CN112159792A - 一种增强人间充质干细胞生物学特性的诱导处理方法 - Google Patents

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刘学彬
张成城
刘浩元
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Abstract

本发明公开了一种增强人间充质干细胞生物学特性的诱导处理方法，属于间充质干细胞的诱导技术领域。诱导培养基在普通间充质干细胞培养基的基础上加入了不同浓度的白花檵木作为诱导物。间充质干细胞来源包括骨髓、脐带、胎盘、牙髓、脐带血等一切富含间充质干细胞的人体组织。这种诱导处理方法是采用不同浓度的白花檵木提取物对经传代培养稳定的人间充质干细胞进行共培养48小时。本发明能够有效提升间充质干细胞的包括抗氧化、抗凋亡、抗衰老、血管再生以及组织修复等各种生物学特性。

Description

一种增强人间充质干细胞生物学特性的诱导处理方法
技术领域
本发明属于生物技术领域的一种间充质干细胞的诱导处理方法，具体涉及的是一种诱导后增强间充质干细胞多种生物学特性的方法。
背景技术
间充质干细胞是一类存在于多种组织(如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等)，具有自我复制和多向分化潜力，非造血系的成体干细胞。这类干细胞具有向多种间充质系列细胞(如成骨、成软骨及脂肪细胞等)分化或跨系分化成非间充质系列细胞的潜能(比如心脏细胞、神经细胞)，并具有独特的细胞因子分泌功能以及免疫调节功能。目前，间充质干细胞移植已经成功应用于包括神经系统、消化系统、免疫系统等多个系统的疾病治疗。现有的间充质干细胞诱导方法大多局限于增强其分化成某一种细胞的能力，而缺乏增强提高间充质干细胞整体生物学特性的方法。
发明内容
本发明针对目前间充质干细胞的广谱应用前景，发展了一种增强提高其多种生物学特性的诱导方法。
为此，本发明提供了一种增强间充质干细胞多种生物学特性的诱导方法。
包括以下步骤：
A、不同组织来源的间充质干细胞组织经过不同的处理方法并进行原代细胞培养得到原代细胞，原代细胞培养离心完后的细胞，去掉上清后加入含有血清替代物的干细胞培养基，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；
B、将重悬后的细胞悬液接种到含有血清替代物的干细胞培养基的培养瓶中；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80-90％；
种瓶：(1-10)x104cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入培养基20ml；
按照上述传代方法依次传代，选取P3-P6代次的间充质干细胞为诱导的干细胞来源；所获得的间充质干细胞经过流式细胞仪鉴定纯度。
脐带间充质干细胞的诱导处理方法：
选取P3-P6代次的间充质干细胞，按照(1-10)x104cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入含有1-100ug/ml范围的白花檵木提取物培养基20ml，继续培养48h。
本发明以脐带间充质干细胞的获取方法为例，阐述间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)取足月健康胎儿脐带，检测脐带血清HbsAg、抗-HCV、抗-HDV、抗-HEV、抗-HIV-1/2、HCV-RNA、HIV-1-RNA、CMV-DNA，检测结果均为阴性，可用；
(2)将生理盐水瓶用喷有酒精的纱布擦拭一遍后，去除瓶口处的封口塑料放入处于运行状态的洁净台中；
(3)脐带华通氏胶的剥离并洗涤；
优选:在生理盐水中洗涤去除脐带血渍，然后浸泡酒精消毒，再次用生理盐水洗涤，在装有生理盐水的培养皿中将将脐带剪成2-3cm小段，并用生理盐水洗涤清除脐带小段血管中的淤血和凝块；然后剥离华通氏胶，用生理盐水进行洗涤；
(4)组织块制备
剪切脐带华通氏胶：将步骤(3)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1-4mm的组织匀浆；用生理盐水洗涤组织匀浆，进行离心；
(5)接种
将步骤(4)离心后的组织匀浆去除上清后，接种到接种培养瓶如T150中，并平铺到整个接种培养瓶底面；
(6)脐带华通氏胶的培养
平置步骤(5)接种培养瓶，放置于CO2培养箱中，6-12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有10wt％血清替代物(商品名称：Ultroser G serumsubstitute；货号：15950-017；购自美国pall公司)的干细胞培养基(高糖DMEM培养基)，然后缓慢让它浸润整个组织块；
培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％；
(7)换液
第一次换液：步骤(6)脐带华通氏胶培养到第6-7天进行全量换液；将旧的培养基和未贴壁的组织块倒掉，加入等量的含有10％血清替代物的培养基，平置培养瓶，放置到从CO2培养箱中继续培养；
第二次换液：脐带华通氏胶培养到9-10天后，重复第一次换液的操作；
第三次换液：在镜像下观察细胞的生长状况，如果细胞融合度没有达到70-80％，在脐带华通氏胶培养到12-13天后，增加一次全量换液的操作；
(8)收获原代细胞
细胞观察：将所有培养瓶在显微镜下观察，如观察到细胞融合度达到70％-80％时，即可进行消化收获；
原代细胞收获：
配置细胞消化液：按照体积比1:4的比例混合胰酶与生理盐水，混合液即为细胞消化液。
去除旧的培养液：轻轻摇晃培养瓶，使未贴壁组织块脱落，再将组织块和旧的培养液一起倒入废液瓶中；
洗涤：往每个去掉旧培养液的瓶中倒入生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，使生理盐水液体浸润培养瓶底面和组织块，再将生理盐水倒掉，重复洗涤一次；
消化：往洗涤后的每个培养瓶中加入消化液，使每个培养瓶的消化液浸润整个培养瓶底面，静置1min，上下摇晃培养瓶，使消化液充分接触细胞，镜下观察90％的细胞脱落变圆后可停止消化；
终止消化：往可终止消化的培养瓶中每瓶加入间充质干细胞培养基，进行终止消化，前后摇晃培养瓶，进行充分接触稀释，然后转移到50ml离心管中离心；
(9)原代细胞传代(P0传P1)
上一步离心完后的细胞，去掉上清后加入含有血清替代物的干细胞培养基，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；
将重悬后的细胞悬液接种到培养瓶并用含有血清替代物的干细胞培养基定容到一定体积，使细胞达到一定浓度；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80-90％。
种瓶：(1-10)x104cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入培养基20ml。
按照上述传代方法依次传代，选取P3-P6代次的间充质干细胞为诱导的干细胞来源。所获得的间充质干细胞经过流式细胞仪鉴定纯度，符合细胞表型为：CD34/CD45/CD11b/CD19/HLADR(-)，CD90/CD105/CD73(+)。
脐带间充质干细胞的诱导处理方法：
选取P3-P6代次的间充质干细胞，按照(1-10)x104cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入含有1-100ug/ml范围的白花檵木提取物培养基20ml，继续培养48h；所述的白花檵木提取物培养基为在所述的含有血清替代物的干细胞培养基中添加有白花檵木提取物，白花檵木提取物的含量浓度为1-100ug/ml。上述所述的(1-10)x104cells/cm2，优选50000cells/cm2。
本发明的有益效果是：
本发明首次发现了白花檵木提取物可以有效整体提高间充质干细胞多种生物学特性，为间充质干细胞发挥更大功效提供了稳定的生物学方法，具体提高的生物学特性包括：①、抗氧化/能力增强；②、增殖能力增强；③、分泌能力增强；④、伤口修复能力增强；⑤、抗衰老能力增强。
附图说明
图1为本发明实施例1白花檵木提取物诱导的脐带间充质干细胞的照片。
图2为本发明实施例1白花檵木提取物诱导的脐带间充质干细胞的流式细胞仪鉴定照片。
图3为实施例3对应的MSC增殖曲线；
图4为实施例5对应的伤口愈合图；自上而下对应的是滴加干细胞悬液后第3/6/9天的伤口愈合图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
所述白花檵木花提取物，是用药物可接受的溶剂对白花檵木花进行浸提所得的粗提物。
提取白花檵木花所用的浸提方法，可采用本领域常用的浸提方法，如渗漉法、水蒸气蒸馏法、回流法、浸渍法、超临界流体提取法，也可采用柱分离、离子交换等植物有效成分分离的常规方法。在确保不破坏活性物质成分的前提下，力求采用节能减排、生态环保式的清洁生产工艺；
优选的提取方法是发明人之一刘浩元探索出的一套生物酶解法提取技术制备白花檵木花提取物的工艺流程。见中国专利申请200710149826.4。
优选生物酶解法提取技术制备白花檵木花提取物的具体流程进一步优选为：白花檵木花鲜材料破碎；采用组合菌酶解法获得的白花檵木花破壁产物，采用动态温浸法提取，提取浸膏先用醇提法去除叶绿素等脂溶性杂质，再用水提醇沉法去除糖类等水溶性杂质，对白花檵木花的粗提物初步分离纯化后，得到含生物活性物质的白花檵木花化学部位。所述生物组合菌酶解所用的菌种为荷兰株芽孢，来源于景德板鸡发酵粉，由江西景德板鸡实业公司提供。
实施例1脐带间充质干细胞的制备
本发明所述的白花檵木提取物诱导的脐带间充质干细胞主要是来源于人脐带的间充质干细胞，但干细胞来源不仅限于脐带，还可来源于人体胎盘、骨髓、牙髓、脂肪等多个人体组织来源。
其中，白花檵木提取物诱导的脐带间充质的制备过程如下：
(1)脐带间充质干细胞的培养：剪取新鲜脐带，用无菌生理盐水清洗干净后，进一步去除可见血管及华氏胶组织，将脐带剪碎至大小约1mm3大小后放入细胞培养皿中，加入含有10wt％血清替代物(商品名称：Ultroser G serum substitute；货号：15950-017；购自美国pall公司)的基础培养基(高糖DMEM培养基)至刚好覆盖组织块，置于37℃二氧化碳培养基中培养。约10-14天后可见梭型细胞从组织块中爬出，此即为脐带间充质干细胞，经过几次传代，当到3-6代的时候即可使用来制备用于白花檵木提取物诱导的间充质干细胞。如图1和图2所示，图1和图2分别是白花檵木提取物诱导的脐带间充质干细胞的培养图片和流式细胞仪鉴定图片。
(2)脐带间充质干细胞的诱导方法：通过胰酶消化获取间充质干细胞，用0.9％的生理盐水反复清洗细胞3遍，以去除相关的培养基成份，而后计数细胞，一般按照50000cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入含有10ug/ml范围的白花檵木提取物培养基20ml(我们采用了含有1ug/ml，5ug/ml，10ug/ml和100ug/ml白花檵木提取物的培养基，结果发现当白花檵木提取物在10ug/ml浓度时，所培养的干细胞各项指标达到最佳。因此，其余各项干细胞能力的检测所使用的的白花檵木提取物浓度均为10ug/ml)，继续培养48h。
实施例2白花檵木诱导的间充质干细胞抗氧化能力检测：
首先建立H2O2(1.6umol/L)诱导损伤的神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株建立了H2O2(1.6umol/L)诱导氧化损伤的细胞筛选模型，通过与白花檵木诱导的间充质细胞和普通培养的间充质干细胞用transwell共培养，继而测定细胞存活率的变化来评定不由诱导和用白花檵木诱导后的干细胞的抗氧化能力。
对白花檵木提取物进行梯度稀释，进行复筛，结果如下：
结论：
Figure BDA0002667563490000051
transwell共培养实验筛选结果显示，在H2O2诱导的神经元氧化损伤模型上，白花檵木诱导的间充质干细胞较普通培养的间充质干细胞具有更好的抗氧化损伤能力。
实施例3白花檵木诱导的间充质干细胞增殖能力检测：
使用MTT法检测MSC存活和生长曲线，结果表明，白花檵木诱导的MSC的OD植在连续8天的培养过程中均高于正常培养的MSC，表明了白花檵木诱导的MSC具有更强的增殖能力。
实施例4白花檵木诱导的间充质干细胞旁分泌能力检测：
对照组(<sub>p</sub>g/ml) 檵木诱导组(<sub>pg</sub>/ml)
EGF 30.6±6.2 38.5±7.3
VEGF 210.8±12.7 289.4±13.5
TNF-α 14.3±5.7 10.1±4.6
IGF-1 689.5±91.6 1343.5±109.3
TNF-β 135.2±10.6 156.7±13.8
HGF 16.5±5.8 20.2±4.2
用ELISA方法分别测定正常培养的间充质干细胞和白花檵木诱导的间充质干细胞无血清培养48小时后的培养上清中的因子含量，具体包括表皮生长因子(EGF)，血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、胰岛素生长因子(IGF)、转化生子因子beta(TGF-β)和肝细胞生长因子(HGF)，可以看出白花檵木诱导后的间充质干细胞因子分泌能力显著增强，炎症因子分泌减少。如上表所示。
实施例5白花檵木诱导的间充质干细胞伤口修复能力检测：
如图3所示，对大鼠皮肤进行伤口切割模型，在第5天的时候给于伤口表面滴注干细胞悬液，左侧滴注正常干细胞组，右侧滴注白花檵木诱导的干细胞组，结果发现，3天以后滴注白花檵木诱导的干细胞明显促进了伤口愈合。
实施例6白花檵木诱导的间充质干细胞抗衰老能力的检测：
采用H2O2(1.6umol/L)诱导损伤间充质干细胞，分别在相同的条件下用采用β半乳糖苷酶检测法测定正常的间充质干细胞和白花檵木诱导的间充质干细胞的染色阳性的细胞百分比。经过染色发现，正常培养的间充质干细胞经过H2O2处理6小时后，衰老干细胞的百分比为48.9±6.2％，白花檵木诱导的干细胞经过H2O2处理6小时后衰老干细胞的百分比为12.3±3.8％，充分证明了白花檵木诱导的间充质干细胞具有更强的抗衰老特性。

Claims (5)

1.一种增强人间充质干细胞生物学特性的诱导处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、不同组织来源的间充质干细胞组织经过不同的处理方法并进行原代细胞培养得到原代细胞，原代细胞培养离心完后的细胞，去掉上清后加入含有血清替代物的干细胞培养基，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；
B、将重悬后的细胞悬液接种到含有血清替代物的干细胞培养基的培养瓶中；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80-90％；
种瓶：(1-10)x104cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入培养基20ml；
按照上述传代方法依次传代，选取P3-P6代次的间充质干细胞为诱导的干细胞来源；所获得的间充质干细胞经过流式细胞仪鉴定纯度；
脐带间充质干细胞的诱导处理方法：
选取P3-P6代次的间充质干细胞，按照(1-10)x104cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入含有1-100ug/ml范围的白花檵木提取物培养基20ml，继续培养48h。
2.按照权利要求1所述的一种增强人间充质干细胞生物学特性的诱导处理方法，其特征在于，间充质干细胞来源包括骨髓、脐带、胎盘、牙髓、脐带血等一切富含间充质干细胞的人体组织。
3.按照权利要求1所述的一种增强人间充质干细胞生物学特性的诱导处理方法，其特征在于，以脐带间充质干细胞的获取方法为例，阐述间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)取足月健康胎儿脐带，检测脐带血清HbsAg、抗-HCV、抗-HDV、抗-HEV、抗-HIV-1/2、HCV-RNA、HIV-1-RNA、CMV-DNA，检测结果均为阴性，可用；
(2)将生理盐水瓶用喷有酒精的纱布擦拭一遍后，去除瓶口处的封口塑料放入处于运行状态的洁净台中；
(3)脐带华通氏胶的剥离并洗涤；
优选:在生理盐水中洗涤去除脐带血渍，然后浸泡酒精消毒，再次用生理盐水洗涤，在装有生理盐水的培养皿中将将脐带剪成2-3cm小段，并用生理盐水洗涤清除脐带小段血管中的淤血和凝块；然后剥离华通氏胶，用生理盐水进行洗涤；
(4)组织块制备
剪切脐带华通氏胶：将步骤(3)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1-4mm的组织匀浆；用生理盐水洗涤组织匀浆，进行离心；
(5)接种
将步骤(4)离心后的组织匀浆去除上清后，接种到接种培养瓶如T150中，并平铺到整个接种培养瓶底面；
(6)脐带华通氏胶的培养
平置步骤(5)接种培养瓶，放置于CO2培养箱中，6-12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有10wt％血清替代物的干细胞培养基，然后缓慢让它浸润整个组织块；
培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％；
(7)换液
第一次换液：步骤(6)脐带华通氏胶培养到第6-7天进行全量换液；将旧的培养基和未贴壁的组织块倒掉，加入等量的含有10％血清替代物的培养基，平置培养瓶，放置到从CO2培养箱中继续培养；
第二次换液：脐带华通氏胶培养到9-10天后，重复第一次换液的操作；
第三次换液：在镜像下观察细胞的生长状况，如果细胞融合度没有达到70-80％，在脐带华通氏胶培养到12-13天后，增加一次全量换液的操作；
(8)收获原代细胞
细胞观察：将所有培养瓶在显微镜下观察，如观察到细胞融合度达到70％-80％时，即可进行消化收获；
原代细胞收获：
配置细胞消化液：按照体积比1:4的比例混合胰酶与生理盐水，混合液即为细胞消化液。
去除旧的培养液：轻轻摇晃培养瓶，使未贴壁组织块脱落，再将组织块和旧的培养液一起倒入废液瓶中；
洗涤：往每个去掉旧培养液的瓶中倒入生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，使生理盐水液体浸润培养瓶底面和组织块，再将生理盐水倒掉，重复洗涤一次；
消化：往洗涤后的每个培养瓶中加入消化液，使每个培养瓶的消化液浸润整个培养瓶底面，静置1min，上下摇晃培养瓶，使消化液充分接触细胞，镜下观察90％的细胞脱落变圆后可停止消化；
终止消化：往可终止消化的培养瓶中每瓶加入间充质干细胞培养基，进行终止消化，前后摇晃培养瓶，进行充分接触稀释，然后转移到50ml离心管中离心；
(9)原代细胞传代(P0传P1)
上一步离心完后的细胞，去掉上清后加入含有血清替代物的干细胞培养基，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；
将重悬后的细胞悬液接种到培养瓶并用含有血清替代物的干细胞培养基定容到一定体积，使细胞达到一定浓度；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80-90％。
种瓶：(1-10)x104cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入培养基20ml；
按照上述传代方法依次传代，选取P3-P6代次的间充质干细胞为诱导的干细胞来源。所获得的间充质干细胞经过流式细胞仪鉴定纯度，符合细胞表型为：CD34/CD45/CD11b/CD19/HLADR(-)，CD90/CD105/CD73(+)；
脐带间充质干细胞的诱导处理方法：
选取P3-P6代次的间充质干细胞，按照(1-10)x104cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入含有1-100ug/ml范围的白花檵木提取物培养基20ml，继续培养48h。
4.按照权利要求1所述的一种增强人间充质干细胞生物学特性的诱导处理方法，其特征在于，所述的白花檵木提取物培养基为在所述的含有血清替代物的干细胞培养基中添加有白花檵木提取物，白花檵木提取物的含量浓度为1-100ug/ml。
5.按照权利要求1所述的一种增强人间充质干细胞生物学特性的诱导处理方法，其特征在于，所述的(1-10)x104cells/cm2，优选50000cells/cm2。
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