L-丙氨酸)为例。第一步：配制浓度为1M，pH为4.5的柠檬酸钠缓冲液储液；第二步：称取盐类沉淀剂浓度为1.5M的硫酸铵固体；第三步：称取添加剂浓度均为0.2M的氯化钠、丙氨酸试剂；第四步：用移液枪吸取柠檬酸钠缓冲液储液2.5mL，并将称取好的1.5M硫酸铵固体、0.2M氯化钠以及0.2M丙氨酸试剂共同加至50ml烧杯中搅拌混匀，加入三蒸水定容至25mL之后再用0.22μm的无菌滤膜过滤到高压灭菌的50ml试管中，A4条件则配制完毕。以同样的方法配制试剂盒96条件。
下面用几种蛋白质的结晶实验来验证该试剂盒的效果，以Hampton Research公司的SaltRx-HT（96条件）盐类筛选试剂盒作为对照组。
实施例1：用配制的Secondary Salt Screen条件对溶菌酶（HEWL）进行条件筛选。具体配方见表3。
第一步：将购自日本Seikagaku公司的六次重结晶溶菌酶（HEWL,lysozyme,lys,No.100940），溶于pH为4.6，浓度为0.1M的醋酸钠缓冲液中，配制成浓度为20mg/mL的溶菌酶溶液，用0.22μm的无菌滤膜过滤除去杂质。即为溶菌酶蛋白溶液。
第二步：本实施例使用配制的Secondary Salt Screen96条件对溶菌酶进行结晶条件筛选。
第三步：结晶实验使用坐滴板，向每个深孔中加入90μL的池液，使用自动移液系统将1μL的筛选结晶剂和1μL的溶菌酶蛋白溶液混合为结晶液滴，滴在小坐滴孔中，并密封结晶板。
第四步：将上述结晶溶液体系放置在20℃温控箱中，结晶时间为5天，利用自动显微拍照系统进行观察并统计其出现溶菌酶晶体的条件数目与晶体形貌。
第五步：收集并冻存蛋白质晶体，利用上海同步辐射光源进行晶体的X-射线衍射分析，并收集分析衍射数据。
经过观察与统计，得到结果如下：通过X-射线衍射实验验证了上述晶体为溶菌酶蛋白晶体，其宏观上可以产生X-射线衍射现象，衍射的分辨率为其中溶菌酶的结晶条件数目为90，与SaltRx-HT（96条件）筛选试剂盒对照组（结晶数为40）相比，Secondary Salt Screen盐类筛选试剂盒的成功率有大幅度提高，结晶条件成功率为93.75%。
实施例2：用配制的Secondary Salt Screen条件对蛋白酶K（proteinase K）进行条件筛选。具体配方见表3。
第一步：将购自Sigma-Aldrich公司的蛋白酶K（pK,No.P6556），溶于pH为6.5，浓度为0.5M的柠檬酸钠缓冲液中，配制成浓度为15mg/mL的蛋白酶K溶液，用0.22μm的无菌滤膜过滤除去杂质。即为蛋白酶K蛋白溶液。
第二步：本实施例使用配制的Secondary Salt Screen96条件对蛋白酶K进行结晶条件筛选。
第三步：结晶实验使用坐滴板，向每个深孔中加入90μL的池液，使用自动移液系统将2μL的筛选结晶剂和2μL的蛋白酶K蛋白溶液混合为结晶液滴，滴在小坐滴孔中，并密封结晶板。
第四步：将上述结晶溶液体系放置在20℃温控箱中，结晶时间为6天，利用自动显微拍照系统进行观察并统计其出现蛋白酶K晶体的条件数目与晶体尺寸、形貌。
第五步：收集并冻存蛋白质晶体，利用上海同步辐射光源进行晶体的X-射线衍射分析，并收集分析衍射数据。
经过观察与统计，得到结果如下：通过X-射线衍射实验验证了上述晶体为蛋白酶K晶体，其宏观上可以产生X-射线衍射现象，衍射的分辨率为其中蛋白酶K的结晶条件数目为86，与SaltRx-HT（96条件）筛选试剂盒对照组（结晶数为39）相比，Secondary Salt Screen盐类筛选试剂盒的成功率有明显的提高，结晶条件成功率为89.58%。
实施例3：用配制的Secondary Salt Screen条件对伴刀豆球蛋白进行条件筛选。具体配方见表3。
第一步：将购自Sigma-Aldrich公司的伴刀豆球蛋白（con,No.L7647），溶于pH为7.5，浓度为0.1M的N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸钠缓冲液中，配制成浓度为10mg/mL的伴刀豆球蛋白溶液，用0.22μm的无菌滤膜过滤除去杂质。即为伴刀豆球蛋白溶液。
第二步：本实施例使用配制的Secondary Salt Screen96条件对伴刀豆球蛋白进行结晶条件筛选。
第三步：结晶实验使用坐滴板，向每个深孔中加入90μL的池液，使用自动移液系统将1.5μL的筛选结晶剂和1.5μL的伴刀豆球蛋白溶液混合为结晶液滴，滴在小坐滴孔中，并密封结晶板。
第四步：将上述结晶溶液体系放置在20℃温控箱中，结晶时间为5天，利用自动显微拍照系统进行观察并统计其出现伴刀豆球蛋白晶体的条件数目与晶体形貌。
第五步：收集并冻存蛋白质晶体，利用上海同步辐射光源进行晶体的X-射线衍射分析，并收集分析衍射数据。
经过观察与统计，得到结果如下：通过X-射线衍射实验验证了上述晶体为伴刀豆球蛋白晶体，其宏观上可以产生X-射线衍射现象，X射线衍射的分辨率为其中伴刀豆球蛋白的结晶条件数目为80，与SaltRx-HT（96条件）筛选试剂盒对照组（结晶数为35）相比，Secondary Salt Screen盐类筛选试剂盒的成功率有大幅度提高，结晶条件成功率为83.33%。
实施例4：用配制的Secondary Salt Screen条件对过氧化氢酶进行条件筛选。具体配方见表3。
第一步：将购自Sigma-Aldrich公司的过氧化氢酶（cata,No.C40），溶于pH为4.7，浓度为0.1M的哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液中，配制成浓度为20mg/mL的过氧化氢酶溶液，用0.22μm的无菌滤膜过滤除去杂质。即为过氧化氢酶蛋白溶液。
第二步：本实施例使用配制的Secondary Salt Screen96条件对过氧化氢酶进行结晶条件筛选。
第三步：结晶实验使用坐滴板，向每个深孔中加入90μL的池液，使用自动移液系统将2μL的筛选结晶剂和2μL的过氧化氢酶蛋白溶液混合为结晶液滴，滴在小坐滴孔中，并密封结晶板。
第四步：将上述结晶溶液体系放置在20℃温控箱中，结晶时间为5天，利用自动显微拍照系统进行观察并统计其出现过氧化氢酶晶体的条件数目与晶体形貌、尺寸。
第五步：收集并冻存蛋白质晶体，利用上海同步辐射光源进行晶体的X-射线衍射分析，并收集分析衍射数据。
经过观察与统计，得到结果如下：通过X-射线衍射实验验证了上述晶体为过氧化氢酶蛋白晶体，其宏观上可以产生X-射线衍射现象，衍射的分辨率为其中过氧化氢酶的结晶条件数目为73，与SaltRx-HT（96条件）筛选试剂盒对照组（结晶数为33）相比，Secondary Salt Screen盐类筛选试剂盒的成功率有大幅度提高，结晶条件成功率为76.04%。
除上述的实施例外，本发明方法用于16种其它蛋白结晶条件的筛选，分别为甜味蛋白、核糖核酸酶I-A、核糖核酸酶III-A、核糖核酸酶XII-A、纤维素酶、枯草杆菌蛋白酶A、α-乳白蛋白、葡萄糖磷酸酶、木瓜蛋白酶、α-糜蛋白酶原、α-糜蛋白酶、肌红蛋白、α-淀粉酶、细胞色素C、血红蛋白、胃蛋白酶，得到的蛋白质结晶筛选成功率为85%（17/20）。与SaltRx-HT相比，本发明方法的结晶筛选成功率显著提高了240%。因此，本发明设计的这种高效的新的蛋白质结晶条件筛选试剂盒是能够提高蛋白质结晶筛选成功率的有效方法。
Claims (1)
1.一种以盐类作为沉淀剂用于蛋白质结晶筛选的试剂盒，其特征在于：包括缓冲液、沉淀剂和添加剂，具体组成如下表所示：
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310390423.4A CN103436591B (zh) | 2013-08-30 | 2013-08-30 | 以盐类作为沉淀剂用于蛋白质结晶筛选的试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310390423.4A CN103436591B (zh) | 2013-08-30 | 2013-08-30 | 以盐类作为沉淀剂用于蛋白质结晶筛选的试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103436591A CN103436591A (zh) | 2013-12-11 |
| CN103436591B true CN103436591B (zh) | 2015-06-10 |
Family
ID=49690305
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310390423.4A Expired - Fee Related CN103436591B (zh) | 2013-08-30 | 2013-08-30 | 以盐类作为沉淀剂用于蛋白质结晶筛选的试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103436591B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020048412A1 (zh) | 2018-09-03 | 2020-03-12 | 浙江善测禾骑士生物科技有限公司 | Lpor蛋白纯化和结晶的方法以及用途 |
| CN109207444A (zh) * | 2018-09-03 | 2019-01-15 | 浙江善测禾骑士生物科技有限公司 | 一种lpor-6803蛋白的制备方法及其晶体结构分析方法 |
| CN112175051B (zh) * | 2020-09-03 | 2022-05-20 | 武汉科诺生物科技股份有限公司 | 低含量Bt晶体蛋白的快速纯化方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102060907A (zh) * | 2010-11-04 | 2011-05-18 | 西北工业大学 | 蛋白质结晶筛选的96条件试剂盒 |
| CN102517379A (zh) * | 2011-12-05 | 2012-06-27 | 西北工业大学 | 一种96条件蛋白质结晶筛选试剂盒配方 |
-
2013
- 2013-08-30 CN CN201310390423.4A patent/CN103436591B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102060907A (zh) * | 2010-11-04 | 2011-05-18 | 西北工业大学 | 蛋白质结晶筛选的96条件试剂盒 |
| CN102517379A (zh) * | 2011-12-05 | 2012-06-27 | 西北工业大学 | 一种96条件蛋白质结晶筛选试剂盒配方 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 筛选蛋白质结晶条件的试剂盒研发进展;张仙芳等;《生物化学与生物物理进展》;20111231;第38卷(第3期);280-287页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103436591A (zh) | 2013-12-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101863907B (zh) | 一种头孢哌酮钠的结晶方法 | |
| CN103436591B (zh) | 以盐类作为沉淀剂用于蛋白质结晶筛选的试剂盒 | |
| CN103275101B (zh) | 制备头孢噻肟钠晶体的方法 | |
| CN101817869B (zh) | 以聚乙二醇作为沉淀剂用于蛋白质结晶筛选96条件试剂盒 | |
| Hough et al. | The crystal structure of ferrimycobactin P, a growth factor for the mycobacteria | |
| CN103333219A (zh) | 一种选择缓冲液用于蛋白质结晶的方法 | |
| CN101092445A (zh) | 用离子液体结晶蛋白质的方法 | |
| CN101229129A (zh) | 一种头孢替唑钠粉针及其合成方法 | |
| CN102517379B (zh) | 一种96条件蛋白质结晶筛选试剂盒配方 | |
| Schiefner et al. | Proline/alanine-rich sequence (PAS) polypeptides as an alternative to PEG precipitants for protein crystallization | |
| CN104071763B (zh) | 多离子型类骨磷灰石的制备方法及多离子型类骨磷灰石 | |
| RU2014150071A (ru) | Способы кристаллизации для очистки моноклональных антител | |
| CN102060907B (zh) | 蛋白质结晶筛选的96条件试剂盒 | |
| CN103613434B (zh) | 一种农业级脂肽钾肥的制备工艺 | |
| CN115010542B (zh) | 一种清液型水溶肥及其制备方法 | |
| CN1724653A (zh) | 一种烟草原生质体高效快捷培养方法 | |
| US4504583A (en) | Process for crystallizing egg white lysozyme | |
| CN112209426B (zh) | 碱式氯化锌及其制备方法 | |
| CN104261372A (zh) | 一种制备磷酸铵副产桑树专用肥的生产方法 | |
| US2881162A (en) | Recovery process | |
| CN111204792B (zh) | 一种利用尿素调控五水硫酸铜晶体生长形貌的方法 | |
| CN109480095B (zh) | 一种疏松不结块的饲料添加剂甘氨酸锌的制备方法 | |
| CN105254706A (zh) | 一种利用超疏水表面结晶蛋白质的方法 | |
| CN111961102A (zh) | 5′-尿苷单磷酸晶体及其制备方法 | |
| CN104829502B (zh) | 一种生物缓冲剂的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20171225 Address after: 518000 Guangdong Province, Shenzhen New District of Longhua City, Dalang street, Longsheng Gold Dragon Road community e-commerce incubator exhibition Tao Commercial Plaza E block 706 Patentee after: Shenzhen Meliao Technology Transfer Center Co.,Ltd. Address before: 710072 Xi'an friendship West Road, Shaanxi, No. 127 Patentee before: Northwestern Polytechnical University |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20171227 Address after: 401220 No. 3 group 27, ferry boat street, longevity district, Chongqing Patentee after: Wu Xiaoze Address before: 518000 Guangdong Province, Shenzhen New District of Longhua City, Dalang street, Longsheng Gold Dragon Road community e-commerce incubator exhibition Tao Commercial Plaza E block 706 Patentee before: Shenzhen Meliao Technology Transfer Center Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20180129 Address after: 528400 No. 16, biological Valley Road, Torch Development Zone, Guangdong, Zhongshan Patentee after: ZHONGSHAN SINOBIOWAY HYGENE BIOMEDICINE CO.,LTD. Address before: 401220 No. 3 group 27, ferry boat street, longevity district, Chongqing Patentee before: Wu Xiaoze |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150610 Termination date: 20210830 |