CN112174869B - N-苯乙酰基-2-羟甲基吡咯烷-2-甲酰胺的制备方法及其药用用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类N‑苯乙酰基‑2‑羟甲基吡咯烷‑2‑甲酰胺，如通式(I)所示，这类化合物的制备方法，这类化合物及含这类化合物的药物组合物在抑制神经小胶质细胞炎症方面的新应用。
Figure DDA0002720480920000011
其中，R1/R2＝H,F,CF3,OCF3。

Description

N-苯乙酰基-2-羟甲基吡咯烷-2-甲酰胺的制备方法及其药用用途
技术领域
本发明属于药物领域，具体涉及N-苯乙酰基-2-羟甲基吡咯烷-2-甲酰胺的制备方法及其在抑制神经小胶质细胞炎症方面的新应用。
背景技术
神经小胶质细胞是存在于脑部和脊髓内用于保护中枢神经系统免受侵袭的一类免疫细胞。在神经退行性疾病、脑卒中和脑部外伤等病症中，神经小胶质细胞快速被激活为活化状态，并被趋化至损伤部位通过吞噬作用清除脑内特有物质如鞘磷脂水平和异常聚集蛋白[1]。神经小胶质细胞的活化对脑部组织具有保护作用，但其长期或过度炎症反应会导致脑部组织永久性损伤[2]。目前的研究认为神经小胶质细胞活化导致的神经炎症与阿尔茨海默病以及帕金森病密切相关[3]
肿瘤坏死因子α(TNF-α)与白细胞介素6(IL-6)是神经炎症反应中最主要的促炎症细胞因子[4]。TNF-α能够选择性杀伤肿瘤细胞，具有肿瘤细胞毒性；同时TNF-α对于细胞信号传递、感染与创伤后炎症反应过程中有着重要作用。TNF-α能够诱导脂质过氧化物与氧自由基的产生，并促进花生四烯酸代谢物的释放，导致细胞膜严重损伤[5]。IL-6是关键的炎症因子，同时还能够增加淀粉样蛋白前体蛋白基因(APP)生成，促进β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)沉积，激活补体系统损伤神经细胞[6]。
神经炎症在神经退行性疾病(阿尔茨海默病，帕金森病等)的发生、发展过程中有着重要作用，因此，抑制炎症因子的生成与释放，缓解神经炎症已经成为神经退行性疾病治疗的重要途径[5]。
参考文献
[1]操胜男,鲍秀琦,孙华等.小胶质细胞的吞噬功能在神经退行性疾病中的作用[J].中国医学科学院学报, 2016,38(2):228-233.
[2]Glass CK；Saijo K；Winner B；et al.Mechanisms underlying inflammationin neurodegeneration[J].Cell,2010, 140:918-934.
[3]Maccioni RB,Andrea Gonzalez,Victor Andrade,et al.Alzheimer′sDisease in the Perspective of Neuroimmunology[J].The Open Neurology Journal,2018,12(1):50-56.
[4]Tuppo EE；Arias HR.The role of inflammation in Alzheimer’s disease[J].Int J Biochem Cell Biol,2005,37: 289-305.
[5]肖淑萍.IL-6与Alzheimer病研究进展[J].脑与神经疾病杂志,2003,(06):380-381.
[6]刘洪翠,郑敏化,韩骅等.小胶质细胞在帕金森病病理进展中的作用[J].现代生物医学进展,2011,(11): 2194-2196.
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供了一类新型NMDA受体调节剂N-苯乙酰基-2-羟甲基吡咯烷-2- 甲酰胺、其制备方法。
本发明所要解决的另一个技术问题在于提供了一种药物组合物，其中包括作为活性成分的通式I的化合物和药学上可接受的载体。
本发明所要解决的再一个技术问题在于提供上述N-苯乙酰基-2-羟甲基吡咯烷-2-甲酰胺及其组合物在抑制神经小胶质细胞炎症方面的新应用。
本发明所述的N-苯乙酰基-α-羟甲基脯氨酰胺结构通式可用通式I表示
Figure BDA0002720480910000021
其中，R1/R2为H,F,CF3,OCF3
上述化合物可用但不限于如下的方法制备，其中R的定义与前述相同
本发明所述化合物的制备方法如下所示，其中R的定义与前述相同
Figure BDA0002720480910000022
步骤a：起始原料1为L-脯氨酸，与水合三氯乙醛回流反应得噁唑烷酮(中间体2)，反应所用的溶剂为：乙腈、二氯甲烷、四氢呋喃、DMF、DMSO，脱水剂：4A分子筛，反应温度：65℃～90℃，反应时间为1h～24h。
步骤b：先将二异丙基胺与正丁基锂己烷溶液反应制备LDA，再将中间体2(噁唑烷酮)与其反应，再加入氯甲基苄基醚与之反应得α-位苄氧基甲基取代的噁唑烷酮(中间体3)。反应溶剂为：无水二氯甲烷、无水四氢呋喃，反应温度为-40℃～-78℃，反应时间为0.5-10h，反应保护气体：氮气及惰性气体。
步骤c：中间体3与醇钠反应后，再加入乙酰氯反应制得中间体4。碱性醇钠试剂包括如下组合：1. 无水甲醇、金属钠；2.无水乙醇、金属钠，反应溶剂：无水甲醇，反应温度：40℃～80℃，反应时间为1-6h。
步骤d：中间体4(氨基酸甲酯盐酸盐)与4-含氟取代的苯乙酰氯在碱性条件下反应生成中间体5，所用的碱为三乙胺、二乙胺、DIEA，所用溶剂为无水二氯甲烷、无水四氢呋喃、无水二氧六环，缩合剂为 DCC、EDC、DMAP、HATU、HOBT，反应温度为0℃～60℃，反应时间为1h～24h。
其中酰氯的制备：4-含氟基取代的苯乙酸与草酰氯在碱性条件下反应生成相应的酰氯，碱性催化剂为 DMF、DIEA，反应温度为：0℃～-10℃，反应时间为1h～6h，现配现用。
步骤e：中间体5在碱性条件下酯水解成中间体6。所用碱为氢氧化钠、氢氧化钾，所用溶剂为甲醇: 水＝1:1、乙醇:水＝1:1，反应温度为60℃～80℃，反应时间为1h～3h。
步骤f：中间体6与氯化铵在缩合剂催化下形成酰胺类化合物7。所用的缩合剂为：HOBt、HATU、 EDCI、DCC、DMAP，反应溶剂为：二氯甲烷、四氢呋喃，反应温度为0℃～25℃，反应时间为12h～16h。
步骤g：中间体酰胺化合物7在钯碳催化下，氢化脱除苄基得目标化合物I。所用的催化剂为：10％钯碳，反应溶剂为：甲醇、乙醇，反应温度为：20℃～30℃，反应时间为8h～12h。
本发明所述的新型NMDA受体调节剂N-苯乙酰基-2-羟甲基吡咯烷-2-甲酰胺具有抑制神经小胶质细胞炎症活性。体外抗炎实验表明，该类化合物能够抑制脂多糖(LPS)诱导的小鼠小胶质细胞株BV-2细胞炎症因子TNF-α、IL-6的释放。
本发明可用于制备具有抗神经小胶质细胞炎症作用的药物或药物组合。
具体实施方式
下面的实施例用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。
实施例1制备噁唑烷酮
于250mL单口烧瓶中加入5.0g L-脯氨酸与7.9g水合三氯乙醛(1.1eq)，15.6g 4A分子筛(2eq，吸水量按20％重量计)溶于80ml MeCN中，滴加到反应体系中，滴加完毕后于85℃回流3小时，TLC检测反应完全，过滤并蒸干溶剂，用石油醚:乙酸乙酯＝3:1(含1.5％三乙胺)的混合洗脱剂柱层析分离纯化，得到7.3g白色固体，收率69％。
实施例2制备α-苄氧甲基噁唑烷酮
于250ml单口烧瓶中加入5.0ml二异丙基胺(1.2eq)和50ml无水THF，将烧瓶放入低温反应器冷却至-78℃，氮气保护下，滴加22.4ml 1.6M正丁基锂己烷溶液(1.2eq)，反应0.5小时制备LDA。
将7.3g噁唑烷酮(2)溶于30ml无水THF，并滴加入上述LDA反应瓶中，搅拌0.5小时，滴入6.2ml 氯甲基苄基醚(1.5eq)，升温至-40℃，继续搅拌8小时，反应全程需氮气保护。TLC检测反应完成后，加水淬灭反应，DCM萃取并蒸干，用石油醚:乙酸乙酯＝30:1的洗脱剂(含1.0％三乙胺)柱层析纯化，得到 4.3g黄色液体，收率39.3％。
实施例3制备α-苄氧甲基脯氨酸甲酯盐酸盐
于100ml单口烧瓶中加入850mgα-苄氧甲基噁唑烷酮(3)和30ml无水甲醇，搅拌片刻，再加入50mg 金属钠(1eq)，室温搅拌过夜。冰浴下滴入3.3ml乙酰氯(20eq)，65℃回流3小时，过滤并蒸干溶剂，得到黄色固体盐酸盐，收率95.3％。
实施例4 N-(4-氟-苯乙酰基)-2-苄氧甲基脯氨酸甲酯的合成
酰氯的制备：于100ml单口烧瓶中加入4-氟苯乙酸473mg和25ml DCM，搅拌片刻后，于冰浴下加入 (2eq)0.513ml草酰氯，滴入两滴DMF作为催化剂，反应非常剧烈，释放大量气体，冰浴搅拌2小时，蒸干溶剂得到4-氟苯乙酰氯，现配现用。
于100ml单口烧瓶中加入α-苄氧甲基脯氨酸甲酯盐酸盐(4)780mg与66.8mg DMAP(0.2eq)和 40ml THF，冰浴下加入1.2ml三乙胺(3eq)，用恒压滴液漏斗滴入(1.1eq)4-氟苯乙酰氯的THF溶液，恢复至室温搅拌过夜，反应迅速产生大量白色絮状沉淀，为了保证反应体系能搅拌均匀，使用大量THF 溶液。TLC检测反应完全，加适量水猝灭，蒸除THF，加水和乙酸乙酯萃取，蒸干有机相，用石油醚:乙酸乙酯＝3:1的混合溶剂柱层析纯化得到黄色液提产物0.49g，收率79.3％
实施例5 N-(4-三氟甲基苯乙酰基)-2-苄氧甲基脯氨酸甲酯的合成
酰氯的制备：于100ml单口烧瓶中加入4-三氟甲基苯乙酸626mg和25ml DCM，搅拌片刻后，于冰浴下加入(2eq)0.513ml草酰氯，滴入两滴DMF作为催化剂，反应非常剧烈，释放大量气体，冰浴搅拌2 小时，蒸干溶剂得到4-三氟甲基苯乙酰氯，现配现用。
于100ml单口烧瓶中加入α-苄氧基甲基脯氨酸甲酯盐酸盐(4)780mg与66.8mgDMAP(0.2eq)和 40ml THF，冰浴下加入1.2ml三乙胺(3eq)，用恒压滴液漏斗滴入(1.1eq)4-三氟甲基苯乙酰氯的THF 溶液，恢复至室温搅拌过夜，反应迅速产生大量白色絮状沉淀，为了保证反应体系能搅拌均匀，使用大量 THF溶液。TLC检测反应完全，加适量水猝灭，蒸除THF，加水和乙酸乙酯萃取，蒸干有机相，用石油醚:乙酸乙酯＝3:1的混合溶剂柱层析纯化得到黄色液提产物0.53g，收率82.5％
实施例6 N-(4-三氟甲氧基苯乙酰基)-2-苄氧甲基脯氨酸甲酯的合成
酰氯的制备：于100ml单口烧瓶中加入4-三氟甲氧基苯乙酸675mg和25ml DCM，搅拌片刻后，于冰浴下加入(2eq)0.513ml草酰氯，滴入两滴DMF作为催化剂，反应非常剧烈，释放大量气体，冰浴搅拌 2小时，蒸干溶剂得到4-三氟甲基苯乙酰氯，现配现用。
于100ml单口烧瓶中加入α-苄氧基甲基脯氨酸甲酯盐酸盐(4)780mg与66.8mgDMAP(0.2eq)和 40ml THF，冰浴下加入1.2ml三乙胺(3eq)，用恒压滴液漏斗滴入(1.1eq)4-三氟甲氧基苯乙酰氯的THF 溶液，恢复至室温搅拌过夜，反应迅速产生大量白色絮状沉淀，为了保证反应体系能搅拌均匀，使用大量THF溶液。TLC检测反应完全，加适量水猝灭，蒸除THF，加水和乙酸乙酯萃取，蒸干有机相，用石油醚:乙酸乙酯＝3:1的混合溶剂柱层析纯化得到黄色液提产物0.51g，收率80.1％
实施例7 N-(4-氟苯乙酰基)-2-苄氧甲基吡咯烷-2-甲酸的合成
于100ml单口烧瓶中加入N-(4-氟苯乙酰基)-2-苄氧甲基脯氨酸甲酯(5)0.49g和20ml甲醇:水＝1:1的溶剂，加入氢氧化钠508mg，80℃搅拌2小时，加入盐酸溶液调PH至2，水和乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，蒸干有机相得到黄色液体羧酸产物，收率85.1％。
实施例8 N-(4-三氟甲基苯乙酰基)-2-苄氧甲基吡咯烷-2-甲酸的合成
于100ml单口烧瓶中加入N-(4-三氟甲基苯乙酰基)-2-苄氧甲基脯氨酸甲酯(5)0.55g和20ml甲醇:水＝1:1的溶剂，加入氢氧化钠508mg，80℃搅拌2小时，加入盐酸溶液调PH至2，水和乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，蒸干有机相得到黄色液体羧酸产物，收率86.9％。
实施例9 N-(4-三氟甲氧基苯乙酰基)-2-苄氧甲基吡咯烷-2-甲酸的合成
于100ml单口烧瓶中加入N-(4-三氟甲氧基苯乙酰基)-2-苄氧甲基脯氨酸甲酯(5)0.57g和20ml甲醇: 水＝1:1的溶剂，加入氢氧化钠508mg，80℃搅拌2小时，加入盐酸溶液调PH至2，水和乙酸乙酯萃取2 次，合并有机相，蒸干有机相得到黄色液体羧酸产物，收率80.3％。
实施例10 N-(4-三氟苯乙酰基)-2-苄氧甲基吡咯烷-2-甲酰胺的合成
于100ml单口烧瓶中加入N-(4-三氟苯乙酰基)-2-苄氧甲基吡咯烷-甲氨酸472mg(6)与170mg氯化铵 (5eq)，溶于50ml DCM中，再加入206mg HOBt(1.2eq)和293mg EDCI(1.2eq)，搅拌片刻后，冰浴下加入0.88ml DIPEA(4eq)，撤去冰浴搅拌过夜，TLC检测反应完全，蒸除部分溶剂，加水和乙酸乙酯萃取，合并有机相，蒸干有机相，纯乙酸乙酯柱层析得到无色酰胺产物260mg，收率55.3％
实施例11 N-(4-三氟甲基苯乙酰基)-2-苄氧甲基吡咯烷-2-甲酰胺的合成
于100ml单口烧瓶中加入N-(4-三氟甲基苯乙酰基)-2-苄氧甲基吡咯烷-甲氨酸535mg(6)与170mg氯化铵(5eq)，溶于50ml DCM中，再加入206mg HOBt(1.2eq)和292mg EDCI(1.2eq)，搅拌片刻后，冰浴下加入0.88ml DIPEA(4eq)，撤去冰浴搅拌过夜，TLC检测反应完全，蒸除部分溶剂，加水和乙酸乙酯萃取，合并有机相，蒸干有机相，纯乙酸乙酯柱层析得到无色酰胺产物271mg，收率50.8％。
实施例12 N-(4-氟苯乙酰基)2-羟甲基吡咯烷-2-甲酰胺的合成
于100ml单口烧瓶中，加入N-(4-氟苯乙酰基)-2-苄氧甲基吡咯烷-2-甲酰胺260mg(7)溶解于甲醇中，加入260mg 10％的钯碳，倒入氢气发生器反应釜反应8小时，TLC检测反应完全，过滤除去钯碳，蒸干溶剂，纯乙酸乙酯柱层析，得到黄色液体产物170mg，产率86.4％。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ(ppm)7.29-7.22(m,1H),7.05-6.89(m,3H),6.33(s,1H),5.19(s,1H),4.25(d,J＝ 11.7Hz,1H),4.38-3.67(m,4H),3.52-3.44(m,1H),2.22-2.14(m,1H),2.00-1.81(m,3H)；
13C NMR(75MHZ,CDCl3):δ(ppm)175.3,171.4,164.4,161.2,136.8,136.7,130.1,130.0,125.0,116.3,116.0, 114.0,113.7,72.6,64.6,49.8,42.1,34.8,22.9；
HRMS calcd.for C14H17FN2O3Na[M+Na]+:303.1115,found:303.1115；
IR(KBr):vmax 3338,2979,2882,1635,1590,1489,1449,1423,1249,1218,1141,1050,944,771.
实施例13 N-(4-三氟甲基苯乙酰基)-2-羟甲基吡咯烷-2-甲酰胺的合成
于100ml单口烧瓶中，加入N-(4-三氟甲基苯乙酰基)-2-苄氧甲基吡咯烷-2-甲酰胺271mg(7)溶解于甲醇中，加入296mg 10％的钯碳，倒入氢气发生器反应釜反应6小时，TLC检测反应完全，过滤除去钯碳，蒸干溶剂，纯乙酸乙酯柱层析，得到黄色液体产物189mg，产率85.1％。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ(ppm)7.58-7.36(m,4H),6.94(s,1H),6.01(s,1H),5.13-5.11(m,1H),3.99(d, J＝12.0Hz,1H),3.85-3.82(m,1H),3.77-3.70(m,3H),3.58-3.50(m,1H),2.27-2.17(m,1H),2.05-1.85(m,3H)；13C NMR(75MHz,CDCl3):δ(ppm)174.8,171.5,138.2,129.7,125.6,125.5,72.4,65.6,49.9,42.1,35.1,22.9； HRMS calcd.forC15H17F3N2O3Na[M+Na]+:353.1083,found:353.1083；
IR(KBr):vmax 3335,2977,2883,1637,1430,1409,1326,1163,1121,1067,1019,819,757.
实施例14体外抗神经炎症实验
Figure BDA0002720480910000051
化合物I～VI被用于测定抗神经炎活性。
以LPS诱导的小鼠小胶质细胞株BV-2细胞作为模型，评价上述化合物的抗神经炎症活性。BV-2为贴壁细胞，培养于DMEM高糖培养基(10％胎牛血清，100μg/ml链霉素，100unit/ml青霉素)中，培养温度为37℃，5％CO2。根据细胞生长情况，2-3d更换培养基，待生长至指数生长期备用。
MTT法检测上述化合物对于BV-2细胞活力影响：以每孔5×104个细胞将BV-2细胞接种于96孔板，按照上述培养条件培养24h待细胞贴壁。将各化合物以100μM的终浓度孵育BV-2细胞24h，之后每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，于37℃培养箱孵育4h，再加入DMSO 150μl溶解紫色沉淀，使用酶标仪于 490nm处测定吸光度，计算细胞存活率。结果见表1。由结果可知各化合物在100μM浓度下无细胞毒性作用，不影响BV-2细胞正常生长、增殖。
细胞存活率(％)＝样品组吸光度/空白对照组吸光度×100％
表1化合物I-VI对于BV-2细胞存活率的影响
化合物编号 剂量 细胞存活率(％)
空白 / 100
I 100μM 99.38±1.67
II 100μM 99.75±2.48
III 100μM 99.26±2.72
IV 100μM 98.49±2.68
V 100μM 99.38±1.77
VI 100μM 98.63±2.38 
TNF-α、IL-6含量测定：各化合物以2μM浓度与LPS(1μg/mL)共同刺激BV-2细胞24h后，取上清液按试剂盒说明书测定TNF-α、IL-6含量。(IL-6 Mouse ELISA Kit，TNF alphaMouse ELISA Kit，Thermo Fisher公司)，结果见表2。从结果可知，各化合物在2μM浓度时够有效抑制炎症因子TNF-α、IL-6的释放，具有抗炎作用。
Group Dose TNF-α(ng/L) IL-6(ng/L)
Normalcontrol / 0 0
LPS(1μg/mL) / 23.17±1.96 62.13±4.47
LPS(1μg/mL)+I 2μM 8.44±1.07 14.29±1.78
LPS(1μg/mL)+II 2μM 7.31±1.24 12.84±1.56
LPS(1μg/mL)+III 2μM 13.64±2.17 24.85±3.18
LPS(1μg/mL)+IV 2μM 11.39±1.83 20.87±2.67
LPS(1μg/mL)+V 2μM 6.72±1.19 11.24±1.77
LPS(1μg/mL)+VI 2μM 8.25±1.31 14.87±1.86 
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.通式(I)所示的化合物，其结构式为：
其中，R1/R2＝H,F,CF3,OCF3。
2.一种如权利要求 1 所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)将 L-脯氨酸 1 与水合三氯乙醛反应制备中间体 2；
b)将中间体 2 的 α-位用苄氧基甲基取代得中间体 3；
c)将中间体 3 进行分子内酯水解，再用乙酰氯脱水得中间体4；
d)将中间体 4 用取代的苯乙酰氯酰化得中间体5；
e)将中间体 5 进行酯水解得中间体 6；
f)将中间体 6 进行酰胺化得中间体 7；
g)将中间体 7 进行催化氢化脱苄基得通式(I)化合物。
3.根据权利要求2 所述的制备方法，其特征在于：
a)步骤a：L-脯氨酸1 与水合三氯乙醛回流反应得中间体2，反应所用的溶剂为乙腈、二氯甲烷、四氢呋喃、DMF、DMSO，脱水剂为4A 分子筛，反应温度为65℃～90℃，反应时间为1h～24h；
b)步骤b：先将二异丙基胺与正丁基锂己烷溶液反应制备LDA，将中间体2 与LDA 反应，再加入氯甲基苄基醚反应得中间体3；反应溶剂为无水二氯甲烷、无水四氢呋喃，反应温度为-78℃～-40℃，反应时间为0.5-10h，反应保护气体为氮气；
c)步骤c：中间体3 在无水甲醇中与金属钠反应后，再加入乙酰氯反应制得中间体4；其中，加入乙酰氯反应的反应溶剂为无水甲醇，反应温度为40℃～80℃，反应时间为1-6h；
d)步骤d：中间体4 与取代的苯乙酰氯在碱性条件下反应生成中间体5，所用的碱为三乙胺、二乙胺、DIEA，所用溶剂为无水二氯甲烷、无水四氢呋喃、无水二氧六环，缩合剂为DCC、EDC、DMAP、HATU、HOBT，反应温度为0℃～60℃，反应时间为1h～24h；
e)步骤e：中间体5 在碱性条件下酯水解成中间体6；所用碱为氢氧化钠、氢氧化钾，所用溶剂为甲醇:水＝1:1、乙醇:水＝1:1，反应温度为60℃～80℃，反应时间为1h～3h；
f)步骤f：中间体6 与氯化铵在缩合剂催化下形成中间体7；所用的缩合剂为：HOBt、HATU、EDCI、DCC、DMAP，反应溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃，反应温度为0℃～25℃，反应时间为12h～16h；
g)步骤g：中间体7 在钯碳催化下，氢化脱除苄基得目标通式(I)化合物；所用的催化剂为10％钯碳，反应溶剂为甲醇、乙醇，反应温度为20℃～30℃，反应时间为8h～12h。
4.权利要求1 所述的化合物在制备抑制神经炎症的药物方面的应用，其特征在于，抑制神经小胶质细胞炎症反应过程中IL-6 和TNF-α 的释放。
5.一种药物组合物，其特征在于，含有药效学上可接受的载体和至少一种权利要求1所述的化合物。
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