CN112114128A - 一种封闭剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种封闭剂及其制备方法，属于免疫检测技术领域，所述封闭剂包括活化后的动物抗体和活化后的灭活标记蛋白，所述活化后的灭活标记蛋白为对标记蛋白进行灭活，后进行活化获得，所述标记蛋白包括碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶中的一种。所述方法包括：采用活化剂A对动物抗体处理，获得活化后的动物抗体；将标记蛋白灭活，获得灭活标记蛋白，后采用活化剂B对所述灭活标记蛋白处理，获得活化后的灭活标记蛋白；将所述活化后的动物抗体和所述活化后的灭活标记蛋白混匀，后纯化，获得所述封闭剂。该新的封闭剂可以用于封闭固相载体上的位点(空白位点和活化位点)以减少标记物与固相载体的非特异性结合，进而提高试剂盒的灵敏度和精密度。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，涉及一种封闭剂及其制备方法。
背景技术
免疫分析法是基于抗原抗体高特异性和高灵敏性反应的一种技术，该技术已经在医学检验、环境监测等方面得到广泛应用。目前市场上常见的免疫分析产品有酶联免疫检测法(ELISA)、荧光免疫分析(FIA)、化学发光免疫分析(CLIA)、放射免疫分析(RIA)等；其基本检测原理为：将一种抗体固定于固相载体上，用于捕获样本中待测物，然后加入样本和标记物(标记物可为ALP/HRP、吖啶酯等标记的另一种抗体(夹心法)或待测物类似物(竞争法))，反应完成后清洗除去反应体系中未结合的物质，最后加入相应底物(AMPPD、CDPStar、鲁米洛等)，底物与标记物反应产生信号，根据信号值和定标曲线计算出样本中待测物浓度。
通常固相载体上的位点(空白位点和活化位点)不会完全被抗体占据，因而会有部分标记物通过非特异性吸附于固相载体，导致异常信号产生，进而干扰测试结果，影响测试的灵敏度、精密度。为提高检测试剂的灵敏度和精密度，需要对包被抗体的固相载体上的位点进行封闭以减少非特异性吸附。目前常用的封闭剂有牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、动物抗体等蛋白溶液，此类封闭剂在进行封闭时，多以非特异性吸附的方式对固相载体空白位点进行封闭，以占据的方式阻止标记物与固相载体的空白位点进行结合。但是这种封闭方式存在两个缺点：①封闭过程由于是非特异性吸附的方式导致结果是随机的，仍然有部分空白位点未被封闭；②吸附的方式导致大量活化的位点未封闭，同样会结合标记物从而影响测试结果。
因此急需开发一种新的封闭剂，以解决检测试剂灵敏度和精密度差的问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种封闭剂及其制备方法，该新的封闭剂可以用于封闭固相载体上的位点(空白位点和活化位点)以减少标记物与固相载体的非特异性结合，进而提高试剂盒的灵敏度和精密度。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明的目的之一在于提供一种封闭剂，所述封闭剂包括活化后的动物抗体和活化后的灭活标记蛋白，所述活化后的灭活标记蛋白为对标记蛋白进行灭活，后进行活化获得，所述标记蛋白包括碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶中的一种。
进一步地，所述活化后的动物抗体和所述活化后的灭活标记蛋白的质量比为1：(0.5～4)。
更进一步地，所述活化后的动物抗体和所述活化后的灭活标记蛋白的质量比为1：(2.5～3.5)。
进一步地，所述动物抗体为纯度＞95％的IgG或IgM抗体；所述动物抗体的来源包括鼠、兔、山羊、牛源中的一种。
本发明的目的之二在于提供所述的封闭剂的制备方法，所述方法包括：
采用活化剂A对动物抗体处理，获得活化后的动物抗体；
将标记蛋白灭活，获得灭活标记蛋白，后采用活化剂B对所述灭活标记蛋白处理，获得活化后的灭活标记蛋白；
将所述活化后的动物抗体和所述活化后的灭活标记蛋白混匀，后纯化，获得所述封闭剂。
进一步地，所述动物抗体与所述活化剂A的质量比为1：(3～10)；所述活化剂A选自2-亚氨基硫烷盐酸盐、(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)二环己基碳二亚胺中的一种。
进一步地，所述灭活标记蛋白与所述活化剂B的质量比为1：(0.8～1.5)；所述活化剂B选自琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯、戊二醛、过碘酸钠中的一种。
进一步地，所述灭活采用的方式包括高温灭活、强酸灭活、强碱灭活。
进一步地，所述将所述活化后的动物抗体和所述活化后的灭活标记蛋白混匀时，加入氯化镁溶液，所述氯化镁溶液的浓度为(0.8～1.5)M。
进一步地，所述纯化采用分子筛进行处理
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明一种封闭剂及其制备方法，用活化后的动物抗体和活化后的灭活标记蛋白的结合物作为新的封闭剂进行封闭，比单独的活化后的动物抗体或者单独的活化后的灭活标记蛋白的效果更好，灵敏度和精密度更高。由于标记蛋白会在免疫反应中参与反应，故先将其灭活；又由于活化后的动物抗体和活化后的灭活标记蛋白要相结合，两者均需要先将表面基团活化才能进行化学结合。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是不同实验组LOB；
图2是采用样本1的不同对比例CV值；
图3是为采用样本2的不同对比例CV值。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
根据本发明的典型实施方式之一，提供一种封闭剂，所述封闭剂包括活化后的动物抗体和活化后的灭活标记蛋白，所述活化后的灭活标记蛋白为对标记蛋白进行灭活，后进行活化获得，所述标记蛋白包括碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶中的一种。
现有技术中，在免疫反应中标记物与抗体容易和固相载体上未结合的位点发生非特异性反应，从而影响试剂灵敏度和精密度。为防止和减少吸附的发生，在固相载体偶联物制备过程中对未结合的位点，结合非特异性反应性发生的原因，发明中用动物血清(抗体，实施例中用Mouse IgG)和标记物(实施例中用ALP)的结合物进行封闭，且两者均需要先将表面基团活化才能进行化学结合。由于ALP会在免疫反应中参与反应，故先将其灭活。将动物血清和标记物结合起来作为封闭剂比单独作用效果更好。
采用ALP与动物抗体结合物原理：①结合物的分子量(体积)比单个的大，在封闭过程中更容易被识别而形成封闭，提高封闭效率；②单个的ALP或者动物抗体不带电，两者活化后结合一起会形成带电的基团，更容易与同样带电的固相载体上空白位点进行物理结合；③ALP和动物抗体是被活化的，也会固相载体上未结合抗体的活化的位点进行结合。结合物比单个的能有效提高封闭效率，对空白位点和活化的位点同时进行封闭。
所述动物抗体为纯度＞95％的IgG或IgM抗体；所述动物抗体的来源包括鼠、兔、山羊、牛源中的一种。本发明实施例中选用Mouse IgG，在其他实施方式中Mouse IgG可更换为Mouse IgM或其他物种(兔(Rabbit)、山羊(Goat)、牛(Bovine))IgG/IgM。
作为优选的实施方式，所述活化后的动物抗体和所述活化后的灭活标记蛋白的质量比为1：(0.5～4)；不同来源的抗体大小会有差异，整体在质量比为1：(0.5～4)的范围内均可以保证两者充分结合。
在具体实施过程中，Mouse IgG(150KD)比ALP(56KD)分子量约大三倍，为了保证两者充分结合，两种物质混合时质量比例控制在1:0.5～1:4之间，具体优选为1：2.5～1:3.5。其中一种物质过多都会造成另外一种物质相对少而容易造成结合不充分导致物料浪费，同时需要耗费更多的时间用分子筛进行纯化。
如果采用其他来源的IgG或者IgM，由于不同来源的抗体大小会有差异，不同来源的抗体，所述优选的质量比需要进一步研究，但整体在质量比为1：(0.5～4)的范围内均可以保证两者充分结合。
根据本发明另一种典型的实施方式，提供一种封闭剂的制备方法，所述方法包括：
S1、采用活化剂A对动物抗体处理，获得活化后的动物抗体；
S2、将标记蛋白灭活，获得灭活标记蛋白，后采用活化剂B对所述灭活标记蛋白处理，获得活化后的灭活标记蛋白；
S3、将所述活化后的动物抗体和所述活化后的灭活标记蛋白混匀，后纯化，获得所述封闭剂。
作为优选的实施方式，所述步骤S1和步骤S2中，所述的动物抗体和所述的灭活标记蛋白在进行活化前，具体地：
步骤S1中，先获得动物抗体溶液，然后采用活化剂A对所述动物抗体溶液处理，获得活化后的动物抗体；
步骤S2中，将标记蛋白灭活，获得灭活标记蛋白，将所述灭活标记蛋白采用溶液溶解后获得灭活标记蛋白溶液，后采用活化剂B对所述灭活标记蛋白溶液进行处理，获得活化后的灭活标记蛋白；
本实施例中采用溶液a溶解所述动物抗体得到动物抗体溶液，采用溶液a溶解灭活标记蛋白得到灭活标记蛋白溶液；
所述溶液a的配方为：10～100mM(优选20～50mM)三羟甲基氨基甲烷(Tris)、50～200mM(优选80-150mM)氯化钠和1～20mM(优选3～10mM)乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)，pH6.5-9.0(优选7.0-8.5)；具体地：
本实施例中灭活ALP溶液：用溶液a溶解灭活ALP至0.2～0.8mg/mL(优选0.4～0.6mg/mL，最优0.5mg/mL)得到；
Mouse IgG抗体溶液：用溶液a溶解Mouse IgG抗体至0.2～0.8mg/mL(优选0.3～0.5mg/mL，最优0.35mg/ml)得到；
所述步骤S1中，活化剂A对动物抗体处理时，采用涡旋混匀，置于37℃摇床中混匀20min(10～40min，优选15～30min)；结束后用分子筛过滤去除溶液中过量活化剂A和动物抗体，得到活化的动物抗体。
所述活化剂A选自2-亚氨基硫烷盐酸盐、(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)二环己基碳二亚胺中的一种。本实施例中活化剂A：用溶液a溶解2-亚氨基硫烷盐酸盐(2IT)至10mg/ml；
所述动物抗体与所述活化剂A的质量比为1：(3～10)；优选1：(5～8)；活化剂A加入比例过高会容易形成MouseIgG-活化剂-MouseIgG的副产物，降低了产量；活化剂A加入比例过低，活化的MouseIgG会较少，会造成浪费的Mouse IgG，也降低了活化效率，影响下一步与ALP的结合。
所述步骤S2中，所述灭活采用的方式包括高温灭活、强酸灭活、强碱灭活；
采用活化剂B对所述灭活标记蛋白处理时，将活化剂B和灭活标记蛋白进行涡旋混匀，置于30～45℃(优选35～40℃，最优37℃)烘箱中孵育15min(10～30min，优选15～20min)；结束后利用分子筛过滤去除溶液中的过量活化剂B和灭活的ALP或HRP，得到活化的灭活ALP或者活化的灭活HRP。
所述活化剂B选自琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯、戊二醛、过碘酸钠中的一种。本实施例中活化剂B：用二甲基甲酰胺(DMF)溶解琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯(SMCC)至5mg/ml；
所述灭活标记蛋白与所述活化剂B的质量比为1：(0.8～1.5)；优选为1：(1～1.2)；活化剂B加入比例过高会容易造成ALP-活化剂-ALP的副产物；活化剂B加入量过少会降低活化效率，有一部分ALP未活化，造成原料浪费的同时影响下一步与活化的Mouse IgG结合。
所述步骤S3中，所述将所述活化后的动物抗体和所述活化后的灭活标记蛋白混匀时，加入二价金属盐溶液作为反应催化剂。所述二价金属盐溶液包括氯化镁、氯化钙、氯化铜、氯化锌溶液中的一种；其中，所述氯化镁溶液的浓度为(0.8～1.5)M。所述作为催化剂的氯化镁溶液的加入量没有要求，适量即可。
作为优选的实施方式，所述纯化采用分子筛进行处理。
下面将结合实施例、对照例及实验数据对本申请一种封闭剂及其制备方法进行详细说明。
实施例1
1)取1.0ml Mouse IgG，加入0.25mL的活化剂A，涡旋混匀，置于37℃摇床中混匀20min；结束后用分子筛过滤去除溶液中过量活化剂A和Mouse IgG抗体，得到活化的MouseIgG抗体。
2)取灭活ALP溶液1.0mL，加入0.10mL的活化剂B涡旋混匀，置于37℃烘箱中孵育15min；结束后利用分子筛过滤去除溶液中的过量活化剂B和灭活的ALP，得到活化的灭活ALP。
3)将以上步骤中活化的Mouse IgG抗体和活化的灭活ALP按质量比1:2.5混合，加入6μl的1M氯化镁(MgCl2)溶液，涡旋混匀，置于4℃(2-8℃)冰箱，反应18-24小时，结束后用分子筛纯化得到新封闭剂1。
本实施例的hs-cTnI试剂盒包括试剂组分1、新封闭剂1、试剂组分2；在所述试剂组分1中加入所述新封闭剂1。
所述试剂组分1的配方为：三羟甲基氨基甲烷(TRIS)：50mmol/L；cTnI抗体包被磁珠微粒：0.1mg/ml；表面活性剂Thesit：3mg/mL；海藻糖：1mg/ml；Proclin300：2mg/ml，pH:7.4。
所述试剂组分2的配方为：2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)：50mmol/L；cTnI抗体-ALP标记物：1μg/ml；胆酸钠：2mg/mL。
实施例2
1)取1.0ml Mouse IgG，加入0.25mL的活化剂A，涡旋混匀，置于37℃摇床中混匀20min；结束后用分子筛过滤去除溶液中过量活化剂A和Mouse IgG抗体，得到活化的MouseIgG抗体。
2)取灭活ALP溶液1.0mL，加入0.10mL的活化剂B涡旋混匀，置于37℃烘箱中孵育15min；结束后利用分子筛过滤去除溶液中的过量活化剂B和灭活的ALP，得到活化的灭活ALP。
3)将以上步骤中活化的Mouse IgG抗体和活化的灭活ALP按质量比1:1混合，加入6μl的1M氯化镁(MgCl2)溶液，涡旋混匀，置于4℃(2-8℃)冰箱，反应18-24小时，结束后用分子筛纯化得到新封闭剂2。
本实施例的hs-cTnI试剂盒包括试剂组分1、新封闭剂2、试剂组分2；在所述试剂组分1中加入所述新封闭剂2。试剂组分1和试剂组分2同实施例1。
实施例3
1)取1.0ml Mouse IgG，加入0.25mL的活化剂A，涡旋混匀，置于37℃摇床中混匀20min；结束后用分子筛过滤去除溶液中过量活化剂A和Mouse IgG抗体，得到活化的MouseIgG抗体。
2)取灭活ALP溶液1.0mL，加入0.10mL的活化剂B涡旋混匀，置于37℃烘箱中孵育15min；结束后利用分子筛过滤去除溶液中的过量活化剂B和灭活的ALP，得到活化的灭活ALP。
3)将以上步骤中活化的Mouse IgG抗体和活化的灭活ALP按质量比1:3.5混合，加入6μl的1M氯化镁(MgCl2)溶液，涡旋混匀，置于4℃(2-8℃)冰箱，反应18-24小时，结束后用分子筛纯化得到新封闭剂3。
本实施例的hs-cTnI试剂盒包括试剂组分1、新封闭剂3、试剂组分2；在所述试剂组分1中加入所述新封闭剂3。试剂组分1和试剂组分2同实施例1。
实施例4
1)取1.0ml Mouse IgG，加入0.25mL的活化剂A，涡旋混匀，置于37℃摇床中混匀20min；结束后用分子筛过滤去除溶液中过量活化剂A和Mouse IgG抗体，得到活化的MouseIgG抗体。
2)取灭活ALP溶液1.0mL，加入0.10mL的活化剂B涡旋混匀，置于37℃烘箱中孵育15min；结束后利用分子筛过滤去除溶液中的过量活化剂B和灭活的ALP，得到活化的灭活ALP。
3)将以上步骤中活化的Mouse IgG抗体和活化的灭活ALP按质量比1:4混合，加入6μl的1M氯化镁(MgCl2)溶液，涡旋混匀，置于4℃(2-8℃)冰箱，反应18-24小时，结束后用分子筛纯化得到新封闭剂4。
本实施例的hs-cTnI试剂盒包括试剂组分1、新封闭剂4、试剂组分2；在所述试剂组分1中加入所述新封闭剂4。试剂组分1和试剂组分2同实施例1。
对比例1
本对比例为不封闭组，本实施例的hs-cTnI试剂盒包括试剂组分1、试剂组分2。
对比例2
本对比例的封闭剂为BSA，本实施例的hs-cTnI试剂盒包括试剂组分1、试剂组分2和BSA；hs-cTnI试剂组分1基础上加入BSA，浓度为3mg/ml。
对比例3
本对比例的封闭剂为酪蛋白，本实施例的hs-cTnI试剂盒包括试剂组分1、试剂组分2和酪蛋白；hs-cTnI试剂组分1基础上加入酪蛋白，浓度为3mg/ml。
对比例4
本对比例的封闭剂为Mouse IgG，本实施例的hs-cTnI试剂盒包括试剂组分1、试剂组分2和Mouse IgG；hs-cTnI试剂组分1基础上加入Mouse IgG，浓度为0.5mg/ml。
对比例5
本对比例的封闭剂为失活ALP，本实施例的hs-cTnI试剂盒包括试剂组分1、试剂组分2和失活ALP；hs-cTnI试剂组分1基础上加入失活ALP，浓度为0.5mg/ml。
试验例1各组别的空白限(LOB)验证
将实施例1-4以及对比例1-5的hs-cTnI试剂盒，分别装载于生之源化学发光免疫分析仪，按空白限(LOB)方法进行相应测试。
1、LOB验证方式参考中华人民共和国国家卫生健康委员会发布的《WS/T 514-2017临床检验方法检出能力的确立和验证》文件中经典评价方法进行：
每实验组各配制2批试剂，装载于同一台化学发光免疫分析仪上，连续测试3天，每天分别测试5个空白样本(不含待测物样本)，每个样本重复测试4次(分别在不同的天和不同批试剂)，每批试剂至少有60个空白样本检测结果。
LOB计算方式：1)将实验组各批次试剂检测空白样本得到的结果分别按从小到大进行排序；2)计算空白样本结果95百分位数对应位置S，S＝0.5+95％xN(N为空白样本结果数量)；4)根据S值得出LOB(空白限),若S值是整数则LOB为S位对应的空白样本结果，若S值位非整数，则LOB为S值前后整数位对应空白样本结果均值；5)2批试剂中取LOB最大值作为该实验组最终LOB；LOB值越小则试剂灵敏度越高。
2、LOB验证结果
不同实验组试剂LOB测试结果如下：
表1-对比例1的hs-cTnI试剂盒空白限验证数据(单位：ng/ml)
表2-对比例2的hs-cTnI试剂盒空白限验证数据(单位：ng/ml)
表3-对比例3的hs-cTnI试剂盒空白限验证数据(单位：ng/ml)
表4-对比例4的hs-cTnI试剂盒空白限验证数据(单位：ng/ml)
表5-对比例5的hs-cTnI试剂盒空白限验证数据(单位：ng/ml)
表6-实施例1的hs-cTnI试剂盒空白限验证数据(单位：ng/ml)
表7-实施例2的hs-cTnI试剂盒空白限验证数据(单位：ng/ml)
表8-实施例3的hs-cTnI试剂盒空白限验证数据(单位：ng/ml)
表9-实施例4的hs-cTnI试剂盒空白限验证数据(单位：ng/ml)
测得上述数据后，按LOB计算方式对数据进行整理分析，得出各实验组试剂LOB值，结果如下：
表10-各实验组LOB计算结果(单位：ng/ml)
由表10的数据可知：
实验结果显示加入新封闭剂的实施例1-4的LOB值显著小于对比例1-5的LOB值，说明新封闭剂的加入可以提高hs-TnI试剂盒灵敏度。
实施例1的和实施例3的LOB值比实施例2的和实施例4的LOB更低，说明封闭剂在制备时，Mouse IgG和灭活的ALP的比例会影响试剂的灵敏度，两者比例在一定范围内，能达到最优的效果。
实验例2精密度验证
1、试剂精密度验证方式参考中华人民共和国国家卫生健康委员会发布的《WS/T514-2017临床检验方法检出能力的确立和验证》文件中精密度验证方案进行：每批试剂测试2个浓度水平样本，每个浓度重复测试3次，连续测试5天，每个浓度水平样本得到15个测试结果；计算结果变异系数(CV)，CV越小则试剂精密度越好。
2、精密度验证结果
各实验组中两批试剂随机挑选一批进行试剂精密度验证，具体实验结果如下：
表11-对比例1精密度测试结果(单位：ng/ml)
表12-对比例2精密度测试结果(单位：ng/ml)
表13-对比例3精密度测试结果(单位：ng/ml)
表14-对比例4精密度测试结果(单位：ng/ml)
表15-对比例5精密度测试结果(单位：ng/ml)
表16-实施例1的精密度测试结果(单位：ng/ml)
表17-实施例2的精密度测试结果(单位：ng/ml)
表18-实施例3的精密度测试结果(单位：ng/ml)
表19-实施例4精密度测试结果(单位：ng/ml)
表20-各实验组精密度汇总
| 浓度1样本 | 浓度2样本 | |
| 对比例1 | 36.82％ | 16.98％ |
| 对比例2 | 16.99％ | 8.68％ |
| 对比例3 | 24.62％ | 10.78％ |
| 对比例4 | 18.15％ | 8.14％ |
| 对比例5 | 15.65％ | 7.72％ |
| 实施例1的 | 8.88％ | 4.00％ |
| 实施例2的 | 10.13％ | 6.40％ |
| 实施例3的 | 8.74％ | 3.70％ |
| 实施例4 | 11.02％ | 6.52％ |
由表20可知，加入新封闭剂的实施例1-4测试样本的CV显著小于对比例1-5，说明新封闭剂的加入可以提高hs-TnI试剂盒灵敏度。实施例1和实施例3的测试CV比实施例2和实施例4更低，说明封闭剂在制备时，Mouse IgG和灭活的ALP的比例会影响试剂的灵敏度，两者比例在一定范围内，能达到最优的效果。
综上可知，hs-cTnI试剂盒中添加本发明的新封闭剂后较其他封闭蛋白能显著提高试剂盒的灵敏度与精密度，说明新封闭剂有效且封闭效果优于其他封闭蛋白；本发明用活化后的动物抗体和活化后的灭活标记蛋白的结合物作为新的封闭剂进行封闭，比单独的活化后的动物抗体或者单独的活化后的灭活标记蛋白的效果更好，灵敏度和精密度更高。本发明为提高试剂盒的灵敏度与精密度提供了一种新方案。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种封闭剂，其特征在于，所述封闭剂包括活化后的动物抗体和活化后的灭活标记蛋白，所述活化后的灭活标记蛋白为对标记蛋白进行灭活，后进行活化获得，所述标记蛋白包括碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶中的一种。
2.根据权利要求1所述的一种封闭剂，其特征在于，所述活化后的动物抗体和所述活化后的灭活标记蛋白的质量比为1：(0.5～4)。
3.根据权利要求1所述的一种封闭剂，其特征在于，所述动物抗体为纯度＞95％的IgG或IgM抗体；所述动物抗体的来源包括鼠、兔、山羊、牛源中的一种。
4.一种权利要求1-3任一所述的封闭剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
采用活化剂A对动物抗体处理，获得活化后的动物抗体；
将标记蛋白灭活，获得灭活标记蛋白，后采用活化剂B对所述灭活标记蛋白处理，获得活化后的灭活标记蛋白；
将所述活化后的动物抗体和所述活化后的灭活标记蛋白混匀，后纯化，获得所述封闭剂。
5.根据权利要求4所述的一种封闭剂的制备方法，其特征在于，所述动物抗体与所述活化剂A的质量比为1：(3～10)；所述活化剂A选自2-亚氨基硫烷盐酸盐、(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)二环己基碳二亚胺中的一种。
6.根据权利要求4所述的一种封闭剂的制备方法，其特征在于，所述灭活标记蛋白与所述活化剂B的质量比为1：(0.8～1.5)；所述活化剂B选自琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯、戊二醛、过碘酸钠中的一种。
7.根据权利要求4所述的一种封闭剂的制备方法，其特征在于，所述灭活采用的方式包括高温灭活、强酸灭活、强碱灭活。
8.根据权利要求4所述的一种封闭剂的制备方法，其特征在于，所述将所述活化后的动物抗体和所述活化后的灭活标记蛋白混匀时，加入二价金属盐溶液作为反应催化剂。
9.根据权利要求8所述的一种封闭剂的制备方法，其特征在于，所述二价金属盐溶液包括氯化镁、氯化钙、氯化铜、氯化锌溶液中的一种；其中，所述氯化镁溶液的浓度为(0.8～1.5)M。
10.根据权利要求4所述的一种封闭剂的制备方法，其特征在于，所述纯化采用分子筛进行处理。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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Denomination of invention: A sealing agent and its preparation method Granted publication date: 20230829 Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: WUHAN LIFE ORIGIN BIOTECH JOINT STOCK Co.,Ltd. Registration number: Y2024980009814 |
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