CN112168843A - 经烧结的纳米粒子及其抗病毒的用途 - Google Patents

经烧结的纳米粒子及其抗病毒的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及经烧结的纳米粒子及其抗病毒的用途。本发明揭示一种组合物，其包含有通过烧结氨基酸与亚铁离子的螯合物所制得的经烧结的纳米粒子。所述经烧结的纳米粒子通过电子探针X‑射线显微分析仪而测得具有范围落在10至400nm内的平均粒径。本发明亦揭示一种用于抑制和/或杀死在个体中的病毒的方法以及所述方法的应用。所述方法包含对所述个体给药以所述组合物。

Description

经烧结的纳米粒子及其抗病毒的用途
技术领域
本发明是有关于一种包含有经烧结的纳米粒子的组合物，以及一种使用所述组合物来抑制和/或杀死病毒的方法及其应用。
背景技术
申请人的美国专利申请公开号2017/0224727 A1已揭示一种能够稳定地通过胃的氨基酸亚铁螯合物，其在控制体重以及增强脂质代谢(lipid metabolism)与脂肪分解(lipolysis)上是有效的。此外，如同在申请人先前的专利申请以及专利(包括美国专利申请公开号2015/0065569 A1和2017/0007568 A1，以及中国台湾发明专利I587856)中所揭示的，所述氨基酸亚铁螯合物亦能够被用于癌症与糖尿病的治疗，以及降低癌细胞的乳酸产生。
猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种冠状病毒(coronavirus)，其感染猪的小肠内衬的细胞，造成猪流行性腹泻(一种严重的腹泻与脱水的情况)。较年长的猪在被感染后大多患病且体重减轻，而新生仔猪通常在接触病毒的五天内死亡。鉴于其属高度传染性会导致在仔猪中显著的发病率以及死亡率，PEDV招致重大的经济负担。
此外，古典猪瘟(classical swine fever,CSF)是一种在猪只中具有高度传染性且经常致死的疾病，其特征是发烧与出血(hemorrhages)并且可以急性或慢性的病程来显现。其病原体(causative agent)为在黄病毒科(Flaviviridae)瘟疫病毒属(Pestivirus)中的古典猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)。
病毒性呼吸疾病对猪只来说亦是问题。在这类病毒中，猪生殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)与猪流行性感冒病毒(swine influenza virus,SIV)是已知会导致肺传染性疾病的两个主要因素，并且单独或组合皆能作用。猪生殖与呼吸综合征病毒造成猪生殖与呼吸综合征(porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)(亦被知晓为猪蓝耳症)，其造成在种畜中的生殖无效以及在年轻猪只中的呼吸道疾病。猪流行性感冒病毒造成猪流行性感冒(一种在猪只中的急性传染性呼吸疾病)，其特征是突然发作、咳嗽、呼吸困难、发烧和预后迅速。猪流行性感冒在秋冬期间具有高发生率，但它全年皆会被传播。因此，有需要去发展出一个杀死如上所述的传染性病毒的有效且有效率的方法。
发明内容
于是，在第一个方面，本发明提供一种组合物，其包含有通过烧结氨基酸与亚铁离子的螯合物所制得的经烧结的纳米粒子。所述经烧结的纳米粒子通过电子探针X-射线显微分析仪(Electron Probe X-ray Micro-Analyzer,EPMA)而测得具有范围落在10至400nm内的平均粒径。
本发明所述的组合物，所述经烧结的纳米粒子具有范围落在1,500至600,000道尔顿内的重均分子量。
本发明所述的组合物，所述氨基酸是甘氨酸。
本发明所述的组合物，在所述螯合物中所述亚铁离子与所述氨基酸的螯合比例落在1：1至1：4的范围内。
在第二个方面，本发明提供一种如上所述的组合物供应用于制备用来抑制和/或杀死病毒的医药品的用途。
本发明所述的组合物供应用于制备用来抑制和/或杀死病毒的医药品的用途，所述医药品被口服地给药。
本发明所述的组合物供应用于制备用来抑制和/或杀死病毒的医药品的用途，所述组合物是药学组合物与食品组合物中的一者。
本发明所述的组合物供应用于制备用来抑制和/或杀死病毒的医药品的用途，所述病毒选自于由下列所构成的群组：猪流行性腹泻病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、古典猪瘟病毒、猪流行性感冒病毒、犬流行性感冒病毒、马流行性感冒病毒、禽鸟流行性感冒病毒、传染性胃肠炎冠状病毒、猫冠状病毒、犬冠状病毒、马动脉炎病毒、绵羊肺腺瘤反转录病毒、增生性与坏死性肺炎、犬瘟热病毒、犬第二型腺病毒、猪圆环病毒，以及它们的组合。
在第三个方面，本发明提供一种用于抑制和/或杀死在个体中的病毒的方法，其包含对所述个体给药以如上所述的组合物。
在第四个方面，本发明提供一种如上所述的组合物供应用于制备用来治疗和/或预防病毒导致的肺损伤的医药品的用途。
本发明所述的组合物供应用于制备用来治疗和/或预防病毒导致的肺损伤的医药品的用途，所述肺损伤选自于由下列所构成的群组：肺泡萎缩、肺纤维化、肺部白血球浸润、肺水肿、第二型肺泡细胞增生，以及它们的组合。
本发明所述的组合物供应用于制备用来治疗和/或预防病毒导致的肺损伤的医药品的用途，所述病毒选自于由下列所构成的群组：猪生殖与呼吸综合征病毒、猪流行性感冒病毒、犬流行性感冒病毒、马流行性感冒病毒、禽鸟流行性感冒病毒、猫冠状病毒、犬冠状病毒、绵羊肺腺瘤反转录病毒、增生性与坏死性肺炎，以及它们的组合。
在第五个方面，本发明提供一种用于治疗和/或预防在个体中的病毒导致的肺损伤的方法，其包含对所述个体给药以如上所述的组合物。
附图说明
本发明的其它特征与优点在以下参照随文检附的图式的具体例的详细说明中将变得明显，其中：
图1至3是EPMA(电子探针X-射线显微分析仪)图，其分别显示依据本发明的经烧结的纳米粒子在500X、5000X以及25000X的放大倍率下的微结构(microstructure)以及平均粒径(average particle diameter)；以及
图4是切片染色图，其显示在PRRSV感染之后的第15天，从PCG-2组以及EG-2组的仔猪的肺脏中所取得的组织通过苏木精-伊红(hematoxylin-eosin)染色而被观察到的结果。
具体实施方式
本发明的上述以及其它目的、特征与优点，在参照以下的详细说明与较佳实施例后，将变得明显。
除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领域技术人员所共同了解的意义。本领域技术人员会认知到许多与那些被描述于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。为表清楚，下面的界定被使用于本文中。
本发明提供一种组合物，其包含有经烧结的纳米粒子(sinterednanoparticles)，所述经烧结的纳米粒子是通过烧结氨基酸与亚铁离子的螯合物所制得的经烧结的纳米粒子。所述经烧结的纳米粒子通过电子探针X-射线显微分析仪(EPMA)而测得具有范围落在10至400nm内的平均粒径。
在某些具体例中，所述经烧结的纳米粒子通过动态光散射(dynamic lightscattering,DLS)而测得具有范围落在500至2,600nm内的平均粒径。
在某些具体例中，所述经烧结的纳米粒子具有范围落在1,500至600,000道尔顿内的重均分子量。在其他的具体例中，所述经烧结的纳米粒子具有范围落在1,500至15,000道尔顿内的重均分子量。在其他另外的具体例中，所述经烧结的纳米粒子具有范围落在400,000至550,000道尔顿内的重均分子量。在示范性具体例中，所述经烧结的纳米粒子具有约为550,000道尔顿的重均分子量。
依据本发明，在所述螯合物中所述亚铁离子与所述氨基酸的螯合比例(chelatingratio)落在1：1至1：4的范围内。在某些具体例中，在所述螯合物中所述亚铁离子与所述氨基酸的螯合比例落在1：1.5与1：2.5间。
用于制备所述螯合物的方法可依据，例如，US 2017/0224727 A1来进行，并且可包括在加热下使亚铁化合物与氨基酸混合的步骤。在某些具体例中，所述混合步骤可在范围落在60℃至90℃的温度下被进行。在某些具体例中，所述混合步骤可被进行历时8小时至48小时。
依据本发明，在所述制备方法中所使用的所述亚铁化合物与所述氨基酸的重量比例是介于1：1.2与1：1.5间。在本发明的具体例中，所述亚铁化合物与所述氨基酸的重量比例为1：1.3。
在某些具体例中，所述亚铁化合物可为硫酸亚铁(ferrous sulfate)、氯化亚铁(ferrous chloride)、焦磷酸亚铁(ferrous pyrophosphate)，或者它们的组合。
在某些具体例中，所述氨基酸可为甘氨酸(glycine)。也就是说，所述螯合物可为甘氨酸亚铁螯合物(ferrous glycinate chelate)。
本发明亦提供一种用于抑制和/或杀死在个体中的病毒的方法，其包含对所述个体给药以如上所述的组合物。
适用于本发明的病毒的实例可包括，但不限于：猪流行性腹泻病毒(porcineepidemic diarrhea virus,PEDV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(porcine respiratory andreproductive syndrome virus,PRRSV)、古典猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、流行性感冒病毒(influenza virus)[诸如猪流行性感冒病毒(swine influenzavirus,SIV)、犬流行性感冒病毒(canine influenza virus,CIV)、马流行性感冒病毒(equine influenza virus,EIV)、禽流行性感冒病毒(avian influenza virus,AIV)等等]、传染性胃肠炎冠状病毒(transmissible gastroenteritis coronavirus)、猫冠状病毒(feline coronavirus)、犬冠状病毒(canine coronavirus)、马动脉炎病毒(equinearteritis virus)、绵羊肺腺瘤反转录病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)、增生性与坏死性肺炎(proliferative and necrotizing pneumonia,PNP)、犬瘟热病毒(caninedistemper virus)、犬第二型腺病毒(canine adenovirus type 2,CAV-2)、猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)，以及它们的组合。
依据本发明，该方法进一步包含抑制和/或杀死在该个体中的选自于由下列所构成的微生物：支原体(mycoplasma)(亦被称为霉浆菌)、弓浆虫(Toxoplasmosis gondii)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)，以及它们的组合。
本发明亦提供一种用于治疗和/或预防在个体中的病毒导致的肺损伤的方法，其包含对所述个体给药以如上所述的组合物。
依据本发明，该肺损伤选自于由下列所构成的群组：肺泡萎缩、肺纤维化、肺部白血球浸润、肺水肿、第二型肺泡细胞增生，以及它们的组合。
依据本发明，导致该肺损伤的病因进一步包含有下列的至少一者：PM2.5、猪生殖与呼吸综合征病毒、猪流行性感冒病毒、犬流行性感冒病毒、马流行性感冒病毒、禽鸟流行性感冒病毒、猫冠状病毒、犬冠状病毒、绵羊肺腺瘤反转录病毒、增生性与坏死性肺炎，以及它们的组合。
依据本发明，所述组合物可被制备成药学组合物(pharmaceutical composition)或食物组合物(food composition)的形式。
若所述组合物被制备成药学组合物的形式，所述组合物可进一步包含药学上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)，并且利用熟习此领域者所详知的技术而被制造成适合于口服给药(oral administration)的剂型(dosage form)。所述剂型的实例包括，但不限于：溶液(solution)、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、粉末(powder)、锭剂(tablet)、丸剂(pill)、糖浆(syrup)、口含锭(lozenge)、片剂(troche)、口嚼胶(chewing gum)、胶囊(capsule)、浓浆(slurry)以及类似物。
适用于本发明的药学上可接受的载剂的实例可包括，但不限于：溶剂(solvent)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agents)、分解剂(decomposers)、黏结剂(binding agents)、赋形剂(excipients)、稳定剂(stabilizing agents)、螯合剂(chelating agents)、稀释剂(diluents)、胶凝剂(gelling agents)、防腐剂(preservatives)、润滑剂(lubricants)、吸收延迟剂(absorption delaying agents)、脂质体(liposomes)，以及它们的组合。
依据本发明，所述组合物可呈食品添加物(food additive)或饲料添加物(feedadditive)的形式(食品组合物的示范性实例)，其可以被添加至可食性材料(ediblematerial)中以制备供人类或动物食用的食品产品。依据本发明，所述食物产品的实例可包括，但不限于：流体乳品(fluid milk products)，例如，牛奶(milk)以及浓缩牛奶(concentrated milk)；发酵乳品(fermented milk)，例如，优酪乳(yogurt)、酸乳(sourmilk)以及冷冻优格(frozen yogurt)；奶粉(milk powder)；冰淇淋(ice cream)；乳酪(cream cheeses)；干酪(dry cheeses)；豆奶(soybean milk)；发酵豆奶(fermentedsoybean milk)；蔬果汁(vegetable-fruitjuices)；果汁(fruit juices)；运动饮料(sports drinks)；甜点(confectionery)；果冻(jelly)；糖果(candies)；健康食品(healthfoods)；动物饲料(animal feeds)；以及膳食补充品(dietary supplements)。
如本文中所使用的，术语“个体”意指任何感兴趣的动物，诸如人(humans)、猴子(monkeys)、牛(cows)、绵羊(sheeps)、马(horses)、猪(pigs)、山羊(goats)、狗(dogs)、猫(cats)、小鼠(mice)以及大鼠(rats)。在某些具体例中，所述个体可为人类。在其他具体例中，所述个体可为猪。
依据本发明，所述组合物的给药剂量与频率可视下列因素而变化：要被抑制和/或杀死的病毒的严重性，以及要被治疗的个体的体重、年龄、身体状况以及反应。举例来说，依据本发明，所述组合物的每日剂量可以是每kg体重12至36mg，并且可以单一剂量或多个剂量而被给药。
本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，所述实施例只是供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。
<实施例>
一般实验材料：
1.药学组合物A1：
含有经烧结的纳米粒子的药学组合物A1呈冷冻干燥粉末的形式，并且由ShanghaiBestar Biochemical Co.,Ltd所制造。
具体而言，硫酸亚铁与甘氨酸(高于98％的纯度)以为1：1.3的重量比例而被混合，继而自60℃加热至90℃历时8小时至48小时以得到具有范围落在1：1至1：4内的螯合比例的亚铁离子与甘氨酸的螯合物。所得到的螯合物接着在范围落在200℃至240℃内的温度下被烧结以得到经烧结的纳米粒子。
通过在Beckman Coulter N5 Submicron粒径分析仪(Beckman Coulter N5Submicron Particle Size Analyzer)上的动态光散射(dynamic light scattering,DLS)且于水中所测得的经烧结的纳米粒子的平均粒径(average particle diameter)为1465.90±132.29nm。
此外，所述经烧结的纳米粒子被溶解在HCl中并且接着进一步使用电子探针X-射线显微分析仪(EPMA)在500X、5000X以及25000X的放大倍率下来进行微结构分析。图1至3是所述经烧结的纳米粒子在各个放大倍率下的EPMA图。这些结果显示：本发明经烧结的纳米粒子具有范围落在大约50nm至大约400nm内的平均粒径。
通过使用Waters Alliance 2695系统(Waters Alliance 2695System)的凝胶渗透层析法(gel permeation chromatography)所测得的溶解于水中的经烧结的纳米粒子的数均分子量(number-average molecular weight,Mn)、重均分子量(weight-averagemolecular weight,Mw)、峰值分子量(peak molecular weight,MP)以及多分散性指数(polydispersity,PDI)分别为68188道尔顿、525538道尔顿、286426道尔顿以及7.707205道尔顿。
将药学组合物A1溶解于无菌的纯水中以配制具有浓度为250mg/mL的储备溶液(stock solution)以供用于下面的实施例1至3。
2.病毒：
猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(porcine respiratory and reproductive syndrome virus,PRRSV)、猪流行性感冒病毒(swine influenza virus,SIV)以及古典猪瘟病毒(classical swine fevervirus,CSFV)得自于中国上海农业科学院(Shanghai Academy of AgriculturalSciences,SAAS)。
3.用于繁殖病毒的宿主细胞：
用于繁殖PEDV的Vero细胞(ATCC CCL-81)、用于繁殖PRRSV的MARC 145细胞(ATCCCRL-12231)，以及用于繁殖SIV的MDCK细胞(ATCC CCL-34)得自于中国上海农业科学院(SAAS)。
实施例1.药学组合物A1对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的效用
实验方法：
A、在病毒接种(virus inoculation)前以药学组合物A1对宿主细胞进行预处理(Pretreatment)，且随后以PEDV对经预处理的宿主细胞进行病毒接种
生长良好的Vero细胞在分离(detachment)之后使用DMEM培养基来进行稀释，以达致为106细胞/mL的细胞浓度。对所形成的含有DMEM培养基的细胞悬浮液的各个整分部分(aliquot portions)添加适量的含有药学组合物A1的储备溶液，借此得到分别具有药学组合物A1的最终浓度为1000μg/mL、500μg/mL以及100μg/mL的细胞悬浮液。在24-孔细胞培养板上，以各种浓度的药学组合物A1所处理的细胞被接种至6孔中，细胞对照组(未经含有药学组合物A1的储备溶液的处理)亦被接种。细胞培养板被置于37℃下以进行24小时的培育，接着取出并通过吸取来移除培养基。细胞使用无菌的PBS溶液予以清洗三次。
PEDV溶液以为1:200的比例而被稀释。100μL的所形成的经稀释的病毒溶液被接种至各孔中。病毒吸附在37℃下被进行历时1小时。其后，病毒溶液通过吸取而被移除。100μL的DMEM完全培养基被添加至各孔中，继而在37℃下进行培育。细胞病变效应(cytopathiceffect)被观察到。在第96小时各个含有病毒的培养基被收集以测定病毒的TCID50(50％组织培养感染剂量)。
B、以药学组合物A1-处理的PEDV来对宿主细胞进行病毒接种
生长良好的Vero细胞在分离之后被拿来进行稀释，以达致为106细胞/mL的细胞浓度，继而将细胞平盘培养(plating)于24-孔细胞培养板上。培育在37℃下被进行历时24小时。
无菌的PBS溶液以为1:200的比例而被用来稀释PEDV。对所形成的经稀释的PEDV溶液的各个整分部分添加适量的含有药学组合物A1的储备溶液，借此得到分别具有药学组合物A1的最终浓度为1000μg/mL、500μg/mL以及100μg/mL的药学组合物A1-处理的PEDV溶液。所述处理在37℃下被允许进行历时1小时。
随后，所述药学组合物A1-处理的PEDV溶液被接种至24-孔细胞培养板中。具体而言，各个药学组合物A1-处理的PEDV溶液被接种至6孔中，而各孔容载100μL的药学组合物A1-处理的PEDV溶液。此外，细胞对照组被接种未经药学组合物A1的处理的病毒。
细胞培养板被置于37℃下来进行培育。细胞病变效应被观察到。在第96小时各个含有病毒的溶液被收集以测定病毒的TCID50。
结果：
A、在病毒接种前以药学组合物A1对宿主细胞进行预处理，且随后以PEDV对经预处理的宿主细胞进行病毒接种
在被预处理以药学组合物A1的Vero宿主细胞中所观察到的细胞病变效应以及所测得的病毒的TCID50分别被显示于下面的表1与表2中。
表1.所观察到的细胞病变效应的程度
Figure BDA0002513730610000101
表2.所测得的TCID50
药学组合物A1的浓度 TCID<sub>50</sub>
1000μg/mL 10<sup>-1</sup>/0.1mL
500μg/mL 10<sup>-1.6667</sup>/0.1mL
100μg/mL 10<sup>-2.2241</sup>/0.1mL
0μg/mL 10<sup>-6.3441</sup>/0.1mL
如表2中所示，药学组合物A1的浓度越高，所测得的TCID50则越高，其显示：以适当浓度的药学组合物A1来进行预处理能够对PEDV在宿主细胞中的繁殖造成抑制。
B、以药学组合物A1-处理的PEDV来对宿主细胞进行病毒接种
在宿主细胞中所观察到的细胞病变效应以及药学组合物A1-处理的PEDV所测得的TCID50分别被显示于下面的表3与表4中。
表3.所观察到的细胞病变效应的程度
Figure BDA0002513730610000111
表4.所测得的TCID50
药学组合物A1的浓度 TCID<sub>50</sub>
1000μg/mL 10<sup>-3.5714</sup>/0.1mL
500μg/mL 10<sup>-4.4099</sup>/0.1mL
100μg/mL 10<sup>-5.4099</sup>/0.1mL
0μg/mL 10<sup>-6.3441</sup>/0.1mL
如表3中所示，使用药学组合物A1来进行处理降低了细胞病变效应的程度，其显示：药学组合物A1在抑制和/或杀死病毒上是有效的。特别地，当500μg/mL或100μg/mL的药学组合物A1被施用时，细胞病变效应被显著地延迟，并且显著低程度的细胞病变效应被观察到。
如表4中所示，药学组合物A1的浓度越高，TCID50则越高，其显示：以适当浓度的药学组合物A1来进行处理能够对PEDV在宿主细胞中的繁殖造成抑制。
实施例2.药学组合物A1对猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的效用
实验方法：
A、在病毒接种前以药学组合物A1对宿主细胞进行预处理，且随后以PRRSV对经预处理的宿主细胞进行病毒接种
在24-孔细胞培养板上，被预处理以呈为1000μg/mL、500μg/mL以及100μg/mL的各个浓度的药学组合物A1的MARC 145宿主细胞(其依据实施例1的第A点中所述的方法而被制备)被接种至6孔中，细胞对照组(未经药学组合物A1的处理)亦被接种。细胞培养板被置于37℃下来进行24小时的培育，接着取出并通过吸取来去除培养基。细胞使用无菌的PBS溶液予以清洗三次。
PRRSV溶液以为1:200的比例而被稀释。100μL的所形成的经稀释的病毒溶液被接种至各孔中。病毒吸附在37℃下被进行历时1小时。其后，病毒溶液通过吸取而被移除。100μL的DMEM完全培养基被添加至各孔中，继而在37℃下进行培育。在第92小时各个含有病毒的培养基被收集，以测定在被预处理以不同浓度的药学组合物A1的宿主细胞中的病毒含量(相较于细胞对照组)。
B、以药学组合物A1-处理的PRRSV来对宿主细胞进行病毒接种
将药学组合物A1溶解于无菌的纯水中以配制具有浓度为250mg/mL的储备溶液。生长良好的MRAC 145细胞在脱离之后被拿来进行稀释，以达致为106细胞/mL的细胞浓度，继而将细胞平盘培养于24-孔细胞培养板上。培育在37℃下被进行历时24小时。
药学组合物A1-处理的PRRSV溶液依据实施例1的第B点中所述的方法来进行制备，其分别具有1000μg/mL、500μg/mL以及100μg/mL的药学组合物A1的最终浓度。
随后，所述药学组合物A1-处理的PRRSV溶液被接种至24-孔细胞培养板中。具体而言，各个药学组合物A1-处理的PRRSV溶液被接种至6孔中，而各孔容载100μL的药学组合物A1-处理的PRRSV溶液。此外，细胞对照组被接种未经药学组合物A1的处理的病毒。
细胞培养板被置于37℃下来进行培育。在第96小时各个含有病毒的溶液被收集，以测定在被接种以不同浓度的药学组合物A1-处理的PRRSV溶液的细胞中的病毒含量(相较于细胞对照组)。
结果：
A、在病毒接种前以药学组合物A1对宿主细胞进行预处理，且随后以PRRSV对经预处理的宿主细胞进行病毒接种
在被预处理以药学组合物A1的宿主细胞中所测得的病毒含量被显示于表5中。
表5.在宿主细胞中所测得的病毒含量
药学组合物A1的浓度 病毒含量(相较于细胞对照组)
1000μg/mL 0.322
500μg/mL 0.664
100μg/mL 0.876
0μg/mL 1
如表5中所示，药学组合物A1的浓度越高，病毒含量则越低，其显示：以适当浓度的药学组合物A1来进行预处理能够对PRRSV在宿主细胞中的繁殖造成抑制。
B、以药学组合物A1-处理的PRRSV来对宿主细胞进行病毒接种
在被接种以药学组合物A1-处理的PRRSV的宿主细胞中所测得的病毒含量被显示于下面的表6中。
表6.在宿主细胞中所测得的病毒含量
药学组合物A1的浓度 病毒含量(相较于细胞对照组)
1000μg/mL 0.681
500μg/mL 0.773
100μg/mL 0.96
0μg/mL 1
如表6中所示，使用药学组合物A1来进行处理降低了在宿主细胞中的病毒含量，其显示：药学组合物A1在抑制和/或杀死病毒上是有效的。特别地，药学组合物A1的浓度越高，病毒含量则越低，其显示：以适当浓度的药学组合物A1来进行处理能够对PRRSV在宿主细胞中的繁殖造成抑制。
实施例3.药学组合物A1对猪流行性感冒病毒(swine influenza virus,SIV)的效用
实验方法：
A、在病毒接种前以药学组合物A1对宿主细胞进行预处理，且随后以SIV对经预处理的宿主细胞进行病毒接种
在24-孔细胞培养板上，被处理以呈为1000μg/mL、500μg/mL以及100μg/mL的各个浓度的药学组合物A1处理的MDCK细胞(其依据实施例1的第A点中所述的方法而被制备)被接种至6孔中，细胞对照组(未经药学组合物A1的处理)亦被接种。细胞培养板被置于37℃下来进行历时24小时的培育，接着取出并通过吸取来去除培养基。细胞使用无菌的PBS溶液予以清洗三次。
SIV溶液以为1:200的比例而被稀释。100μL的所形成的经稀释的病毒溶液被接种至各孔中。病毒吸附在37℃下被进行历时1小时。其后，病毒溶液通过吸取而被移除。100μL的含有血清的完全培养基被添加至各孔中，继而在37℃下进行培育。在第72小时各个含有病毒的培养基被收集，以使用Reed-Muench法(Reed-Muench method)来测定病毒的TCID50。
B、以药学组合物A1-处理的SIV来对宿主细胞进行病毒接种
将药学组合物A1溶解于无菌的纯水中以配制具有浓度为250mg/mL的储备溶液。生长良好的MDCK细胞在脱离之后被拿来进行稀释，以达致为106细胞/mL的细胞浓度，继而将细胞平盘培养于24-孔细胞培养板上。培育在37℃下被进行历时24小时。
药学组合物A1-处理的SIV溶液依据实施例1的第B点中所述的方法来进行制备，其分别具有1000μg/mL、500μg/mL以及100μg/mL的药学组合物A1的最终浓度。
随后，药学组合物A1-处理的SIV溶液被接种至24-孔细胞培养板中。具体而言，各个药学组合物A1-处理的SIV溶液被接种至6孔中，而各孔容载100μL的药学组合物A1-处理的SIV溶液。此外，细胞对照组被接种未经药学组合物A1的处理的病毒。
细胞培养板被置于37℃下来进行培育。在第72小时各个含有病毒的溶液被收集，以使用Reed-Muench法来测定病毒的TCID50。
结果：
A、在病毒接种前以药学组合物A1对宿主细胞进行预处理，且随后以SIV对经预处理的宿主细胞进行病毒接种
在被预处理以药学组合物A1的宿主细胞中所测得的TCID50被显示于下面的表7中。
表7.在宿主细胞中所测得的TCID50
药学组合物A1的浓度 TCID<sub>50</sub>
1000μg/mL 10<sup>-2.7</sup>/0.1mL
500μg/mL 10<sup>-3.18</sup>/0.1mL
100μg/mL 10<sup>-3.39</sup>/0.1mL
0μg/mL 10<sup>-4.88</sup>/0.1mL
如表7中所示，药学组合物A1的浓度越高，TCID50则越高，其显示：以适当浓度的药学组合物A1来进行预处理能够对SIV在宿主细胞中的繁殖造成抑制。
B、以药学组合物A1-处理的SIV来对宿主细胞进行病毒接种
在宿主细胞中所测得的药学组合物A1-处理的SIV的TCID50被显示于下面的表8中。
表8.在宿主细胞中所测得的TCID50
药学组合物A1的浓度 TCID<sub>50</sub>
1000μg/mL 10<sup>-2.28</sup>/0.1mL
500μg/mL 10<sup>-3.45</sup>/0.1mL
100μg/mL 10<sup>-3.59</sup>/0.1mL
0μg/mL 10<sup>-4.88</sup>/0.1mL
如表8中所示，使用药学组合物A1来进行处理降低了病毒繁殖，其显示：药学组合物A1在抑制和/或杀死病毒上是有效的。特别地，药学组合物A1的浓度越高，TCID50则越高，其显示：以适当浓度的药学组合物A1来进行处理能够对SIV在宿主细胞中的繁殖造成抑制。
实施例4.药学组合物A1对PRRSV以及CSFV的活体内效用(in vivo effect)实验方法：
十四只21日龄的离乳后仔猪(购自于Fumin Ranch,Chongming District,Shanghai Municipality,P.R.C.)被使用于下面的实验中。实验仔猪被随机地分成一个对照组(CG组，n＝2)、两个病理对照组(PCG-1组以及PCG-2组，n＝3/组)以及两个实验组(EG-1组以及EG-2组，n＝3/组)。
在CG组、PCG-1组以及PCG-2组中的各个仔猪每天被喂食以基础饲料历时1周。在EG-1组以及EG-2组中的各个仔猪每天被喂食以混合饲料历时1周。所述混合饲料是将所述基础饲料与如上所制得的药学组合物A1以为1000：1的重量比来进行混合而制得的。之后，PCG-1组以及EG-1组的仔猪以每只仔猪1×105pfu/mL的剂量而被感染以CSFV(溶解于无菌PBS中)。PCG-2组以及EG-2组的仔猪以每只仔猪1×105pfu/mL的剂量而被感染以PRRSV。CG组的仔猪则接受相同体积的无菌PBS。
在病毒感染之后，各组仔猪各别被喂食以如上所述的饲料历时15天。所述仔猪的健康状况以及临床症状的发生被监测。各个仔猪的粪便样品在病毒感染之后的第1天至第11天被收集，以及各个仔猪的血液样品亦在病毒感染之后的第3、5、7、9、11以及15天被收集。这些样品被分析以判定病毒脱落期(duration of viral shedding)。另外，PCG-2组以及EG-2组的仔猪的肺脏组织在病毒感染之后的第15天被收取并被拿来进行切片处理。所得到的组织切片通过使用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin)并且依据熟习此项技艺者所详知且惯用的技术来进行染色。经染色的组织切片是通过使用光学显微镜并在为400倍的放大倍率下来进行观察以及拍照。
结果：
各组仔猪的发病及死亡数被显示于表9中。关于CSFV，在EG-1组以及PCG-1组中的临床症状发生分别在病毒感染之后的第7天以及第3天来观察。在PCG-1组的三只仔猪中有两只(67％)死于CSFV感染(在第7天以及第11天)，然而在EG-1组的三只仔猪中只有一只(33％)死于CSFV感染。关于PRRSV，在EG-2组中仅有一只仔猪在第1天显示出临床症状发生。这只仔猪在9天后复原，并且在EG-2组中没有死亡的情形被观察到。然而，在PCG-2组中的所有仔猪在第1天显示出临床症状发生，并且其中一只(33％)在病毒感染之后的第6天死于PRRSV感染。
另一方面，各组的病毒脱落期被显示于表10中。可以看到的是：PCG-1组的病毒脱落期横跨在CSFV感染之后的第3天至第11天，而EG-1组所具者则横跨第5天至第11天。PCG-2组以及EG-2组这两组的病毒脱落期则横跨在PRRSV感染之后的第5天至第11天。
至于在PRRSV感染之后的第15天，从PCG-2组以及EG-2组的仔猪的肺脏中所取得的组织通过苏木精-伊红染色而被观察到的结果被显示于图4中。从图4可见，PCG-2组的仔猪之肺脏组织切片当中有出现肺泡萎缩的现象，而EG-2组则没有此现象。
这些结果显示：投药经烧结的纳米粒子能够降低CSFV和/或PRRSV所感染的仔猪的发病率以及死亡率，并且可以缩短病毒脱落期以及改善PRRSV所导致之肺泡萎缩。因此，可以被预期的是：本发明的经烧结的纳米粒子可以有效地在个体中抑制病毒繁殖(viruspropagation)，以及提升所述个体对抗病毒(诸如CSFV以及PRRSV)的免疫力以及抵抗力，并且能够在所述个体体内有效地改善病毒导致的肺损伤。
表9
组别 发病数 总死亡数
PCG-1 3(在第3天) 2
EG-1 3(在第7天) 1
PCG-2 3(在第1天) 1
EG-2 1(在第1天) 0
CG 0 0
表10
Figure BDA0002513730610000171
基于上面的结果，申请人预期：本发明由氨基酸与亚铁离子的螯合物所得到的经烧结的纳米粒子能够抑制和/或杀死病毒，借此显著地降低病毒在宿主中的繁殖及其所导致的损伤，特别是肺损伤。
于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本申请作为参考资料。若有所冲突时，本申请详细说明(包含界定在内)将占上风。
虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明只受如随文检附的权利要求书所示者的限制。

Claims (11)

1.一种组合物，其特征在于：所述组合物包含有通过烧结氨基酸与亚铁离子的螯合物所制得的经烧结的纳米粒子，所述经烧结的纳米粒子通过电子探针X-射线显微分析仪(EPMA)而测得具有范围落在10至400nm内的平均粒径。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述经烧结的纳米粒子具有范围落在1,500至600,000道尔顿内的重均分子量。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述氨基酸是甘氨酸。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：在所述螯合物中所述亚铁离子与所述氨基酸的螯合比例落在1：1至1：4的范围内。
5.一种根据权利要求1所述的组合物供应用于制备用来抑制和/或杀死病毒的医药品的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述医药品被口服地给药。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述组合物是药学组合物与食品组合物中的一者。
8.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述病毒选自于由下列所构成的群组：猪流行性腹泻病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、古典猪瘟病毒、猪流行性感冒病毒、犬流行性感冒病毒、马流行性感冒病毒、禽鸟流行性感冒病毒、传染性胃肠炎冠状病毒、猫冠状病毒、犬冠状病毒、马动脉炎病毒、绵羊肺腺瘤反转录病毒、增生性与坏死性肺炎、犬瘟热病毒、犬第二型腺病毒、猪圆环病毒，以及它们的组合。
9.一种根据权利要求1所述的组合物供应用于制备用来治疗和/或预防病毒导致的肺损伤的医药品的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述肺损伤选自于由下列所构成的群组：肺泡萎缩、肺纤维化、肺部白血球浸润、肺水肿、第二型肺泡细胞增生，以及它们的组合。
11.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述病毒选自于由下列所构成的群组：猪生殖与呼吸综合征病毒、猪流行性感冒病毒、犬流行性感冒病毒、马流行性感冒病毒、禽鸟流行性感冒病毒、猫冠状病毒、犬冠状病毒、绵羊肺腺瘤反转录病毒、增生性与坏死性肺炎，以及它们的组合。
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